Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Dieses Experiment zielt auf eine direkte Messung der acetatbildenden Aktivität der Acetatkinase ab. Die Reaktion wird eingeleitet, indem ein Enzym zu einem Reaktionsgemisch hinzugefügt wird, das das Acetylphosphat und ein DP-Substrat enthält. Fügen Sie dann Hydroxylaminhydrochlorid hinzu, um das verbleibende Acetylphosphat in Acetylhydroxylat umzuwandeln.

Fügen Sie eine Entwicklungslösung hinzu, um das Acetylhydroxylat in einen farbigen Eisenhydroxylatkomplex umzuwandeln, der gemessen werden kann. Spektrophotometrisch basierend auf der Menge des in der Reaktion verbrauchten Acetylphosphatsubstrats ermöglichen die Ergebnisse die Bestimmung der kinetischen Parameter des Enzyms. Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie auf der direkten Messung des Acetylphosphatverbrauchs beruht und nicht auf der Entkopplung einer TP-Produktion an die Reduktion einer A-DP. Da dieser Assay nicht auf eine TP-Produktion angewiesen ist, kann er für eine neue Gruppe von Acetatkinasen verwendet werden, die Leistungsphosphat anstelle eines TP produzieren. Für eine Standardkurve von sechs bis acht Punkten verdünnen Sie die Acetylphosphat-Stammlösung in 100 Millimolar Triss auf ein endgültiges Probenvolumen von 300 Mikrolitern. Schließen Sie auch eine Kontrollprobe ohne Acetylphosphat an. Äquilibrieren Sie alle Proben in einem 37 Grad Celsius heißen Block für Eine Minute.

Fügen Sie nun 50 Mikroliter zwei molare Hydroxylaminhydrochloride hinzu, mischen Sie durch dreimaliges Schütteln und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem 60 Grad Celsius heißen Block. Dann 100 Mikroliter Entwicklungslösungsmischung durch dreimaliges Schütteln zugeben und die Farbe mindestens eine Minute lang bei Raumtemperatur entstehen lassen. Zentrifugieren Sie die Proben mit Kunststoffküvetten für das Spektralphotometer.

Messen Sie die Proben bei 540 Nanometern. Fahren Sie fort, um eine Standardkurve der Absorption bei 540 Nanometern im Vergleich zu Mikromol Acetylphosphat mit geeigneter Datenanalyse- und Grafiksoftware zu erstellen. Berechnen Sie den r-Quadrat-Wert.

300 Mikroliter Aliquots des Reaktionsgemisches werden auf Mikrozentrifugenröhrchen verteilt. Denken Sie daran, eine Kontrollreaktion ohne Enzymausgleichsröhrchen für eine Minute bei 37 Grad Celsius einzuschließen. Wenn mehrere Reaktionen durchgeführt werden, fügen Sie den Röhrchen in bestimmten Zeitabständen Enzym hinzu und stellen Sie jedes Röhrchen sofort wieder in den 37 Grad Celsius heißen Block.

Nach fünf Minuten 50 Mikroliter zwei molare Hydroxylaminhydrochlorid hinzufügen, mischen und fünf Minuten bei 60 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Entwicklungslösung hinzu, mischen Sie sie und stellen Sie sie für die Farbentwicklung auf Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie dann die Proben eine Minute lang bei 18.000 mal G.

Fahren Sie mit der Messung der Absorption bei 540 Nanometern fort. Bestimmen Sie die Menge an vorhandenem Acetylphosphat im Vergleich zur Acetylphosphat-Standardkurve. Die Daten können grafisch dargestellt und an die McKayla-Zementin-Gleichung angepasst werden, um kinetische Parameter zu bestimmen.

Dieser Assay bestimmt den Verbrauch des Acetylphosphatsubstrats zur Messung der Acetatkinaseaktivität in Richtung der Acetatbildung. Acetylphosphat, das nach einer bestimmten Zeit während der enzymatischen Reaktion verbleibt, wird in Acetyloxybat und anschließend in einen Eisenhydroxyat-Komplex umgewandelt, der eine rötliche Farbe hat, die bei 540 Nanometern gemessen werden kann. Diese typische Standardkurve, die die Absorption bei 540 Nanometern im Vergleich zu Mikromol Acetylphosphat darstellt, hat eine Steigung von 1,2332 Absorptionseinheiten pro Mikromol Acetylphosphat.

Der resultierende r-Quadrat-Wert von 0,99 gibt an, dass die Daten gut mit der linearen Gleichung übereinstimmen, wie hier dargestellt. Dieser Assay kann zur Bestimmung des KM für Acetylphosphat für verschiedene Enzympräparate verwendet werden. Bei fünf Millimolaren folgt eine DP mit unterschiedlichen Konzentrationen von Acetylphosphat gereinigter rekombinanter Acetatkinase aus Methanol Sarina thermophil der standardmäßigen McKayla-Zementin-ähnlichen Kinetik für jedes Substrat, was zu einem scheinbaren KM von 0,27 plus oder minus 0,01 millimolares Acetylphosphat führt.

Im Gegensatz zum standardmäßigen gekoppelten Assay kann dieser direkte Assay die Aktivität von Acetatkinasen messen, die andere Substrate als ein TP verwenden. Beispielsweise wurde bei der Verwertung von Acetylphosphat durch die Pyrophosphat produzierende Inba histolytica Acetatkinase Natriumphosphat für ein DP in der Reaktionsmischung substituiert. Die resultierende Kurve zeigt einen scheinbaren KM-Wert von 0,50 plus oder minus 0,006 millimolares Acetylphosphat. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die Aktivität der Acetatkinase direkt messen können, indem Sie die Menge an verbrauchtem Acetylphosphat bestimmen.

Ein Schlüsselfaktor für das Erzielen reproduzierbarer Ergebnisse ist die Konsistenz in jedem Schritt, insbesondere bei der Zugabe von Enzymen und im Mischschritt.