Pull-down von Calmodulin-bindende Proteine

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteine zu testen, die in kalziumabhängiger Weise an Cal Modlin binden. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteine von Interesse gesammelt werden. Als nächstes werden die Calmodulin-Sero-Geschwindigkeiten für die Proteinbindung vorbereitet.

Dann werden die Proteine mit Calmodulin-Sero-Geschwindigkeiten inkubiert. Schließlich werden die Proteine angedeutet, die in einer kalziumabhängigen Weise binden. Letztendlich können durch westliche Blutanalysen Ergebnisse erzielt werden, die Proteine zeigen, die entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Kalzium an Calmodulin binden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. der ruhigen Chromatographie und der Immunpräzipitation, besteht darin, dass sie weniger Protein und weniger Zeit benötigt. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Modlin-Signalgebung von Kühen zu beantworten, z. B. welche Proteine kalziumabhängig an Modlin von Kühen binden und wie posttranslationale Modifikationen ihre Bindung an Modlin bei Kühen beeinflussen können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Handhabung der Beads unerlässlich sind und die Beschreibung der Wiederbelebung und Retention der Kügelchen schwer zu befolgen ist, ohne sie zu sehen.

Zur Vorbereitung des Gewebes für die homogene Injektion von organotypischen Hippocampus-Schnitten mit einem Virus, das ein Plasmid enthält, das das interessierende rekombinante Protein exprimiert. In diesem Beispiel ist das rekombinante Protein GFP-markiertes Neuro Grandin. Lassen Sie das Gewebe das Protein über Nacht exprimieren, etwa 12 bis 18 Stunden nach der Virusinjektion, geben Sie einen Milliliter Dissektionspuffer in eine Petrischale.

Übertragen Sie das kultivierte Gewebe mit Einsatz in die Petrischale und geben Sie zwei Milliliter Dissektionspuffer in den Einsatz, um das Gewebe mit einem Skalpell einzutauchen. Sammeln Sie fünf bis 10 organotypische Hippocampus-Gewebeschnitte, indem Sie das Gewebe vorsichtig mit einer umgekehrten Weidepipette von der Einlegemembran abkratzen. Übertragen Sie das suspendierte Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 1500 RCF. Um das Gewebe vom Dissektionspuffer zu trennen, wird der Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernt. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Für jede verwendete Scheibe geben Sie das Gewebe mit einer Ein-Milliliter-Pipette mit einer Schnittspitze in 30 bis 60 Mikroliter Homogenisierungspuffer und homogenisieren Sie es dann gründlich mit einem Stößel, bevor Sie das Homogenat wieder in sein ursprüngliches Röhrchen geben. Um zelluläre Trümmer zu entfernen, zentrifugieren Sie das verbleibende Homogenat 10 Minuten lang bei 1100 RCF und sammeln Sie die Snat vorsichtig durch Aspiration, ohne eine Kontamination durch das Pellet zu vermeiden. Aliquotieren Sie 10 % des Überstands als Stichprobe der Eingabe.

Lagern Sie den restlichen Überstand auf Eis, während Sie die Cal Sero Kügelchen für die Verwendung vorbereiten. Später werden für jede heruntergezogene Pipette 400 Mikroliter suspendiertes Cal Modlin Sero in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit relativ flachem Boden geleitet, um die Oberfläche und die Wechselwirkung der Lösungen mit den Kügelchen während der Inkubationen zu maximieren, drehen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf die Seite, um die Kügelchen zu benetzen, und zentrifugieren Sie dann die Kügelchen bei 21. 000. RCF für 30 Sekunden.

Und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration. Achten Sie darauf, die Kügelchen nicht zu stören, um die Kügelchen bei 100 Mikrolitern des jeweiligen Homogenisierungspuffers zu waschen, der entweder zwei millimolare Calciumchloride enthält, bis hin zu Kügelchen, die zum Abziehen von Calcium-Cal-Modlin-Bindungsproteinen verwendet werden. Oder zwei millimolare E-D-T-A-A-bekannte Kalziumchelatoren zu Kügelchen, die verwendet werden, um apo cal Modlin bindende Proteine herunterzuziehen.

Klopfen Sie den Schlauch vorsichtig auf Resus. Hängen Sie die Kügelchen auf und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 1500 RCF. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Aspiration und achten Sie darauf, die Kügelchen nicht zu stören, um Proteine an Calmodulin-Spheros zu binden, um sie nach unten zu ziehen.

Beginnen Sie damit, den SNAT in zwei gleiche Volumina aufzuteilen. Abhängig von der Bedingung pro Aliquot wird die entsprechende Menge Calciumchlorid oder EDTA bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolaren zum Supernat gegeben. Den Überstand zu den gewaschenen Kügelchen in den entsprechenden Homogenisierungspuffer geben.

Klopfen Sie zum Mischen vorsichtig auf das Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Wir hängen die Perlen etwa alle 30 Minuten auf, um die Effizienz der Bindung zu erhöhen.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben drei Minuten lang bei 1500 RC F. 50 Mikroliter Überstand als Probe des ungebundenen Proteins entnehmen und die verbleibende Schlinge vorsichtig durch Aspiration entfernen und verwerfen. Waschen Sie die Kügelchen wie bisher dreimal mit 100 Mikrolitern des entsprechenden Homogenisierungspuffers.

Der schwierigste Schritt in diesem Verfahren ist die effiziente Identifizierung von Zielproteinen. Der beste Weg, um den Erfolg sicherzustellen, besteht darin, die richtige Art von Röhrchen zu verwenden, um den Bead-Verlust zu minimieren und die Beads in der Elutionspuffererwärmung angemessen zu resuspendieren. Auch der Elutionspuffer im Vorfeld kann maßgeblich dabei helfen, das Protein bei 50 Mikrolitern Elucian-Puffer an die Kügelchen zu eluieren.

Proben, die homogenisiert und in einem kalziumhaltigen Puffer gebunden wurden, werden mit einem EDTA-haltigen Puffer angedeutet, und Proben, die einen EDTA-haltigen Puffer aufwiesen, werden mit Kalzium angedeutet. Inkubieren Sie die Kügelchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Mischen Sie die Kügelchen, indem Sie etwa alle fünf Minuten vorsichtig auf die Tube klopfen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen drei Minuten lang bei 1500 RCF und entfernen Sie vorsichtig die 50 Mikroliter SNAT für die gebundene Proteinprobe durch Aspiration. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören. Führen Sie SDS-Seite und Western Blot durch, um das Protein von Interesse als Positivkontrolle in der entgegengesetzten Bedingung zu identifizieren.

Prop Pro-Protein, von dem bekannt ist, dass es Cal Modlin bindet. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für einen Cal Modlin Pulldown-Assay, der die Bindung von GFP TAG Neuro Grandin an Cal MODLIN im Vergleich zu endogener Neuro Grandin testet. Der homogene Input zeigt, dass GFP neuro Grandin zusätzlich zu endogenes Neuro-Grandin und Calcium-Calmodulin-abhängiger Kinase zwei exprimiert wurde, wie es aufgrund der bekannten Bindung von endogenes neuro Grandin erwartet wurde.

Das GFP-markierte Neuro Grandin wurde in Abwesenheit von Calcium angedeutet und bindete in Gegenwart von Calcium nicht. Im Gegensatz dazu wurde die Kontroll-Calciumcalmodulin-abhängige Kinase zwei nur in Gegenwart von Calcium angedeutet und war in Abwesenheit von Calcium ungebunden. Dies zeigt, dass die Calmodulin-Kügelchen ordnungsgemäß funktionierten und die EAWU effizient war.

Am wichtigsten ist, dass dies zeigt, dass GFP Neurogrin auf ähnliche Weise wie die endogene Form an Apoch Cal Modlin bindet, was darauf hindeutet, dass der GFP-Tag die Funktion eines rekombinanten Proteins nicht verändert hat. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann die SDS-Seite und die westliche Blutanalyse in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben und Röhrchen für den entsprechenden Zustand zu beschriften, da jede Änderung der Kalziumkonzentration das gesamte Experiment beeinträchtigen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fähigkeit bestimmter Proteine, ein CAL-Modul kalziumabhängig zu binden, effizient bestimmen können.

Indem man die interessierenden Proteine sammelt, sie mit den entsprechend präparierten co-modulanten SRO-Geschwindigkeiten inkubiert, den gebundenen Proteinen ausweicht und sie mit Hilfe der westlichen Blutanalyse testet.