Pull-down von Calmodulin-bindende Proteine

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteine zu testen, die auf calciumabhängige Weise an Calmodulin binden. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Proteine gewonnen werden. Anschließend werden Calmodulin-Serobeads für die Proteinbindung vorbereitet.

Anschließend werden die Proteine mit Calmodulin-Sero-Schnelltests inkubiert. Schließlich werden die Proteine, die auf calciumabhängige Weise binden, nachgewiesen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, welche Proteine an Calmodulin in Gegenwart oder Abwesenheit von Calcium binden, mittels Western-Blot-Analyse.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen etablierten Methoden, wie beispielsweise sanfter Chromatographie und Immunpräzipitation, liegt darin, dass sie weniger Protein und weniger Zeit erfordert. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Kuh-Modlin-Signalgebung beantworten, beispielsweise, welche Proteine auf calciumabhängige Weise an Kuh-Modlin binden und wie posttranslationale Modifikationen diese Bindung beeinflussen können. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung der Kügelchen wesentlich ist und die Beschreibung des Aufwiedernehmens und Zurückhaltens der Kügelchen ohne visuelle Unterstützung nur schwer nachvollziehbar ist.

Um das Gewebe für homogene Injektions-Organotypische Hippocampus-Schnitte vorzubereiten, verwenden Sie ein Virus, das ein Plasmid enthält, das das rekombinante Protein der gewünschten Art exprimiert. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem rekombinanten Protein um GFP-markiertes Neuro Grandin. Lassen Sie das Gewebe das Protein über Nacht exprimieren, etwa 12 bis 18 Stunden nach der Virusinjektion, und geben Sie dann ein Milliliter Dissektionspuffer in eine Petrischale.

Überführen Sie das kultivierte Gewebe mit dem Insert in die Petrischale und geben Sie mithilfe eines Skalpells zwei Milliliter Dissektionspuffer auf das Insert, um das Gewebe zu überdecken. Sammeln Sie fünf bis 10 organspezifische hippocampale Gewebeschnitte, indem Sie das Gewebe vorsichtig mit einer umgedrehten Pasteurpipette von der Insert-Membran ablösen. Überführen Sie das suspendierte Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Anschließend die Proben bei 1500 RCF eine Minute lang zentrifugieren. Um das Gewebe vom Dissektionspuffer zu trennen, vorsichtig den Überstand durch Aspiration entfernen. Dabei darauf achten, den Pellet nicht aufzuwirbeln.

Fügen Sie für jeden verwendeten Schnitt das Gewebe mit einer 1-Milliliter-Pipette mit abgeschnittenem Pipettenspitze zu 30 bis 60 Mikrolitern Homogenisierungspuffer hinzu und homogenisieren Sie es anschließend gründlich mit einem Stößel, bevor Sie das Homogenat in das ursprüngliche Röhrchen zurückbringen. Um zelluläre Trümmer zu entfernen, zentrifugieren Sie das verbleibende Homogenat 10 Minuten bei 1100 RCF und sammeln Sie vorsichtig den Überstand per Aspiration, wobei Sie eine Kontamination durch das Pellet vermeiden. Aliquotieren Sie 10 % des Überstandes als Probe der Eingabe.

Bewahren Sie das verbleibende Überstand auf Eis auf, während die Cal-Sero-Beads vorbereitet werden. Geben Sie später für jeden Pull-down jeweils 400 µL der suspendierten Cal-Modlin-Sero-Speeds in eine 2-mL-Mikrozentrifugenprobe mit relativ flachem Boden, um die Oberfläche und die Wechselwirkung der Lösungen mit den Beads während der Inkubation zu maximieren. Drehen Sie die Mikrozentrifugenprobe seitlich, um die Beads zu benetzen, und zentrifugieren Sie anschließend die Beads bei 21.000 ×g für 30 Sekunden.

Und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration. Achten Sie darauf, die Kügelchen nicht aufzuwirbeln, um die Kügelchen mit 100 Mikroliter des jeweiligen Homogenisierungspuffers zu waschen, der entweder zwei Millimolar Calciumchlorid für die Kügelchen enthält, die verwendet werden, um Calcium-Calmodulin-bindende Proteine anzureichern, oder zwei Millimolar EDTA, einen bekannten Calciumchelator, für die Kügelchen, die verwendet werden, um Apo-Calmodulin-bindende Proteine anzureichern.

Tippen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um die Suspension wiederherzustellen. Suspendieren Sie die Perlen und zentrifugieren Sie sie eine Minute bei 1500 RCF. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, wobei darauf zu achten ist, die Perlen nicht aufzuwirbeln, um Proteine an Calmodulin-Sphäros zur Pull-down-Isolierung zu binden.

Beginnen Sie damit, das SNAT in zwei gleiche Volumina aufzuteilen. Geben Sie je nach Bedingung pro Aliquot die entsprechende Menge Calciumchlorid oder EDTA zum Überstand, um eine Endkonzentration von zwei Millimolar zu erreichen. Fügen Sie den Überstand zu den gewaschenen Perlen im geeigneten Homogenisierungspuffer hinzu.

Klopfen Sie vorsichtig auf das Gefäß, um es zu mischen. Inkubieren Sie die Proben drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler. Wir suspendieren die Kügelchen etwa alle 30 Minuten, um die Bindungseffizienz zu erhöhen.

Zentrifugieren Sie die Proben anschließend dreimal bei 1500 RC F für drei Minuten. Entfernen Sie 50 Mikroliter Überstand als Probe des ungebundenen Proteins und saugen Sie vorsichtig den restlichen Überstand ab, um ihn zu verwerfen. Waschen Sie die Perlen dreimal wie zuvor mit jeweils 100 Mikrolitern des geeigneten Homogenisierungspuffers.

Der schwierigste Schritt bei diesem Verfahren ist die Elution der Zielproteine auf eine effiziente Weise. Der beste Weg, um Erfolg sicherzustellen, besteht darin, die richtige Art von Röhrchen zu verwenden, um den Verlust der Kügelchen zu minimieren, und die Kügelchen angemessen im vorgewärmten Elutionspuffer erneut aufzuschwemmen. Das Vorwärmen des Elutionspuffers kann ebenfalls erheblich helfen. Um das Protein zu eluieren, werden 50 µL Elutionspuffer zu den Kügelchen gegeben.

Proben, die in Puffer mit Calcium homogenisiert und gebunden wurden, werden in Puffer mit EDTA überführt, und Proben, die zuvor in Puffer mit EDTA enthalten waren, werden mit Calcium versetzt. Inkubieren Sie die Perlen 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Mischen Sie die Perlen, indem Sie alle etwa fünf Minuten vorsichtig auf das Gefäß klopfen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 1500 RCF für drei Minuten und entfernen Sie vorsichtig 50 Mikroliter des SNAT für die gebundene Proteinprobe durch Absaugen. Achten Sie darauf, die Kügelchen nicht zu stören. Führen Sie eine SDS-Gelelektrophorese und eine Western-Blot-Analyse durch, um das Protein von Interesse als positiven Kontrollwert unter der jeweils anderen Bedingung nachzuweisen.

Prop-Protein, das bekanntermaßen an Calmodulin bindet. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel eines Calmodulin-Pull-down-Assays, mit dem die Bindung von GFP-markiertem Neurogranin an Calmodulin im Vergleich zu endogenem Neurogranin getestet wurde. Die homogene Input-Probe zeigt, dass, wie erwartet aufgrund der bekannten Bindung des endogenen Neurogranins, GFP-Neurogranin zusätzlich zu endogenem Neurogranin und der calcium- und calmodulinabhängigen Kinasen zwei exprimiert wurde.

Das mit GFP markierte Neuro Grandin wurde in Abwesenheit von Calcium eluiert und band nicht in Gegenwart von Calcium. Im Gegensatz dazu wurde die Kontrollproteinkinase Kalzium-Calmodulin-abhängige Kinase 2 nur in Gegenwart von Calcium eluiert und war in Abwesenheit ungebunden. Dies zeigt, dass die Calmodulin-Kügelchen ordnungsgemäß funktionierten und die EEU effizient waren.

Am wichtigsten ist, dass dies zeigt, wie sich GFP-Neurogrin an Apoch-Calmodulin in ähnlicher Weise wie die endogene Form bindet, was darauf hindeutet, dass der GFP-Tag die Funktion des rekombinanten Proteins nicht verändert hat. Hat man diese Technik einmal beherrscht, kann sie – ohne SDS-Page und Western-Blot-Analyse – bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Proben und Röhrchen entsprechend der jeweiligen Bedingung zu beschriften, da jede Änderung der Kalziumkonzentration das gesamte Experiment beeinträchtigen kann. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man effizient die Fähigkeit bestimmter Proteine, auf kalziumabhängige Weise an ein CAL-Modul zu binden, untersuchen kann.

Durch Sammeln der interessierenden Proteine, Inkubation mit den entsprechend vorbereiteten Co-Modulans SROs, Eluierung der gebundenen Proteine und Untersuchung mittels Western-Blot-Analyse.