Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Geschlechtsspezifität von Unterschieden in den Proteomprofilen der Skelettmuskulatur zu bestimmen. Dazu werden zuerst Bizeps-brachii-Muskulaturproben von männlichen und weiblichen Mäusen zerkleinert und gründlich homogenisiert, um die meisten Proteine zu extrahieren. Anschließend wird die Probe auf einen IEF-Gelstreifen aufgetragen, und die Proteine werden entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt getrennt, gefolgt von einer SDS-Page-Trennung in der zweiten Dimension nach Größe. Nach Färbung und Abbildung der Gele werden die proteomischen Profile der Muskelproben von Männchen und Weibchen verglichen, und Proteinspots mit signifikanten Unterschieden in der Häufigkeit zwischen den beiden Geschlechtern werden ausgeschnitten.

Schließlich werden die Proteine in den Gel-Plugs mit Trypsin verdaut. Die resultierenden Peptide werden aus dem Gel extrahiert und einer nano-Flüssigkeits-Chromatographie sowie einer Massenspektrometrie-Analyse zur Identifizierung unterzogen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die differenzielle Expression von Proteinen unter zwei oder mehr experimentellen Bedingungen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und massenspektrometrie-basierter Proteomik zeigen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Geschlechtsspezifität von Muskulatur ermöglicht, kann sie auch auf andere Zellen, Gewebe, Organe oder Flüssigkeiten in unterschiedlichen physiologischen Zuständen angewendet werden. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert Dr. Kalina Diva, die technische Leiterin des Smith College Center for Proteomics. Nachdem das murine Skelettmuskelgewebe isoliert, gereinigt und zerkleinert wurde, pro Gramm Gewebe 45 µL Extraktionspuffer hinzufügen – siehe schriftlicher Protokollabschnitt für diese und alle weiteren Pufferrezepte – und das Gewebe mit einem motorisierten Stößel siebenmal für jeweils 15 Sekunden bei 4 °C homogenisieren, wobei zwischen jeder Homogenisierung eine Abkühlung von zwei Minuten auf Eis erfolgt.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.800 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie dessen Volumen. Entsorgen Sie das Pellet, um die Proteine bei dreifachem Volumen Eis auszufällen.

Kalte reagenziengereinigte Acetonmenge pro Volumen Überstand. Die Röhrchen 15 Sekunden lang verwirbeln, dann 10 Sekunden bei 15.800 ×g zentrifugieren, um Pellets zu bilden. Den Überstand verwerfen und die Pellets in Extraktionspuffer mit dem motorisierten Pistill und Polypropylen-Rührstäbchen resuspendieren; die Proteine ein zweites Mal durch Zugabe von weiteren drei Volumina Aceton ausfällen.

Nach dem Resuspendieren des Pellets in Extraktionspuffer die Proteinkonzentration bestimmen und/oder die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um die isoelektrische Fokussierung der Proteine durchzuführen, einen vorgefertigten IPG-Stripp aus dem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius entnehmen und 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur equilibrieren lassen. Die Probe vortexen und 600 bis 800 Mikrogramm Protein in einer geraden Linie am hinteren Rand eines Kanals in der Proben-Rewardierungs-Schale auftragen, wobei an jedem Ende etwa ein Zentimeter frei bleibt.

Entfernen Sie mit einer Pinzette die Kunststoffabdeckung des IPG-Streifens, wobei Sie nur die Enden des Streifens anfassen und jeglichen Kontakt mit dem Gel vermeiden sollten. Achten Sie auf das positiv markierte Ende des Streifens und positionieren Sie es auf der linken Seite der Schale. Legen Sie den IPG-Streifen mit der Gel-Seite nach unten auf die Probe.

Vermeiden Sie, Blasen einzuschließen. Lassen Sie es eine Stunde lang rehydrieren. Überdecken Sie den Streifen mit 2,5 Millilitern Mineralöl.

Bedecken Sie das Tablett mit einem Deckel und lassen Sie es über Nacht rehydrieren. Am nächsten Tag bei Raumtemperatur platzieren Sie einen Papierdocht an beiden Enden des Fokussierkanals und befeuchten jeden mit 10 Mikrolitern Millipore-Wasser. Entfernen Sie den IPG-Strip und halten Sie ihn etwa 10 Sekunden lang vertikal.

Um das Öl abzulassen, tupfen Sie die Kunststoffrückseite mit einem Kim-Tuch ab. Legen Sie das IPG-Streifengel mit der basischen Seite nach links nach unten. Bedecken Sie den Streifen in der Fokussierschale mit 2,5 Millilitern Paraffinöl.

Platzieren Sie das Tray in die Protean-IEF-Zelle und programmieren Sie ein dreistufiges Protokoll bei einer Standardzelltemperatur von 20 Grad Celsius, einem maximalen Strom von 50 Mikroampere pro Strip und keiner Nachfeuchtezeit. Nach Abschluss des Programms übertragen Sie den Strip-Gel nach oben in ein 11 cm langes Äquilibrierungs-Tablett. Geben Sie vier Milliliter Reduktionspuffer in den Kanal und äquilibrieren Sie den Strip zehn Minuten lang unter leichtem Schütteln.

Entfernen Sie den Reduktionspuffer und geben Sie vier Milliliter Alkylierungspuffer in den Kanal. Äquilibrieren Sie den Streifen unter Schütteln für zusätzliche 10 Minuten. Spülen Sie den IPG-Streifen durch kurzes Eintauchen in 1× SDS-Laufpuffer. Legen Sie anschließend den Streifen mit der Gel-Seite nach oben auf die Rückplatte eines 11-Zentimeter-Kriteriums.

Vorgelagerte Tris-HCl-SDS-Polyacrylamid-Gel mit 10,5 bis 14 % und vorsichtig andrücken, damit vollständiger Kontakt zur SDS-Geloberfläche besteht. Sicherstellen, dass keine Blasen zwischen den beiden Geloberflächen eingeschlossen sind. Die IPG-Streifen mit einem Milliliter geschmolzener Agaroselösung überdecken und fünf Minuten lang erstarren lassen.

Dann pipettieren Sie fünf Mikroliter Proteinmarker in die einzelne Mulde. Führen Sie das Gel in SDS-Puffer bei 200 Volt bei Raumtemperatur oder bei vier Grad Celsius durch. Wenn sich der Farbstoff an die Unterseite des Gels bewegt hat, nehmen Sie das Gel aus der Kunststoffform und färben es über Nacht, indem Sie es vorsichtig in Kumasi-Blaugrün schütteln.

Schütteln Sie das Gel zweimal je drei Stunden in Detektionslösung 1 und anschließend über Nacht in Detektionslösung 2. Bewahren Sie das Gel zur Analyse in 7 %iger Essigsäure auf. Nach der Bildaufnahme des Gels führen Sie eine vergleichende Analyse der Fleckenmuster zwischen den Gelen durch und schneiden Sie die interessierenden Flecken aus. Geben Sie 200 Mikroliter Detektionslösung zu den Gel-Plugs, wirbeln Sie die Probe und inkubieren Sie die Proben unter Schütteln 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen und verwerfen Sie die Lösung dann vorsichtig und wiederholen Sie den Schritt. Geben Sie 30 Mikroliter frisch zubereiteten Reduktionspuffer zu den Röhrchen mit den Gel-Plugs hinzu und inkubieren Sie diese 10 Minuten bei 60 Grad Celsius. Lassen Sie die Proben abkühlen.

Entfernen und verwerfen Sie dann den Puffer. Geben Sie 30 Mikroliter Alkylierungspuffer hinzu und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Entfernen und verwerfen Sie anschließend den Alkylierungspuffer. Waschen Sie die Gel-Plugs, indem Sie 200 Mikroliter Entfärbungslösung zu jedem Röhrchen hinzufügen, und inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.

Entfernen und verwerfen Sie die Haltelösung und wiederholen Sie die Wäsche. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter Acetonitril zu den Gel-Plugs hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, damit sie sich zusammenziehen und trocknen können. Entfernen Sie danach vorsichtig das Acetonitril und wiederholen Sie den Schritt mit den Gel-Stücken.

Sollte weiß und klein aussehen. Lassen Sie die Gelstücke 10 Minuten in einem Konzentrator trocknen. Quellen Sie die Gelstücke durch Zugabe von 10 Mikrolitern aktivierter Trypsinlösung.

Bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubieren. 25 Mikroliter Digestionspuffer zu den Röhrchen hinzufügen. Die Proben über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren, die Proben 10 Minuten lang sonizieren und anschließend zentrifugieren, bevor das Überstandsvolumen in ein neues Röhrchen überführt wird.

Um weitere Peptide zu extrahieren, geben Sie 10 Mikroliter 0,1 %iger Ameisensäure zu den Plugs hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln; sonizieren Sie die Proben anschließend zehn Minuten lang. Sammeln Sie den Überstand und vereinigen Sie ihn mit dem zuvor aufbewahrten Überstand. Die Proteine können dann entzuckert und für die HPLC-gekoppelte Massenspektrometrie vorbereitet werden. Männliches und weibliches untrainiertes Spiegel-Skelettmuskelgewebe wurde extrahiert und in einer zweidimensionalen Karte getrennt.

Die erste Ebene des muskulären vergleichenden Proteoms, einmal visualisiert mittels hochauflösender digitaler Bildgebung, zeigte hier sichtbar etwa 800 Proteinspots in jedem Probenansatz. Unter Verwendung der männlichen Proteomkarte als Referenz ist deutlich, dass zahlreiche Spots in ihrer Häufigkeit im weiblichen Proteom verändert sind; Proteinspots, die im Weibchen um den Faktor zwei oder mehr anstiegen, sind rot umkreist, jene, die um den Faktor zwei oder mehr abnahmen, sind blau umkreist. Die Identitäten der Proteinspots, die sich um mehr als den Faktor zwei nach oben oder unten verändern und statistisch signifikant sind (mit einem N von fünf Mäusen), wurden durch Aminosäuresequenzanalyse mittels gekoppelter Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie bestimmt.

In diesem Diagramm steht die x-Achse für weibliche Mäuse vor dem Training, und die Y-Achse steht für eine einzelne Gruppe zum Zeitpunkt null Stunden nach einer Trainingseinheit. Die Ergebnisse zeigen, dass Weibchen eine starke Abnahme des Zuckerenergiestoffwechsels, der Enzyme sowie der Isoformen des Kreatinkinase-Enzyms aufweisen, was auf ein anderes Energiesystem in den Muskeln hinweist. Sowohl Menschen als auch Tiere weisen im Ruhezustand und nach körperlicher Belastung höhere Serum-CK-Spiegel bei Männchen auf, doch die Serum-CK-Spiegel korrelieren nicht notwendigerweise mit der Menge an myofibrillärem Protein.

Dieses geschlechtsspezifische Dimorphismus in der zellulären Häufigkeit von CK im M. bizeps brachii von Miren ist ein neuartiger Befund und könnte die physiologisch unterschiedlichen Serum-CK-Spiegel erklären. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die quantitative Immunschichtblot-Analyse durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu verifizieren. Nach Anschauung dieses Videos sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proben für eine differenzielle Proteom-Profilierung vorbereitet und getrennt werden.