Ein experimentelles System, um Mechanotransduktion in fetalen Lunge Zellen zu untersuchen

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein experimentelles System zur Untersuchung der mechanischen Transduktion in fetalen Lungenzellen zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem Kulturschalen mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet werden. Anschließend werden fetale murine Lungenepithelzellen vom Typ II isoliert, gefolgt von der Isolierung fetaler muriner Fibroblasten.

Der letzte Schritt beschreibt ein In-vitro-System zur mechanischen Stimulation von Lungenzellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Zunahme der Differenzierung von Typ-II-Zellen mittels Echtzeit-PCR, Western Blot und fluoreszenzbasierter Immunchemie zeigen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mechanotransduktion zu beantworten, wie beispielsweise die fetale Lungenentwicklung und Lungenverletzungen.

Den Vorgang wird Julian Gu, ein Techniker aus meinem Labor, demonstrieren. Während wir unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Flusswerkbank arbeiten, stellen wir 120 Mikrogramm Laminin mit 12 Milliliter kaltem, sterilen 1× PBS pro Platte her. Andere extrazelluläre Matrixproteine können zum Beschichten verwendet werden. Einzelheiten entnehmen Sie bitte dem schriftlichen Protokoll, danach nehmen Sie eine unbehandelte BioFlex-Platte und geben zwei Milliliter der Laminin-Lösung in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Quadratzentimeter zu erreichen.

Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen vollständig von der Lösung bedeckt sind. Überziehen Sie die Platte vollständig mit Plastikfolie und stellen Sie sie über Nacht auf eine ebene Fläche in einen Umgebung mit vier Grad Celsius, damit die Beschichtung an den Boden der Vertiefungen binden kann. Beschichtete Platten können unter diesen Bedingungen mindestens eine Woche lang gelagert werden und behalten am nächsten Tag eine gute ECM-Funktion bei.

Unter sterilen Bedingungen die Vertiefungen dreimal mit 1× PBS waschen. Anschließend je einen Milliliter 1 % BSA in 1× PBS hinzufügen. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren, um unspezifische Bindungsstellen auf den Membranen zu blockieren.

Danach waschen Sie die Vertiefungen erneut dreimal mit je einem XPBS. Um nicht adsorbierte Proteine zu entfernen, geben Sie je ein Milliliter DMEM in jede Vertiefung der Platte. Bewahren Sie die Platte anschließend bei 37 Grad Celsius auf, bis die fetalen Lungentyp-II-Epithelzellen von Nagetieren isoliert und bereit für die Aussaat sind.

Am Tag vor Beginn des Zellisoliervorgangs die Siebeinheiten mit 130- und 15-Mikron-Nylon-Netzen zusammenbauen und durch Autoklavieren sterilisieren. Ebenfalls am Tag der Kultur die gleiche Anzahl an 150-Milliliter-Glas-Peaks autoklavieren. Fötale Lungen von zeitlich bestimmten, trächtigen Mäusen am E 17 bis E 19 der Gestation gewinnen.

Überführen Sie das Gewebe in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das DMEA-Medium enthält, und stellen Sie es auf Eis. Bereiten Sie frischen Verdauungspuffer in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gemäß der im schriftlichen Protokoll angegebenen Rezeptur zu. Während der Arbeit im laminaren Luftstromabsaugtisch filtrieren und durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter sterilisieren.

10 Milliliter dieses Puffers reichen für das Lungengewebe, das von etwa 20 embryonalen Mäusen gewonnen wurde. Stellen Sie das kegelförmige Reagenzglas mit dem Verdauungspuffer in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Aszidiere das Gewebe aus dem kegelförmigen Reagenzglas, das das embryonale Lungengewebe enthält, und überführe das Gewebe mit sterilen Scheren oder einer Rasierklinge in eine sterile Petrischale. Zerkleinere das Gewebe in Stücke von weniger als einem Millimeter Größe.

Überführen Sie das Gewebe anschließend in das kegelförmige Reagenzglas, das den vorgewärmten Verdauungspuffer enthält. Unterstützen Sie anschließend den Verdau des Gewebes mechanisch, indem Sie die fetale Lungenzell-Suspension jeweils hundertmal auf- und abpipettieren, wobei Pipetten mit abnehmender Öffnungsgröße verwendet werden. Nach Abschluss des Verdauungsvorgangs wird das Homogenat fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 1.300 U/min zentrifugiert.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie das Zellpellet in 15 Milliliter DMEM plus 20 % FBS. Danach nehmen Sie die Siebgefäße mit 130 und 15 Mikrometer Nylon-Netzen heraus und stellen sie auf sterile 150-Milliliter-Bechergläser. Pipettieren Sie das Zellhomogenat auf das 100-Mikrometer-Netz.

Sammeln Sie das Filtrat und pipettieren Sie es auf das 30-Mikron-Sieb. Spülen Sie das 30-Mikron-Sieb mehrmals mit frischem DMEM plus 10 % FBS. Die meisten Typ-II-Zellen lagern sich zusammen und passieren das Sieb nicht.

Diese Waschungen entfernen nicht-epitheliale Zellen, die möglicherweise an den Klumpen haften. Geben Sie das Filtrat vom 30-Mikron-Sieb auf den Siebtrichter mit 15-Mikron-Sieb. Waschen Sie erneut mehrmals wie zuvor.

Dieser Schritt dient der Anreicherung der Typ-II-Zellen, die möglicherweise die 30-Mikron-Siebmasche durchquert haben. Sammeln Sie die zusammengeklumpten, nicht gefilterten Zellen von den 30- und 15-Mikron-Siebmaschen zur weiteren Anreicherung von Typ-II-Zellen. Bewahren Sie das Filtrat der 15-Mikron-Siebmasche auf, falls fetale Nagetier-Lungenfibroblasten kultiviert werden sollen.

Andernfalls verwerfen Sie dieses Filtrat. Reinigen Sie die Population der epithelialen Zellen vom Typ zwei weiter, indem Sie Medium hinzufügen und die nicht filtrierten Zellen aus den Sieben mit 30 und 15 Mikrometer in einem Gewebekulturkolben mit 75 Quadratzentimetern Fläche 30 Minuten lang inkubieren. Zentrifugieren Sie nach dieser Inkubation den Überstand wie zuvor, entfernen Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter serumfreiem DMEM pro Fetus. Pipettieren Sie ein Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der lamininbeschichteten BioFlex-Sechswellplatten. Zu diesem Zeitpunkt erscheinen die Zellen unter dem Mikroskop in Klumpen. Inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekulturinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Eine Inkubation von 24 Stunden ist optimal, mindestens jedoch sechs Stunden Inkubation erforderlich.

Bevor mechanische Dehnungsversuche beginnen, das Filtrat der 15-Mikrometer-Masche entnehmen und in einen 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturflasche bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten überführen, um die Adhäsion der Fibroblasten zu ermöglichen; anschließend die Flüssigkeit absaugen und verwerfen. Danach das Volumen in der Flasche durch DMEM ohne Serum ersetzen und über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die Zellen mit 0,25 %iger Trypsin-Lösung in 0,4 Millimolar EDTA ablösen und auf fibronectinbeschichteten BioFlex-Platten ausplattieren; in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, idealerweise 24 Stunden, bevor die mechanischen Dehnungsversuche beginnen.

Eine Inkubation von mindestens sechs Stunden ist erforderlich, wenn für die Experimente eine bestimmte Anzahl von Zellen benötigt wird. Typ-zwei-Zellen werden nach der Isolation in serumfreiem DMEM in 75-Quadratzentimeter-Flaschen kultiviert; am nächsten Tag werden die Zellen abgelöst, gezählt und erneut ausgesät. Die Konfluenz der Zellschicht sollte vor Versuchsbeginn nicht höher als 80 % betragen. Am Tag des mechanischen Stimulationsversuchs wird das Zellkulturmedium durch zwei Milliliter frisches, serumfreies DMEM pro Vertiefung ersetzt, und die Platte wird anschließend in eine Flexcell FX-5.000-Dehnungseinheit eingesetzt.

Als Nächstes wenden Sie eine biaxiale EQU-Dehnung auf die Membranen an. Die Dehnungsregime variieren je nach Simulation mechanischer Kräfte in vivo. Wie im schriftlichen Protokoll erläutert, werden Zellen auf nicht-ST-gedehnten Membranen kultiviert.

Gleichzeitig kultivierte Zellen dienen als Kontrollen für das Experiment. Am Ende des Experiments können die Zellschichten zur Analyse von Veränderungen in der Genexpression mittels Echtzeit-PCR oder von Veränderungen in der Proteinmenge mittels Western Blot verarbeitet werden. Außerdem können die Zellschichten für immunchemische Experimente fixiert werden, die mit dieser Technik durchgeführt werden.

Nach der Fixierung werden die elastischen Membranen aus den Platten ausgeschnitten und mit 10 bis 20 Mikrolitern Wasser als Eindeckmittel auf Objektträger aufgebracht, bevor eine Permeabilisierung und Inkubation mit Antikörpern erfolgt. Die überschüssigen Daten aus dem Experiment können ebenfalls verwendet werden, um das Vorhandensein freigesetzter Substanzen wie Wachstumsfaktoren oder Zytokine zu untersuchen. Dieses Bild zeigt paraffinfixierte E18-fetale epitheliale Zellen vom Typ zwei, die gemäß diesem Protokoll isoliert und auf mit Laminin beschichteten BioFlex-Platten kultiviert wurden.

Die Zellen wurden fixiert und die Aufnahme gemacht. Am Tag nach der Aussaat der nicht-ST-Streckzellen wurde die Reinheit der Zellen mittels mikroskopischer Analyse der epithelialen Zellmorphologie und Immunfärbung für das Tensidprotein C auf 90 ± 5 % bestimmt. Die folgenden Abbildungen zeigen Daten von fetalen Typ-II-epithelialen Zellen, die 16 Stunden lang einer zyklischen Dehnung von 5 % bei 40 Zyklen pro Minute ausgesetzt waren.

Diese Northern Blot-Analyse der Surfactant-Protein-C-mRNA-Expression zeigt, dass mechanische Belastung die Differenzierung von Typ-II-Zellen unter Verwendung unterschiedlicher ECM-Substrate induziert. Die Plus-Minus-Zeichen stehen jeweils für die Exposition gegenüber mechanischer Belastung beziehungsweise für keine Exposition gegenüber Belastung. Die Expressionsdaten werden im Histogramm als Mittelwert plus oder minus SEM dargestellt, wobei N gleich drei ist; der Stern kennzeichnet einen P-Wert von weniger als 0,05.

Diese Fluoreszenz-Immunchemie-Bilder zeigen die Spiegeln des Surfactant-Protein-C-Proteins in grün. In fetalen Typ-II-Zellen, die auf der linken Seite keiner mechanischen Dehnung ausgesetzt waren, und auf der rechten Seite mechanischer Dehnung ausgesetzt waren, wurden die Kerne mit DAPI kontrastgefärbt, das blau erscheint. Dieses Histogramm quantifiziert Western-Blot-Ergebnisse aus drei Experimenten, die zeigen, dass mechanische Dehnung die Spiegel des Surfactant-Protein-C-Proteins erhöht.

In diesem Experiment beträgt N gleich drei und das Sternchen zeigt einen P-Wert von weniger als 0,05 an. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fetale Lungenzellen beschleunigt und mechanischer Dehnung aussetzt.