Ein experimentelles System, um Mechanotransduktion in fetalen Lunge Zellen zu untersuchen

Mechanische Kräfte spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung und Lunge Lungenversagen. Hier beschreiben wir eine Methode, um Nager fetalen Lunge Typ II Epithelzellen und Fibroblasten zu isolieren und sie auf mechanische Stimulation mit ein Exposé

Ziel dieses Verfahrens ist es, ein experimentelles System zur Untersuchung der mechanischen Transduktion in fetalen Lungenzellen zu beschreiben. Dies wird durch die Kodierung von Kulturplatten mit extrazellulären Matrixproteinen erreicht. Dann werden fötale Epithelzellen vom Lungentyp 2 isoliert, gefolgt von der Isolierung von fötalen Mausfibroblasten.

Der letzte Schritt beschreibt ein in vitro System zur mechanischen Stimulation von Lungenzellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Zunahme der Typ-2-Zelldifferenzierung durch real-time PCR, Western Blot und Fluoreszenz-Immunchemie-Bilder zeigen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mechano-Transduktion zu beantworten, wie z. B. die Entwicklung der fetalen Lunge und Lungenverletzungen.

Vorführen des Verfahrens wird Julian gu, ein Techniker aus meinem Labor. Während wir in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen arbeiten, werden 120 Mikrogramm Laminin mit 12 Millilitern Kältesterilität ein XPBS pro Platte hergestellt. Andere extrazelluläre Matrixproteine können für die Beschichtung verwendet werden. Konsultieren Sie das schriftliche Protokoll für Details, nehmen Sie dann eine unbehandelte BioFlex-Platte und geben Sie zwei Milliliter der Laminatlösung in jede Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Quadratzentimeter.

Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen vollständig von der Lösung bedeckt sind. Decken Sie die Platte vollständig mit Plastikfolie ab und legen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf eine ebene Fläche, damit das Laminat auf den Boden der Vertiefungen einziehen kann. Beschichtete Platten können unter diesen Bedingungen mindestens eine Woche gelagert werden, während sie am nächsten Tag eine gute ECM-Funktion behalten.

Waschen Sie die Vertiefungen unter sterilen Bedingungen dreimal mit einem XPBS. Fügen Sie dann jeweils einen Milliliter 1%BSA in einem XPBS hinzu. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius gut inkubieren, um unspezifische Bindungsstellen auf den Membranen zu blockieren.

Dann wieder die Vertiefungen dreimal mit einem XPBS waschen. Um nicht absorbierte Proteine zu entfernen, geben Sie einen Milliliter DMEM in jede Vertiefung der Platte. Lagern Sie die Platte dann bei 37 Grad Celsius, bis die fetalen Epithelzellen des Nagetier-Lungentyps zwei isoliert und bereit für die Beschichtung sind.

Am Tag vor Beginn der Zellisolierung werden die Siebbecher mit 130- und 15-Mikron-Nylonnetzen zusammengebaut und durch Autoklavieren sterilisiert. Autoklavieren Sie auch am Tag der Kultur die gleiche Anzahl von 150-Milliliter-Glasspitzen. Entnahme der fetalen Lungen einer zeitgesteuerten trächtigen Maus in E 17 bis 19 der Trächtigkeit.

Übertragen Sie das Gewebe in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit DMEA-Medium und legen Sie es auf Eis. Stellen Sie frischen Aufschlusspuffer in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen nach dem Rezept im schriftlichen Protokoll her. Und während Sie in einem Laminar-Flow-Haubenfilter arbeiten, sterilisieren Sie durch einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter.

10 Milliliter dieses Puffers reichen für das Lungengewebe aus, das von etwa 20 Mausföten gewonnen wird. Legen Sie das konische Röhrchen mit dem Aufschlusspuffer in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Asatisieren Sie das Dium aus dem konischen Röhrchen, das das fötale Lungengewebe enthält, und überführen Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere oder einer Rasierklinge in eine sterile Petrischale, zerkleinern Sie das Gewebe in Stücke mit einer Größe von weniger als einem Millimeter.

Übertragen Sie dann das Gewebe in das konische Röhrchen, in dem sich der Vorwarmverdauungspuffer befindet. Als nächstes unterstützen Sie mechanisch die Verdauung des Gewebes, indem Sie die fetale Lungenzellsuspension mit Pipetten mit abnehmender Öffnungsgröße jeweils hundertmal auf und ab pipettieren. Nach Abschluss des Aufschlusses wird das Homogenat fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.300 U/min zentrifugiert.

Entfernen Sie dann vorsichtig die Rückenlage durch Aspiration und resuspendieren Sie das Pellet, das die Zellen in 15 Millilitern DMEM plus 20 % FBS enthält. Nehmen Sie anschließend die Siebbecher mit 130- und 15-Mikron-Nylonnetzen heraus und legen Sie sie auf die sterilen 150-Milliliter-Becher. Pipettieren Sie das Zellhomogenat auf das 100-Mikron-Netz.

Sammeln Sie das Filtrat und pipettieren Sie es auf das 30-Mikron-Netz. Waschen Sie das 30 Mikron Mesh mehrmals mit frischem DMEM plus 10% FBS. Die meisten Zellen des Typs zwei verklumpen und passieren das Netz nicht.

Diese Waschungen entfernen nicht-epitheliale Zellen, die möglicherweise an den Klumpen haften. Tragen Sie das Filtrat aus dem 30-Mikron-Maschen auf den 15-Mikron-Maschensiebbecher auf. Auch hier mehrmals wie zuvor waschen.

In diesem Schritt werden die Zellen vom Typ zwei rekrutiert, die möglicherweise das 30-Mikron-Netz passiert haben. Sammeln Sie die verklumpten, nicht gefilterten Zellen aus den 30- und 15-Mikron-Maschen für eine weitere Zellanreicherung vom Typ 2. Das Filtrat wird aus dem 15-Mikron-Netz zurückgehalten, wenn fötale Lungenfibroblasten von Nagetieren kultiviert werden sollen.

Andernfalls verwerfen Sie dieses Filtrat. Weiter. Reinigen Sie die Epithelzellpopulation vom Typ 2, indem Sie Medien hinzufügen und die nicht gefilterten Zellen aus den 30- und 15-Mikron-Netzbechern in einem 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben für 30 Minuten inkubieren, nach dieser Inkubation zentrifugieren Sie den Supernamen wie zuvor, entpelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet dann in zwei Millilitern serumfreiem DMEM pro Fötus pipettieren Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung des beschichteten Laminats BioFlex Sechs-Well-Platten Zu diesem Zeitpunkt erscheinen die Zellen unter dem Mikroskop in Klumpen, inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Eine 24-stündige Inkubation ist optimal und eine mindestens sechsstündige Inkubation ist erforderlich.

Bevor Sie mit mechanischen Dehnungsexperimenten beginnen, nehmen Sie das Filtrat aus dem 15-Mikrometer-Netz und überführen Sie es für 30 bis 60 Minuten in einen 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben bei 37 Grad Celsius, damit die Fibroblasten anhaften, aspirieren und verwerfen können. Ersetzen Sie dann das Volumen im Kolben durch serumfreies DMEM und inkubieren Sie es über Nacht. Am nächsten Tag werden die Zellen mit 0,25 % Trypsin in 0,4 millimolar EDTA geerntet und auf Fibronektin-beschichteten BioFlex-Platten plattiert, in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert, idealerweise für 24 Stunden, bevor Sie mit den mechanischen Stammexperimenten beginnen.

Eine Inkubation von mindestens sechs Stunden ist erforderlich, wenn eine bestimmte Anzahl von Zellen für die Experimente benötigt wird. Typ-2-Zellen werden nach der Isolierung in serumfreien DMEM-75-Quadratzentimeter-Kolben gehalten, und am nächsten Tag werden die Zellen tryps-inisiert gezählt und dann sitzend Monolayer sollten vor Beginn der Experimente nicht mehr als 80 % konfluent sein. Am Tag des mechanischen Stimulationsexperiments wird das Zellkulturmedium durch zwei Milliliter frisches serumfreies DMEM pro Vertiefung ersetzt, und die Platte wird dann in eine flexible cell FX 5.000 Stammeinheit montiert.

Wenden Sie anschließend eine biaxiale EQU-Dehnung auf die Membranen an. Das Belastungsschema variiert je nach Simulation mechanischer Kräfte in vivo. Wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, wurden Zellen, die auf Nicht-ST-Membranen gezüchtet wurden, gedehnt.

Parallel kultivierte Geräte werden als Kontrollen für das Experiment verwendet. Am Ende des Experiments können Monolayer verarbeitet werden, um Veränderungen in der Genexpression durch real-time PCR oder Änderungen der Proteinhäufigkeit durch Western Blot zu analysieren. Darüber hinaus können Monoschichten für immunchemische Experimente für diese Technik fixiert werden.

Nach der Fixierung werden aus den Platten astische Membranen herausgeschnitten und mit 10 bis 20 Mikrolitern Wasser als Einbettmittel auf Objektträger montiert, bevor sie permeiert und mit Antikörpern inkubiert werden. Das Super-Datin aus dem Experiment kann auch verwendet werden, um das Vorhandensein von freigesetzten Substanzen wie Wachstumsfaktoren oder Zytokinen zu untersuchen. Dieses Bild zeigt parmale fixierte E 18 fetale Epithelzellen vom Typ 2, die wie in diesem Protokoll isoliert und auf BioFlex-Platten plattiert wurden, die mit Laminin kodiert sind.

Die Zellen wurden repariert und das Foto gemacht. Am Tag danach wurden die Nachher-Nicht-ST-Stretchzellen plattiert. Die Reinheit der Zellen wurde durch mikroskopische Analyse der Epithelzellmorphologie und Immunfärbung für das Tensidprotein C auf 90 plus/minus 5% bestimmt.Die folgenden Abbildungen zeigen Daten von fetalen Epithelzellen vom Typ 2, die 16 Stunden lang einer zyklischen Belastung von 5 % bei 40 Zyklen pro Minute ausgesetzt wurden.

Dieser Northern Blot der C-mRNA-Expression des Tensidproteins zeigt, dass der Stamm die Differenzierung von Typ-II-Zellen unter Verwendung verschiedener EZM-Substrate induziert. Die Plus-Minuszeichen stehen für die Belastung bzw. keine Belastung. Die Ausdrucksdaten werden im Histogramm als Mittelwert plus oder minus SEM dargestellt, wobei N gleich drei ist und das Sternchen einen P-Wert von weniger als 0,05 anzeigt.

Diese Bilder der Fluoreszenzimmunchemie zeigen den Gehalt des Tensidprotein-C-Proteins in grün. Beim fetalen Typ wurden zwei Zellen, die keiner mechanischen Belastung auf der linken Seite und einer mechanischen Belastung der rechten Kerne ausgesetzt waren, mit Dapi gegengefärbt, das blau erscheint. Dieses Histogramm quantifiziert die Western-Blot-Ergebnisse von drei Experimenten, die zeigen, dass die mechanische Dehnung den Spiegel des Tensidproteins C erhöht.

In diesem Experiment ist das N gleich drei und das Sternchen zeigt einen P-Wert von weniger als 0,05 an. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fötale Lungenzellen beschleunigt und sie mechanischer Dehnung aussetzt.