Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

Hallo, Shane, Monty vom Bija-Labor hier. Heute zeige ich Ihnen, wie man Siliziumsonden verwendet, um hochdichte elektrophysiologische Ableitungen der Aktivität einzelner Einheiten und des lokalen Feldpotentials bei wachen, verhaltensaktiven Ratten durchzuführen. Ich zeige Ihnen, wie man einen kleinen Mikroantrieb herstellt, eine Siliziumsonde daran befestigt und anschließend die Sonde für chronische Ableitungen ins Gehirn implantiert.

Dieser Prozess ist recht einfach, umfasst jedoch eine Reihe von Schritten. Beginnen wir also. Hier sehen Sie eine kleine Sammlung von Mikroantrieben für Ratten und Mäuse, die für die Bewegung mehrerer Einzeldrähte, Teros und Siliziumsonden gedacht sind und die wir im Laufe der Jahre entworfen und hergestellt haben.

Siliziumsonden können an starre Leiterplatten oder flexible Polyamidkabel angebracht werden. Hier zeigen wir Ihnen, wie man diese Vier-Schenkel-Sonde an einem Mikroantrieb befestigt. Um einen Antrieb vorzubereiten, benötigen wir eine Messingplatte, einen Bohrer der Größe 55 und 65, einen Gewindeschneider, einen einreihigen Stiftleiste, eine 0-0-90-Schraube und die entsprechende Mutter, einen Bohrerschafthalter und einen Schraubendreher.

Der erste Schritt besteht darin, ein dreipoliges Stück vom Header abzubrechen. Ziehen Sie vorsichtig den mittleren Pin heraus, vergrößern Sie ein Loch, indem Sie mit einem 65er Bohrer hindurchbohren, und schneiden Sie dann ein Gewinde mit dem ta.

Schneiden Sie zwei Stücke aus der Messingplatte aus. Bearbeiten Sie die Kanten der Platte mit einer Dremel-Bohrmaschine und bohren Sie mit einem 55er Bohrer ein Loch in die Mitte beider Stücke. Der Antrieb wird vorübergehend zusammengebaut, sodass die Messingplatten die Stifte berühren; ziehen Sie die Schrauben vorsichtig an, damit die Baugruppe stabil wird.

Die Bolzenenden werden dann an die Messingplatten angelötet. Der Mikroantrieb ist fast fertig; es wird ein überstehendes Ende der Schraube abgefeilt und diese in die Bohrung eingelötet. Nun haben wir einen 2-Superleicht-Mikroantrieb.

Das Drehen im Uhrzeigersinn hebt die Kunststoffbrücke an. Die Silikonsonde kann mithilfe von zwei Komponenten an der Halterung befestigt werden. Seidenschutz-Elastomer wiegt ein.

Mischen Sie die Komponenten im Verhältnis 10 zu 1. Tragen Sie die Paste mit einem angespitzten Wattestäbchen auf das obere Ende der Sonde auf. Lassen Sie sie mindestens zwei Stunden lang in einem auf 60 Grad Celsius vorgeheizten Ofen trocknen.

Um sicherzustellen, dass die Aufnahmestellen frei von jeglichem Schmutz sind, müssen die Spitzen gereinigt werden. Bereiten Sie eine vierfache Verdünnung von Contra-Detergens vor. Lassen Sie die Sonde mindestens zwei Stunden lang bei 63 Grad Celsius im Detergens einweichen.

Das Reinigungsmittel sollte abgespült werden, indem die Sonde wiederholt in destilliertem Wasser getaucht wird, bevor die Sonde am Träger befestigt wird. Die Impedanz jeder Ableitstelle sollte mithilfe einer Rasierklinge überprüft werden. Erzeugen Sie mit zwei Mikromanipulatoren mehrere Rillen in der Brücke, um eine rauhe Oberfläche zu schaffen.

Die Sonde wird der Antriebsbrücke gegenübergestellt. Anschließend wird die Sonde vor der Operation mit Klammerzement an der Brücke befestigt. Die Referenz-Masseelektroden werden vorbereitet.

Löten Sie ein Ende des isolierten Kupferdrahts auf etwa einen Millimeter frei. Schaben Sie mit einer Nadel den Kopf einer 0-0-90-Edelstahlschraube ab und löten Sie den Kupferdraht daran fest. Achten Sie sorgfältig darauf, dass kein Lot in die Rille der Schraube gelangt.

Schneiden Sie trapezförmige Stücke aus Kupfergitter. Diese Stücke werden zusammengesetzt, um die Kopfplatte zu schützen. Chirurgische Instrumente und Vorbereitungen sind dieselben wie bei vielen Operationen an kleinen Tieren.

Bitte beachten Sie, dass die in diesem Video gezeigte Operation ausschließlich zu Demonstrationszwecken und zur besseren Sichtbarkeit sowie für die Aufnahme durchgeführt wird. Mehrere vorbereitende Schritte, chirurgische Vorsichtsmaßnahmen und postoperative Verfahren werden hier nicht gezeigt. Bitte konsultieren Sie die entsprechenden Leitlinien für die Chirurgie an Nagetieren.

Die gesamte Operation wird unter Gasnarkose und unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nach medianer Hautinzision werden Haut und Periost entfernt, und der Schädel wird gereinigt und getrocknet. Die Lage und der Abstand zwischen Bregma und Lambda werden gemessen, sodass die X- und Y-Koordinaten der Position bestimmt und markiert werden können, bevor der Schädel geöffnet wird.

Zum Implantieren der Sonde werden mehrere Schrauben zur Hälfte in den Knochen eingeschraubt, sowohl an der Oberseite als auch an der Seite; außerdem werden Löcher oberhalb des Gehirns vorbereitet, um die Elektroden einzubringen. Mehrere Schrauben sind entscheidend, um die Kopfhalterung am Schädel bei langfristigen chronischen Experimenten zu befestigen. Mit einem kleinen Pinsel wird Meta-Dentin-Aktivator auf die gesamte Oberfläche des Schädels aufgetragen.

Danach wird es mit Kochsalzlösung gespült. Anschließend wird vorsichtig eine Schicht Zahnzement aufgetragen, die eine Kette von Besatzmitgliedern bedeckt. Die vier Kupferklappen werden dann an diesem Schädel mit Griffzement befestigt.

Nun sind wir beim kritischsten Teil der Operation angelangt: der Präparation der Implantationsstelle für die Sonde mithilfe eines Rundfräsers. Das Bohren erfolgt in mehreren Schritten, wobei der Knochen regelmäßig mit Kochsalzlösung benässt wird.

Der Knochenlappen wird vorsichtig entfernt und die Oberfläche zur Entfernung der Zura gespült. Es werden zwei Instrumente benötigt: ein Haken, der aus einer Insektennadel hergestellt wurde, und eine scharfe Klingenskalpellspitze. Damit wird angehoben und geschnitten, wobei geringe Blutungen durch Spülung mit Kochsalzlösung behoben werden können.

Wenn eine starke Blutung auftritt oder wenn der Neokortex in irgendeiner Weise beeinträchtigt ist, sollte man die Operation abbrechen und ein anderes Tier vorbereiten. Nun implantieren wir die Silikonsonde. Die Sonde sollte in einem gefäßfreien Bereich eingeführt werden, während die durch die Einsetzung verursachte geringfügige Blutung abklingt.

Die Sonde wird etwa einen Millimeter über dem beabsichtigten Ziel platziert. Das Fenster wird durch Auftragen einer warmen, geschmolzenen Mischung aus Paraffin und Mineralöl verschlossen. Der Boden des Trägers befindet sich im Kortex des Schädels und ist mit Gripzement befestigt.

Der verbindende Teil der Sonde wird auf ähnliche Weise am Schädel befestigt. Die letzte und entscheidende Phase der Operation besteht darin, Kupfergitterklappen zu einem schützenden Zylinder um die Sonde und die Vorrichtung herum zusammenzubauen. Der Zylinder dient auch als elektrische Abschirmung gegen Umgebungsstörungen und die langsamen Wellenartefakte, die von elektrisch geladenen Schnurrhaaren erzeugt werden.

Bei dem sich verhaltenden Tier kann die Höhe angepasst werden, indem überschüssiges Material abgeschnitten wird. Der Draht vom Referenzelektrodenanschluss wird an die entsprechenden Stifte des Steckverbinders gelötet. Die Masse wird ebenfalls mit dem Kupfergeflecht verlötet.

Die Kupfermeh-Flaps sind durch Löten verbunden und mit Zement verstärkt. Die Bewegung der Antriebsschraube wird erneut am Ende der Operation getestet, wobei eine Kopfstadiumsposition mit einem Stück, das aus einem Gummihandschuh geschnitten wurde, nach entsprechender postoperativer Versorgung verwendet wird. Es handelt sich um ein gesundes und kooperatives Tier, das am nächsten Tag bereits große Fortschritte zeigt.

Um eine freie Bewegung des Tieres zu ermöglichen, empfehlen wir die Verwendung eines ultraleichten, äußerst flexiblen Multitrend-Drahtes. Das dünne Kabel erfordert eine minimale Gegengewichtskompensation und erlaubt uneingeschränkte Bewegungsfreiheit. Die Aufnahmequalität wird täglich im Heimkäfig überprüft.

Die Position der Ableitestelle wird anhand der Aktivitätsmuster einzelner Neuronen und der Form der lokalen Feldpotentiale geschätzt. Unser Film zeigt die Implantation einer einzelnen Silikonsonde, aber mehrfache Ableitungen an verschiedenen Stellen mittels mehrerer Sonder und Halterungen können nach etwas Übung leicht durchgeführt werden. Wir verwenden außerdem ähnliche, aber kleinere Halterungen, um Silikonsonden im Maushirn zu implantieren.

Zuletzt können Aufzeichnungen mit Siliziumsonden effektiv mit lokaler Lichtstimulation von Nervengewebe in optogenetischen Experimenten kombiniert werden. Vielen Dank fürs Zuschauen.