Name: Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Phagozytoseaktivität antigenspezifischer Antikörper aus klinischen Proben mittels hochdurchsatzfähiger Durchflusszytometrie bestimmen. Diese Methode nutzt fluoreszierende Antigen-beschichtete Mikropartikel und eine monozytäre Zelllinie für standardisierte immunologische Analysen.

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Die Autoren möchten die Finanzierung von NIH 3R01AI080289-02S1, und ein Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship unter NIH / NIAID 2P30AI060354-07 bestätigen.

1. Kultur Phagozytenzellen <ol><li> Kultur THP-1 Zellen 10 in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum als stationäre Suspension in T-Kolben ergänzt. Die Zelldichte sollte unter 0.5x10 6 / mL gehalten werden, um ein einheitliches Niveau des FcyR Ausdruck und Assay-Leistung aufrecht zu erhalten. </li></ol> 2. Bereiten biotinylierten Antigen <ol><li> Berechnen Sie den Betrag von Sulfo-NHS-LC Biotin Reagenzienkit notwendig, um das Ziel-Antigen von Interesse nach den Anweisungen des Herstellers Biotinylierung. </li><li> Lösen Sie die Biotinylierungsreagenz in Wasser und sofort die berechnete Menge an Antigen in einem Puffer, der keine primären Amine. Lassen Sie die Reaktion für 1 Stunde bei Raumtemperatur ablaufen, Mischen gelegentlich. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige, nicht konjugierte Biotin durch Puffer Austausch in einer Amicon Zentrifugalkraft Konzentration Einheit eines geeigneten Molekulargewichtsschnitt die targe behaltent-Antigen. Probe in die obere Kammer des Konzentrationslagers Einheit und fügen PBS auf das Gesamtvolumen von bis zu 15 mL füllen Einklang zu bringen. Zentrifuge bei 4000 xg, um die Lautstärke zu senken, um etwa 1,5 mls. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal löscht 99% der freien Biotin, um eine maximale Beschichtung von Antigen, um Perlen zu sichern. </li></ol> 3. Bereiten Antigen Gesättigte Beads <ol><li> Wash 100 ul 1 mm fluoreszierende Neutravidin Perlen zweimal in 1 ml 0,1% PBS-BSA nach dem Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei hoher Geschwindigkeit. Resuspendieren gewaschenen Beads in 100 ul PBS-BSA und Aliquot in 10 Röhren. </li><li> Um zu bestimmen, Antigen-Beschichtung Bedingungen, die die Perlen zu sättigen, kombinieren 10 ul der gewaschenen Bead-Suspension mit variierenden Konzentrationen von biotinylierten Antigen in zweifacher Schritte. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Rotator. </li></ol> HINWEIS: Die Sättigung der Perlen muss experimentell ermittelt werden. Dies kann erreicht werden,durch die Identifizierung Bead-Beschichtung Bedingungen, die eine maximale Ausbeute bei Phagozytose Perlen anschließend mit einer Kontrollgruppe monoklonaler Antikörper opsonierten sind. <ol start="3"><li> Entfernen ungebundenen Antigen durch Waschen mit 1 ml PBS-BSA und Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, bis Kügelchen pelletiert werden. Entfernen Sie PBS-BSA und wiederholen. </li><li> Resuspendieren Antigen-beschichteten Kügelchen in einem Endvolumen von 1 ml in PBS-BSA. Beads können gespeichert werden bis zu einer Woche bei 4 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol> 4. Bereiten Antikörper Proben <ol><li> Klinische Antikörper Proben aus dem Plasma mit einer Melone Gel IgG Reinigungskit nach Herstellerangaben gereinigt werden. Gereinigtes IgG bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> HINWEIS: Das richtige Vorsichtsmaßnahmen hinsichtlich der Umgang mit menschlichen Proben müssen immer getroffen. <ol start="2"><li> Bestimmen Sie die Konzentration der gereinigten Antikörper durch Absorption bei A280 und verdünnte Proben auf 1 mg / ml in PBS. </li><li> Bereiten Sie postulierenive und negative monoklonalen Kontroll-Antikörper durch Verdünnen auf 1 mg / ml in PBS. </li></ol> 5. Plating das Experiment <ol><li> Resuspendieren gewaschen, Antigen gesättigt Beadlösung oben durch Vortexen vorbereitet und Transfer 10 ul in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. Es muss darauf geachtet, ständig rühren die Bead-Suspension zu gleichen Teilen aus fluoreszierende Kügelchen zu gewährleisten sind in jede Vertiefung gegeben. </li><li> Add unterschiedlichen Konzentrationen der Antikörper von Interesse in jede Vertiefung, die Schaffung eines Dosis-Wirkungs-Kurve für jeden Antikörper. Optimale Konzentrationen zwischen den Proben in Abhängigkeit von der Titer der Antikörper vorhanden unterscheiden, aber eine Reihe von 0,01 bis 100 pg / ml Endkonzentration wird eine gute Abdeckung bieten und die Identifikation der interessierenden Konzentrationsbereich. Stellen Sie sicher, Antikörper werden in Mengen nicht größer als 20 ul aufgenommen. </li><li> Inkubieren Perlen und Antikörper-Proben für 2 Stunden bei 37 ° C, damit der Antikörper an die Beads opsonisieren. &lt;/ Li&gt; <li> Eine Suspension von THP-1 Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml, und 200 ul dieser Suspension in jede Vertiefung, für eine Gesamtmenge von 5 x 10 4 THP-1 Zellen in jedem Well. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2, in einer stationären Inkubator, so dass Zellen und Perlen Pellets durch Schwerkraft. </li></ol> HINWEIS: Signal-Rausch kann durch die Bestimmung der optimalen Sicke verbessert werden: Antikörper: THP-1 Zellen Verhältnisse für ein bestimmtes Antigen und Antikörper Quelle. 6. Durchflusszytometrische Analyse <ol><li> Nehmen Sie 100 ul des Überstands aus jeder Vertiefung darauf achten, daß das Zellpellet zu stören. Überstand kann dann gespeichert, wenn Zytokinsekretion Bestimmungen oder anderen Analysen erwünscht sind. </li><li> Zur Fixierung wird mit 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und Pipette resuspendieren und mischen Zellen. </li><li> Hoher Durchsatz durchflusszytometrische Analyse kann unter Verwendung eines BD LSR II mit einem HTS-Reader ausgestattet werden.</li><li> Program-Software zu mischen jedes Well dreimal (100 ul Mix Volumen) und analysieren 30 mu l oder mindestens 2000 Zellen Veranstaltungen jeder Probe. </li><li> Die gesammelten Daten können in FlowJo oder gleichwertige Software analysiert werden. Nützliche Metriken sind die Prozent der Perle + oder fluoreszierende Zellen, die ein Maß für die Anzahl der Phagozytenzellen Gegenwart bietet, ebenso wie die Fluoreszenz-Intensität des Phagozytenzellen, die ein Maß für die Anzahl der phagozytiert Perlen bietet. Multipliziert man diese Werte erzeugt eine integrierte bedeuten Fluoreszenzintensität oder iMFI. </li><li> Die durchschnittliche Zahl der Kugeln von jeder Fresszellen phagozytiert können, indem die iMFI durch die mittlere Fluoreszenz von 1 Perle berechnet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Es sollten klare Differenzierung von Antikörper-Proben aus betroffenen und nicht betroffenen Probanden werden. Abbildung 1A zeigt die FACS-Histogramme eines Antikörpers Probe von einem HIV negativInitiative (schwarze Kurve) und eine HIV-positive (graue Kurve) unterliegen, und zeigt die erhöhte Phagozytose durch die Anwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern angetrieben. Optimale Sensitivität des Tests ist abhängig von der Sättigung der Beads mit biotinylierten Antigen. Abbildung 1B zeigt die Phagozytose beobachtet, wenn Kugeln mit unterschiedlichen Mengen an Antigen beschichtet mit 3 Kontrolle monoklonalen Antikörpern (einschließlich einer unverbindlichen Antikörper, Dreiecke) opsonierten wurden, und stellt 2μg Antigen / ul Perlen als Sättigungskonzentration für dieses Antigen. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve ist in Abbildung 2 dargestellt und zeigt die Differenz Kapazität von Subjekt Antikörper Proben Phagozytose über einen Antikörper Konzentrationsbereich von 0,05-5 g / ml induzieren. Diese Differenz Phagozytose kann entweder durch Unterschiede in der Titer oder Fc-Domäne Eigenschaften wie IgG-Subklassen und Glykosylierung Zustand getrieben werden. Als THP-1 Zellen sind iMaged durch Fluoreszenz-Mikroskopie, gibt es eindeutige Beweise für bead Phagozytose. Abbildung 3 zeigt zwei 63x Standbilder von THP-1 Zellen nach Inkubation mit dem Antikörper opsonierten (grün) und nicht-opsonierten (red) Kugeln, was die fehlende Phagozytose in Abwesenheit des Antikörpers. Wenn Zeitraffer-Mikroskopie durchgeführt wird, ist der Antikörper-spezifische Phagozytose von fluoreszierenden Kügelchen noch auffälliger (Movie 1, 20-facher Vergrößerung). Frühere Arbeiten haben Internalisierung der Perlen mit den Zellen verbunden bestätigt, und Experimente mit primären Monozyten haben gut mit phagocytic Scores (iMFI Werte) in diesem hohen Durchsatz-Test (Daten nicht gezeigt) vereinbart. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Assay Quality Control. 1A, Durchflusszytometrie Histogramme der Phagozytose für einen Antikörper Stichprobe aus einer HIV-negativ Thema (schwarze Kurve) und eine HIV-positive Subjekt (graue Kurve).1B: Experimentelle Bestimmung der optimalen Wulstbeschichtung Bedingungen für eine Probe-Antigen. Antigen-spezifische monoklonale Antikörper (Kreis, Quadrat) zu demonstrieren maximal Phagozytose von Kügelchen, die mit&gt; 2 pg Antigen / ul von Perlen beschichtet, während ein Kontroll-Antikörper (Dreieck) zeigt keine Phagozytoseaktivität. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Phagozytose Dosis-Wirkungs-Kurve. Klinische Antikörper Proben von HIV-positiven (behandelt, unbehandelt, und Ausstellen Kontrolle der Virusreplikation in Abwesenheit von anti-retroviralen Therapie) und HIV-negativen Probanden Laufwerk Phagozytose von gp120 (HIV-Envelope) Kügelchen unterschiedlich. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Effiziente Internalisierung. Mikroskopie bestätigt die Internalisierung der Antikörper-opsonierten Perlen (grün), während die Nicht-opsonierten Perlen in sol bleibenution (63x Vergrößerung). Movie 1. Zeitraffer-Mikroskopie von Antikörper-driven Phagozytose wurde im Laufe von 14 Stunden durchgeführt und erlaubt die Visualisierung der Phagozytoseaktivität der THP-1 Zellen in der High-Throughput-Assay verwendet. Grün fluoreszierende Kügelchen sind Antikörper opsonierten bieten rot fluoreszierende Kügelchen eine negative Kontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

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<li>Fust, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+and+enhancing+antibodies+measured+in+complement-restored+serum+samples+from+HIV-1-infected+individuals+correlate+with+immunosuppression+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease.</a> AIDS. 8, 603-609 (1994).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Test hier beschriebenen ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse der Phagozytoseaktivität von klinischen Proben Antikörper durch die Verwendung einer monozytären Zelllinie lange genutzt werden, um phagocytic Prozesse 10 und Platte für automatisierte Durchflusszytometrie zu studieren. Dieser Assay ist vorteilhaft gegenüber anderen in seiner Fähigkeit, präzise zu charakterisieren Antigen-spezifischen Antikörper Teilmengen, so dass nicht nur für die Untersuchung von Unterschieden in Phagozytose durch krankheits-spezifischen Antikörpern aus verschiedenen Fächern angetrieben, sondern auch Studie mehrerer Antigenspezifitäten innerhalb der gleichen Thema. Da Antikörper Rekrutierung von angeborenen Effektor-Zellen, einschließlich Monozyten und anderen Antigen-präsentierenden Zellen einen starken Einfluss Krankheitsverlauf 11-13, und ist biologisch variabel je Antikörper Geometrie, IgG-Subklassen und Glycosylierung an Asparagine297 der Fc-Domäne 14-16, bietet diese Methode für Auswertung einer kritischen Antikörper Wirkmechanismus. Darüber hinaus, weil Antikörper-vermittelteEINZELNEN SEKTOREN Phagozytose durch bestimmte Erreger ist im Verlauf der Infektion 7,17,18 ausgenutzt, hält diesen Test Versprechen bei der Bewertung des Prozesses der Antikörper-abhängigen Verstärkung, und unterstreicht die duale Natur der Phagozytose als potenziell schützende, sowie potenziell schädliche Antikörper-Aktivität. Der beschriebene Assay genutzt werden, um Antikörper, die aus klinischen Proben von Patientengruppen zu analysieren, sondern auch der Impflinge und kann angepasst zu nutzen Serum als gereinigtes IgG werden. Darüber hinaus können Zytokinsekretion in Reaktion auf die Phagozytose aus dem Kulturüberstand analysiert werden, und der Einfluss der spezifischen FcR kann durch die Verwendung FcR-blockierende Antikörper, so dass nicht nur Unterschiede in phagocytic Potenz zu bestimmen bestimmt werden, sondern nachgeschalteten Signalwege, mit Einblick in-Mechanismus, können und helfen zu lösen und zu verfeinern Verständnis dieses Immunsystems.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylierung Kit </td><td> Thermo Scientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Einheit mit Ultracel-50-Membran </td><td> Millipore </td><td> UFC905024 </td><td> Filter-Einheit Größe kann je nach Antigen Größe variieren </td></tr><tr><td> FluoSpheres NeutrAvidin markierten Mikrosphären, 1,0 um, gelb-grün fluoreszierend (505/515) </td><td> Invitrogen </td><td> F-8776 </td><td> Hersteller produzieren dieses Produkt in verschiedenen Farben </td></tr><tr><td> Melon Gel IgG Purification Kit </td><td> Thermo </td><td> 45212 </td><td> Es sollte darauf geachtet um die Reinheit der Ab-Proben durch SDS-PAGE überprüft werden. </td></tr></tbody></table>

die bestimmung der phagozytoseaktivität of clinical antikörper proben

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antikörper-driven Phagozytose über das Engagement von Fc-Rezeptoren auf professionelle Phagozyten induziert und kann sowohl Freiraum als auch Pathologie der Krankheit beitragen. Während die Eigenschaften der variablen Domänen von Antikörpern lange gegolten haben entscheidend für in vivo-Funktion hat die Fähigkeit von Antikörpern, angeborene Immunsystem-Zellen über ihre Fc-Domänen rekrutieren zunehmend geschätzt als ein wichtiger Faktor in ihrer Wirksamkeit, sowohl in der Einstellung des rekombinanten Therapie mit monoklonalen Antikörpern, sowie im Zuge der natürlichen Infektion oder Impfung 1-3. Wichtig ist, dass trotz seiner Nomenklatur als eine konstante Domäne, wird die Antikörper-Fc-Domäne nicht konstante Funktion, und ist stark moduliert durch IgG-Subklassen (IgG1-4) und Glycosylierung an Asparagin 297 4-6. So, diese Methode zu studieren funktionelle Unterschiede von Antigen-spezifischen Antikörpern in klinischen Proben wird Korrelation der phagocytic Topf erleichternential von Antikörpern gegen Krankheitszustand, Infektanfälligkeit, Progression oder klinische Ergebnis. Darüber hinaus ist dieser Effektor-Funktion besonders wichtig im Hinblick auf den dokumentierten Fähigkeit von Antikörpern gegen Infektionen durch Erreger Zugang in die Wirtszellen via Fc-Rezeptor-driven Phagozytose 7 zu erhöhen. Darüber hinaus gibt es einige Hinweise, dass Phagozytose von Immunkomplexen können die Th1/Th2 Polarisierung der Immunantwort 8 Auswirkungen. Hier beschreiben wir einen Test entwickelt, um Unterschiede in der Antikörper-induzierte Phagozytose, die durch unterschiedliche IgG Unterklasse Glykanstruktur bei Asn297 sowie die Fähigkeit, Immunkomplexe von Antigen-spezifischen Antikörpern in einem High-Throughput-fashion Form verursacht werden können, erkennen . Zu diesem Zweck sind 1 um fluoreszierende Kügelchen mit Antigen beschichtet und dann mit klinischen Proben Antikörper inkubiert, erzeugen fluoreszierendes Antigen-spezifische Immunkomplexe. Diese Antikörperndy-opsonierten Kügelchen werden dann mit einer Monozyten-Zelllinie, die mehrere FcγRs, darunter sowohl hemmende und aktivierende inkubiert. Assay-Ausgang kann auch Phagozytoseaktivität, Zytokinsekretion und Muster der FcγRs Nutzung, und in einer standardisierten Art und Weise bestimmt, so dass dies ein sehr nützliches System für das Parsen von Differenzen in dieser Antikörper-abhängigen Effektor-Funktion in beide Infektion und Impfung vermittelte Schutz 9.

Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Die Antikörper-gesteuerte Phagozytose wird durch die Bindung von Fc-Rezeptoren auf professionellen Phagozyten induziert und kann sowohl zur Clearance als auch zur ... beitragen.

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die phagozytische Aktivität antigenspezifischer Antikörper in klinischen Proben mit hoher Durchsatzleistung zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Kügelchen mit einem beliebigen Antigen beschichtet werden, um die antigenspezifische Fraktion von Antikörpern in komplexen klinischen Antikörperproben zu binden. In einem zweiten Schritt werden phagozytierende TP1-Zellen mit den ionisierten fluoreszierenden Kügelchen inkubiert, die dann von den Zellen aufgenommen werden, wobei die Aufnahme durch die Anzahl und die FC-Domäneneigenschaften der gebundenen Antikörper bestimmt wird.Anschließend wird die Fluoreszenzintensität der THP-1-Zellen mittels hochdurchsatzfähiger plattenbasierter Durchflusszytometrie bestimmt, um die phagozytische Aktivität der im Probenmaterial enthaltenen Antikörper zu quantifizieren. Letztendlich kann so die Fähigkeit antigenspezifischer Antikörper in der Probe beurteilt werden, Phagozytose zu induzieren, basierend auf der unterschiedlichen Aufnahme der opsonisierten fluoreszierenden Kügelchen, hervorgerufen entweder durch variable Antikörpertiter oder durch variable Erkennung durch die auf den phagozytierenden Zellen exprimierten Antikörperrezeptoren. Die Hauptvorteile dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren, wie beispielsweise solchen unter Verwendung primärer phagozytierender Zellen, liegen in einer erhöhten Durchsatzkapazität und einer verbesserten Standardisierung.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Grundimmunologie der adaptiven Immunantwort zu beantworten, beispielsweise, ob unterschiedliche Impfschemata Antikörper mit verschiedenen Aktivitäten hervorrufen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie infektiöser Krankheiten, da Antikörper maßgeblich zur Ausbildung einer wirksamen schützenden Immunantwort beitragen. Obwohl wir diese Methode verwendet haben, um Einblicke in die Aktivität von Antikörpern bei fortschreitender HIV-Infektion und Impfung zu gewinnen, kann sie auch auf andere Krankheitszustände wie Influenza, Autoimmunität und Dengue angewendet werden, bei denen frago-Antikörper die D-Krankheit verschlimmern können, anstatt Schutz zu bieten.Beginnen Sie damit, das Antigen in einem Puffer zu verdünnen, der keine primären Amine enthält. Lösen Sie anschließend das Sulfa-NHS-lc-Biotin-Reagenz in Wasser auf. Fügen Sie danach umgehend das hydratisierte Reagenz dem Antigen hinzu und lassen Sie die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren ablaufen.Gelegentlich, wenn die Reaktion abgeschlossen ist, das Probenmaterial in die obere Kammer einer zentrifugalen Konzentrationsvorrichtung geben, um überschüssiges, nicht konjugiertes Biotin durch Pufferaustausch zu entfernen. Anschließend PBS hinzufügen, um das Gesamtvolumen bis zur 15-Milliliter-Füllmarkierung aufzufüllen. Abschließend die Probe bei 4.000 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, bis das Volumen auf etwa 1,5 Milliliter reduziert ist.Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um eine nahezu quantitative Entfernung von freiem Biotin zu erreichen. Nachdem 100 Mikroliter einer ein Mikrometer großen, fluoreszierenden Eutradin-Perlenlösung in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 × g für fünf Minuten zentrifugiert wurden, resuspendieren und waschen Sie die Perlen in einem Milliliter 0,1 % P-B-S-B-S-A unter Anwendung desselben Zentrifugationsverfahrens. Danach, nachdem die gewaschenen Perlen in 100 Mikrolitern P-B-S-B-S-A resuspendiert wurden, aliquotieren Sie die Perlen erneut auf 10 Mikroförmchen auf. Anschließend kombinieren Sie 10 µL der gewaschenen Beadsuspension mit unterschiedlichen Konzentrationen biotinylierter Antigene in Faltschritten. Inkubieren Sie dann die Beadsuspension und die Antigensuspension über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Rotator. Am nächsten Tag.Entfernen Sie jegliches ungebundene Antigen, indem Sie die Suspensionen zweimal mit je einem Milliliter P-B-S-B-S-A waschen und die Proben anschließend wie zuvor mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren, bis die Kügelchen pelletiert sind. Schließlich resuspendieren Sie die antigenbeschichteten Kügelchen in einem Endvolumen von einem Milliliter P-B-S-B-S-A, nachdem Sie die klinischen Antikörperproben gemäß den Herstelleranweisungen mithilfe eines Melon-Gel-IgG-Reinigungs-Kits aus Plasma gereinigt haben. Bestimmen Sie die Konzentration der gereinigten Antikörper durch die Absorption bei 280.Anschließend verdünnen Sie die Antikörper auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in PBS und legen Proben für die positiven und negativen monoklonalen Kontrollantikörper beiseite. Als Nächstes resuspendieren Sie die antigengesättigte Perlsuspension durch Vortexen und geben dann 10 Mikroliter der Lösung in jedes Loch einer runden 96-Loch-Platte. Achten Sie darauf, die Perlsuspension kontinuierlich zu mischen, um sicherzustellen, dass gleich viele fluoreszierende Perlen in jedes der Löcher gegeben werden. Erstellen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve für jeden Kontrollantikörper, indem Sie unterschiedliche Konzentrationen der betreffenden Antikörper in Volumina von maximal 20 Mikrolitern hinzufügen.Incubieren Sie die Proben mit den Perlen und Antikörpern nun zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Bindung der Antikörper an die Perlen zu ermöglichen, kurz bevor die Perlen fertiggestellt sind. Verdünnen Sie eine Probe von THP-1-Zellen auf 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in Medium. Geben Sie anschließend 200 µL der Zellen zu jeder Probe hinzu.Incubieren Sie die Zellen schließlich über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem stationären Inkubator mit den Antikörper-beschichteten Perlen, wobei die Zellen und Perlen durch Schwerkraft sedimentieren können. Am nächsten Tag entfernen Sie vorsichtig 100 Mikroliter Überstand aus jedem Wells, ohne das Zellpellet zu stören. Fixieren Sie die Zellen in 100 µL 4 % Paraformaldehyd und pipettieren Sie anschließend, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen und zu mischen.Laden Sie nun die Platte in den HTS-Plattenleser eines Hochdurchsatz-Durchflusszytometers, um eine automatisierte Datenerfassung zu ermöglichen. Die Fluoreszenzintensität einer einzelnen Zelle wird erfasst und aufgezeichnet. Anhand dieser Fluoreszenzintensität wird anschließend die Anzahl der von jeder Zelle phagozytierten Beads bestimmt, wodurch die phagozytische Aktivität der getesteten Antikörperprobe definiert wird.Es sollte eine klare Unterscheidung zwischen Antikörperproben von betroffenen und nicht betroffenen Probanden bestehen. In dieser Abbildung zeigt das FACS-Histogramm einer Antikörperprobe von einem HIV-negativen Probanden, dargestellt durch die schwarze Kurve, und von einem HIV-positiven Probanden, dargestellt durch die graue Kurve, die erhöhte Phagozytose, die durch das Vorhandensein antigenspezifischer Antikörper verursacht wird.Die optimale Empfindlichkeit dieses Assays hängt von der Sättigung der Kügelchen mit biotinyliertem Antigen ab, wie hier gezeigt. Es wurde festgestellt, dass zwei Mikrogramm Antigen pro Mikroliter Kügelchen die sättigende Konzentration für dieses Antigen darstellen. Diese Dosis-Wirkungs-Kurve zeigt die unterschiedliche Fähigkeit von Antikörperproben der Probanden, Phagozytose über einen Antikörperkonzentrationsbereich von 0,05 bis fünf Mikrogramm pro Milliliter zu induzieren.Diese unterschiedliche Phagozytose kann entweder durch Unterschiede in der Titerkonzentration oder durch Unterschiede in den FC-Domänen-Eigenschaften, wie der IgG-Unterklasse oder dem Glykosylierungszustand, verursacht werden. Wenn TP-eins-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, zeigt sich eindeutige Evidenz für die Phagozytose von Kügelchen. Dieses Standbild von TP-eins-Zellen nach Inkubation mit antikörperopsonierten grünen Kügelchen und nicht opsonierten roten Kügelchen demonstriert das Fehlen einer phagozytotischen Aufnahme in Abwesenheit von Antikörpern, da ausschließlich die grünen Kügelchen von den TP-eins-Zellen zytophagosiert wurden.Wenn die Zeitraffermikroskopie durchgeführt wird, ist die antikörperspezifische phagozytäre Aufnahme fluoreszierender Kügelchen noch eindrücklicher. Die hier sichtbaren grün fluoreszierenden Kügelchen sind antikörpermarkiert. Die rot fluoreszierenden Kügelchen dienen als negative Kontrolle. Nach diesem Verfahren können weitere Tests zur Antikörperfunktion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Eigenschaften der Antikörperantwort auf eine Infektion oder Impfung zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die phagozytische Aktivität von Antikörperserien mithilfe von Durchflusszytometrie mit hoher Durchsatzleistung bestimmt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit klinischen Blut- und Plasmaproben äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die Einhaltung sicherer Handhabungsverfahren getroffen werden müssen, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

determining-the-phagocytic-activity-of-clinical-antibody-samples

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Nagre, N., et al. Phagozytose und Bakterienbeseitigung der Alveolaren Makrophagen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Bewertung der komplementrezeptorvermittelten Phagozytose mit roten Blutkörperchen von Schafen, die mit IgM und Komplement opsonisiert sind, gefolgt von deren Aufnahme durch Mausmakrophagen. Das Ausmaß der Phagozytose wird quantifiziert, indem ein blaues chromogenes Produkt gemessen wird, das durch hämoglobinkatalysierte Oxidation von Diaminofluoren...

Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Das Video zeigt einen in vitro opsonophagozytären Tötungsassay unter Verwendung einer Co-Kultur von humanen Neutrophilen mit Streptococcus pneumoniae. Antikörper und Komplementproteine erleichtern die Opsonisierung der Bakterien, so dass Neutrophile Bakterien erkennen und abtöten können, was eine erfolgreiche opsonophagozytäre Aktivität von Neutrophilen zeigt.

Bewertung der opsonophagozytären Abtötungsaktivität gegen bakterielle Krankheitserreger

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Phagozytose-Assay mit markierten und opsonisierten Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten durch Monozyten. Die Durchflusszytometrie identifiziert die Fluoreszenz in Monozyten und bestätigt damit die erfolgreiche Identifizierung opsonisierter Erythrozyten durch Phagozytose.

Ein Assay zur Quantifizierung der Antikörper-vermittelten Phagozytose von parasiteninfizierten Erythrozyten

Dieses Video zeigt einen Monozyten-Monolayer-Assay, der primäre Monozyten aus peripherem Blut verwendet, um die Fcγ-Rezeptor-vermittelte Phagozytose mit Poly-D-Antikörper-opsonisierten R2R2 roten Blutkörperchen zu bewerten.

Ein Assay zur Untersuchung der fcγ-Rezeptor-getriebenen Phagozytose in Monozyten-Monoschichten

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten. Fluoreszenzmarkierte Mikrosphären, die an einen Antigen-Antikörper-Komplex konjugiert sind, werden mit einer aus der Muttermilch isolierten Zellsuspension kombiniert, um eine Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose durch die phagozytischen Leukozyten zu induzieren. Nach der Markierung der Zellen mit Antikörpern gegen das gemeinsame Leukozytenantigen (CD45) wird die...

Ein In-vitro-Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose durch Phagozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Der phagosomale pH-Wert beeinflusst die Phagosomenreifung, die Produktion von Oxidationsmitteln, die phagosomale Abtötung sowie die Antigenpräsentation. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ratiometrische Methode zur Messung von Zeitverlaufs- und Endpunkt-pH-Veränderungen in einzelnen Phagosomen in lebenden Fresszellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Der Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) ist ein In-vitro-Assay, der isolierte primäre Monozyten aus dem peripheren Vollblut von Säugetieren verwendet, um die Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelte Phagozytose zu bewerten.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Wir haben Verbesserungen und aktualisierte Methoden für den bestehenden Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) entwickelt, bei dem Makrophagen verwendet werden, um die klinische Relevanz von Erythrozyten-Alloantikörpern in der Transfusionsmedizin und Immunologie besser vorhersagen zu können. Dieser Assay wird als Monozyten-Makrophagen-Assay (M-MA) bezeichnet.

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay

Erfahren Sie, wie Sie die Phagozytoseaktivität antigenspezifischer Antikörper aus klinischen Proben mittels hochdurchsatzfähiger Durchflusszytometrie bestimmen. Diese Methode nutzt fluoreszierende Antigen-beschichtete Mikropartikel und eine monozytäre Zelllinie für standardisierte immunologische Analysen.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

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