Name: Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch and MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Analyse von Wasserstoff/Deuterium-Austausch bei der Aktivierung der Protein-Kinase Pak2 eingesetzt wird. Diese Methode liefert Einblicke in strukturelle Dynamik.

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Diese Arbeit wird teilweise von den National Institutes of Health Grants GM-26738 (an JAT) unterstützt.

1. PAK2 Activation <ol><li> Fügen Sie die entsprechenden vorgeprüft Höhe von Caspase 3 bis 20 ul von 12 mg / ml PAK2 in Puffer A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl und 2 mM DTT bei pH 7,5) und Inkubieren bei 34 ° C für 30 min vollständig zu spalten und zu aktivieren PAK2. </li><li> Analysieren Sie die Spaltprodukte durch SDS-PAGE (10%) und Coommassie-Blau-Färbung. </li><li> Fügen Sie die gespalten PAK2 zur Aktivierung Puffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) bei pH 7,5, in 20 ul bis zu einer Endkonzentration von 10 mg / ml PAK2, und inkubieren bei 34 ° C für 30 min vollständig zu aktivieren PAK2 durch Autophosphorylierung an 8 Standorten. </li><li> Bestätigen Sie volle Spaltung PAK2 durch den Zuzug von p34 und p27-Fragmente durch SDS-PAGE 10 bestimmt. Proper Überprüfung der Autophosphorylierung Bedingungen über Autoradiographie in einem separaten Experiment mit (32 P) ATP oder Massenspektrometrie Phosphopeptide erkennen hergestellt. </li></ol> 2. Identifikationvon Pepsin verdaut PAK2 Fragments <ol><li> 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) bei pH 2,5, die Agaroseperlen zweimal vor waschen zu verwenden. Dann Zentrifuge die Proben für 15 sec bei 2.000 xg, um die Perlen zu entfernen. </li><li> Add PAK2 (20 ug in 2 ul 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl und 2 mM DTT bei pH 7,5) auf 100 ul 0,1% TFA, und inkubieren Sie die Probe für 5 min mit 30 ul Pepsin-konjugierten Agaroseperlen . </li><li> Äquilibrieren einer Reverse-Phase-HPLC-C18-Säule mit einem primären Lösungsmittel-System von 0,1% TFA bei pH 2,5. Das Pepsin verdaut (50 ul) wird eluiert mit einem linearen 100-min Steigung von 0 bis 80% Acetonitril mit 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / min. Die Fraktionen werden alle 2 min gesammelt. </li><li> Trocknen Sie die HPLC-Fraktionen mit einem Speed-Vac (3 h) und Resuspendieren der Proben in eine Lösung von Acetonitril (5 ul) und 0,1% TFA (5 ul) bei pH 2,5. </li><li> Zunächst wird jede Fraktion für Peptide mit der MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Bi abgeschirmtosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Die 16 Fraktionen, die Peptide sind Tandem-Massenspektrometrie mit einem Q-TOF-Massenspektrometer und ein QStar XL oMALDI MS / MS, um die Fragmente zu identifizieren unterzogen. </li><li> Die Abfolge der einzelnen Peptid wird von der Produkt-Ionen durch die Tandem-Massenspektrometrie mit den theoretischen m / z-Verhältnisse auf dem Primär-Sequenz von PAK2 mit dem Protein Prospector Website (basierend generiert überprüft <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Messung von Amid H / D-Austausch <ol><li> Halten Sie alle Lösungen und Reagenzien für die H / D-Austausch bei 25 ° C benötigt in einem Wasserbad. ATP wird in Wasser gelöst und der pH-Wert auf 7,0 vor der Anwendung angepasst. Die zusätzliche 4mm ATP in die D 2 O-Puffer ist ATP dissoziiert verhindern PAK2 nach Verdünnung. </li><li> Initiate H / D-Austausch durch Zugabe von 18 ul der gepufferten D 2 O (50 mM MOPS pH 6.98, 125 mM NaCl) bis 2 ul (20 ug) Von PAK2 in einem Puffer mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 2 mM DTT, was zu einer PAK2 von 10 mg / ml und einem pH-Wert von 7,0 bei 0 ° C. </li><li> Inkubieren Sie die Proben in dreifacher Ausfertigung in der H / D-Austausch für 0, 0,5, 1, 3, 5 und 10 min bzw. 24 h. </li><li> Quench der H / D-Austausch-Prozess durch Zugabe von 180 ul eiskaltem 0,1% TFA bei pH 2,2, die den pH-Wert bringt bis 2,5 in einem Gesamtvolumen von 200 ul. Für die Proben mit ATP, 180 ul eiskalter 0,11% TFA bei pH 2,2 wird verwendet, um den pH-Wert bei 2,5 im vergüteten Zustand zu halten. </li><li> Fügen Sie ein Aliquot (100 ul) jeder abgeschreckten Probe zu 30 ul aktiviert Pepsin-konjugierten Agaroseperlen. Die Pepsinverdau darf auf Eis für fünf Minuten gehen und die Proben werden alle 30 sec gevortext. </li><li> Beenden Sie die Verdauung durch Zentrifugation der Probe für 15 sec bei 5.000 xg bei 4 ° C zur Entfernung des Pepsins. </li><li> Schnell einfrieren der Proben in flüssigem N 2 und bei -80 ° C für nicht mehr als 2Tage vor der MALDI-TOF-Analyse. </li><li> Die Matrix für MALDI beträgt 5 mg / ml α-cyano-4-Hydroxy-Säure (CHCA) in einer Lösung (1:1:1) Acetonitril, Ethanol und 0,1% TFA bei pH 2,5 aufgelöst und statt bei 0 ° C. </li><li> Teilweise Tauwetter jede Probe schnell und mischen Sie 1 ul jeder Probe mit 1 ul der Matrix und der Fleck auf 4 ° C MALDI Zieltafel. </li><li> Tragen Sie eine moderate Vakuum auf die Platte, um die Stellen in 30 sec vor der MALDI-TOF-Analyse trocken. Die Zeit zwischen dem Auftauen der Probe und Spektrum Abruf ist ca. 3 min. </li><li> Erwerben Sie MALDI-TOF-Massenspektren mit einem PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Erfassung von Daten in einem 2-GHz Abtastrate bei 100.000 Datenkanäle mit einem 20.000-V Beschleunigungsspannung und eine 65% Netzspannung mit verzögerter Extraktion mit einem 180-ns-Impuls zu verzögern. Einhundert-Scans sind in 2 min gemittelt. Die MALDI-TOF Instrument ist nicht auf eine Marke oder eine bestimmte Software beschränkt. </li><li> Verwenden Sie die Data Explorer 4.0 Computer-Programm zu calculaß die Deuterierung von jedem Fragment. </li><li> Berechnen Sie die Rückseite Austausch über das Verhältnis der tatsächlichen eingebaut Deuteron Zahl bei 24 Stunden von H / D-Austausch mit allen möglichen austauschbaren Stellen, die das Rückgrat Amiden mit Ausnahme des N-terminalen Amid (Abbildung 1) dividiert wird. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Caspase-Spaltung und Autophosphorylierung durch SDS-PAGE Commassie Färbung überprüft. Inaktive PAK2 ist eine einzelne Bande von 58 kDa. Caspase Spaltung PAK2 abgeschlossen ist, und erzeugt zwei Fragmente, p27 und p34, die separat zu migrieren. Die Migration von autophosphorylierten p27 und p34 zeigt eine Überlappung auf das Gel aufgrund der verzögerten Migration der vollständig phosphoryliert p27-Fragment (Abbildung 2). H / D-Austausch Experimente werden mehrmals zwischen 0 und 10 min (Abbildung 3) durchgeführt. Als Beispiel den zeitlichen Verlauf von Deuterium Einbindung in die m / zpeak 1697,85 inaktiver PAK2 besteht aus mehreren Isotopen Gipfel als durch die Verschiebung der Masse Umschlag im Laufe der Zeit gezeigt, zusammen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Abbildung 1. Gleichung für die Berechnung der Deuterierung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Abbildung 2. Autophosphorylierung und Caspase Spaltung PAK2. Caspase-abgespalten PAK2 (linke Spur), intakte inaktiv PAK2 (mittlere Spur) und Caspase-abgespalten autophosphorylierten PAK2 (rechte Spur) wurden durch SDS-PAGE und Coommassie-Blau-Färbung analysiert. Angepasst von Hsu, YH et al 2. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Abbildung 3. Massenspektrum einer zeitlichen Verlauf der Deuterium-Einbau für inaktive PAK2. Inaktive PAK2 wurde H / D excha unterzogennge für 0-10 min und mittels MALDI-TOF. Ein Beispiel für die erweiterte Isotopenverteilung von MALDI-TOF von Peak m / z 1697,85 während der zeitliche Verlauf der H / D-Austausch wird angezeigt. Die rote gestrichelte Linie zeigt den Durchschnitt der Masse Umschlag und die Verschiebung der Masse Umschlag zeigt die Deuterierung eines Peptids.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
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<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
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<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bezeichnung des Pepsin-verdauten Fragmente ist ein kritischer Schritt der H / D-Austausch zu experimentieren. Eine falsche Identifizierung des Peptids kann zu einer falschen Schlussfolgerung führen. Pepsin verdaut PAK2 wird durch einen Reverse-Phase-HPLC-C18-Säule eluiert, um einen sauberen Hintergrund zu erhalten. In unseren Experimenten wurden insgesamt 40 Fraktionen gesammelt und einer MALDI-TOF. Multiple Peptide könnten in jeder der Fraktionen identifiziert werden. Die Peptide wurden auf Tandem-Massenspektrometrie (Q-TOF MS / MS und oMALDI MS / MS) unterzogen, um ihre Sequenzen zu identifizieren. Die MS / MS-Spektren eines Peptids sollte mindestens drei Produkt-Ionen, um die Identifizierung des Peptids zu bestätigen. Der Data Explorer 4.0-Computer-Programm (Applied Biosystems) führt die anfängliche Basislinienkorrektur und Lärm Filtration. Jedes Spektrum ist auf zwei sequenziert Gipfel kalibriert werden. Wir kalibrieren unser Spektrum von der theoretischen Masse des undeuterierten m / z, die 923,45 und 1697,84 sind. Ter Massengenauigkeit nach der Kalibrierung erreichen 10 ppm. Nach Deuterierung kann der Mono-Isotop eine höhere Masse zu verlagern. Unitary Schritt erhöht, um diese m / z-Verhältnissen ergab die verbesserte Massen mit Deuterierung verbunden. Die Peak-Intensitäten der Masse Umschlag wird keinen Einfluss auf die Deuterierung Ebene. Allerdings sind die Peak-Intensitäten der Isotopen-Peaks in einem bestimmten Masse Umschlag von entscheidender Bedeutung für die Berechnung der durchschnittlichen Masse. Der erste Schritt der Berechnung der eingelagerten Deuteronen ist Subtraktion der peptide mass der nicht-deuterierten Probe aus der deuterierten Probe. Drei weitere Faktoren, die D 2 O verdünnt, die restliche Deuteronen in den Seitenketten und der Rückseite Austausch, müssen weiter in der Berechnung berücksichtigt werden (Abbildung 1). Die D 2 O ist die Verdünnung Faktor D 2 O nach dem Mischen der Probe und D 2 O-Puffer auf die H / D-Austausch zu initiieren. Die verbleibende Deuteron (4,5%) in den Seitenketten der Pepsin-Verdauunged Peptide muss abgezogen werden. Die Back-Austausch ist der unvermeidliche Verlust von Deuterierung in allen deuterierten und Pepsin verdauten Peptide in der Masse Messvorgang. Die meisten Lösungsmittel zugänglich Peptid (m / z = 1105,60) nach 24-stündiger der H / D-Austausch stellt eine vollständige Deuterierung Region. Die eingearbeiteten Deuteron-Nummer für jedes der Peptide ist der Unterschied zwischen dem Schwerpunkt des deuterierten und nicht deuterierten PAK2 peptischen Peptide. Die am höchsten deuterierten Peptid m / z 1105 wurde ausgewählt, um volle Deuterierung stellen, wenn PAK2 wurde bei 24 Stunden von H / D-Austausch. The Back Exchange Ratio wurde von der tatsächlichen eingebaut Deuteron Zahl bei 24 Stunden von H / D-Austausch mit allen möglichen austauschbaren Stellen im Peptid m / z 1105 dividiert wird.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-Hydroxy-Säure </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF-Massenspektrometer </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QStar XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0-Computer-Programm </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amid wasserstoff / deuterium-austausch &amp; maldi-tof-massenspektrometrie analyse der pak2 activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch (H / D-Austausch) gekoppelt mit der Massenspektrometrie wurde in großem Umfang verwendet werden, um die Schnittstelle von Protein-Protein-Interaktionen, Protein Konformationsänderungen, Protein-Dynamik und Protein-Ligand-Interaktionen zu analysieren. H / D-Austausch auf der Amid-Positionen wurde verwendet, um die Deuterierung Preise der Mikro-Regionen in einem Protein durch Massenspektrometrie 1,2,3 messen. Die Auflösung dieser Methode hängt von Pepsinverdau der deuterierten Protein von Interesse in Peptide, die normalerweise im Bereich von 3 bis 20 Resten. Obwohl die Auflösung des H / D-Austausch durch Massenspektrometrie gemessen niedriger ist als die eines einzigen Rückstands Beschluss der Heteronucleare Single Quantum Coherence (HSQC)-Methode der NMR, Massenspektrometrie Messung in H / D-Austausch gemessen wird nicht durch die Größe der eingeschränkten protein 4. H / D-Austausch erfolgt in einer wässrigen Lösung, die Proteinkonformation unterhält durchgeführt. Wir bieten Ihnen eine Methode, die utilIZES die MALDI-TOF zur Detektion 2, statt einer HPLC / ESI (Elektrospray-Ionisation)-MS-System 5,6. Die MALDI-TOF liefert genaue Masse Intensität Daten für die Peptide der verdauten Proteins, in diesem Fall Proteinkinase PAK2 (auch als γ-Pak). Proteolyse von Pak 2 ist in einer Offline-Pepsinverdau durchgeführt. Diese alternative Methode, wenn der Benutzer keinen Zugriff auf eine HPLC und Pepsin Säule verbunden mit der Massenspektrometrie, oder wenn das Pepsin Spalte HPLC nicht in eine optimale Verdauung Karte führen, zum Beispiel, die stark Disulfid-gebundenen abgesondert Phospholipase A 2 (SPLA 2). Mit Hilfe dieser Methode haben wir erfolgreich überwacht Veränderungen in der Deuterierung Ebene während der Aktivierung des PAK2 durch Caspase-3 Spaltung und Autophosphorylierung 7,8,9.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde erfolgreich genutzt, um die Amid-Wasserstoff / Deuterium-Austausch in Proteinkinase PAK2 Aktivierung überwachen.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Der Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch (H/D-Austausch) in Kombination mit der Massenspektrometrie wurde in weitem Umfang eingesetzt, um die Grenzfläche von Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren...

Dieses Experiment zeigt, wie die Massenspektrometrie genutzt werden kann, um den mit Proteinen assoziierten Wasserstoff-Deuterium-Austausch zu überwachen. Strukturelle Veränderungen, die zu Aktivierungszuständen führen, spalten zunächst die Proteinkinase PAC2 mit Caspase-3 und aktivieren anschließend PAC2 durch Autophosphorylierung unter Verwendung von TP als Substrat. Im zweiten Schritt wird PAC2 mit Pepsin verdaut und die resultierenden Proteolyse-Fragmente von PAC2 mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Anschließend werden die Muster des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs von PAC2 durch „Mold-off“-Überwachung des Deuteriumanreicherungsgrades jedes PAC2-Fragments analysiert. Der präzise Grad des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs, ermittelt mittels Mold-to-Analyse, liefert wichtige Einblicke in die Spaltung von PAC2 durch Caspase-3 sowie in die Autophosphorylierung von PAC2.Mithilfe dieser Methode lassen sich Fragestellungen zur Proteindynamik beantworten, wie beispielsweise konformationelle Proteinänderungen, Wechselwirkungen zwischen Protein und Ligand sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber etablierten Methoden wie der HD-Austausch-LCQ-Massenspektrometrie liegt in der Instrumentierung. Zur Analyse der HD-Austauschergebnisse ist kein mit einer Massenspektrometrie gekoppeltes HPLC-System erforderlich, und die Durchführung des Verfahrens ist einfach. Um 0,6 Mikrogramm PAC zwei zu spalten.Fügen Sie Caspase-3 hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei 34 Grad Celsius für 30 Minuten. Überprüfen Sie PAC-2 und die vollständige Spaltung von PAC-2 durch Analyse der Produkte mittels SDS-Page. Für die Aktivierungsreaktion geben Sie das gespaltene PAC-2 zu 20 Mikroliter Aktivierungspuffer B hinzu und inkubieren bei 34 Grad Celsius für 30 Minuten.Verwenden Sie die SDS-Gelelektrophorese, um die Autophosphorylierung durch die Wanderung der P34- und P27-Fragmente nachzuweisen. Waschen Sie die Purin-konjugierten Aro-Beads zunächst zweimal mit je einem Milliliter 0,1 %iger Trifluoressigsäure. Verdünnen Sie zwei Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter-Lösung auf zwei in 100 Mikroliter 0,1 %iger TFA. Geben Sie 30 Mikroliter der gewaschenen Pepsi-konjugierten Agro-Beads hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang.Führen Sie die Equilibrierung einer umgekehrten Phase HPLC-C18-Säule mit 0,1 % TFA bei pH 2,5 durch. Laden Sie nun den Pepin-Digest auf und eluieren Sie mit einem linearen 100-minütigen Gradienten. Sammeln Sie die Fraktionen alle zwei Minuten, nachdem Sie die HPLC-Fraktionen mit einem Speed-VAC-Gerät eingeengt haben.Suspendieren Sie die Proben in fünf µL Acetonitril und 0,1 % TFA bei pH 2,5. Führen Sie als Erstscreening eine Analyse jeder Fraktion auf Peptide mittels Moldy durch, und zwar für alle Fraktionen, die Peptide enthalten.Identifizieren Sie die Fragmente mittels Tandem-Massenspektrometrie. Verwenden Sie die MS-Produktfunktion in Protein Prospector, um Tochterionen mit den theoretischen m/z-Verhältnissen basierend auf der Primärsequenz von PAC zwei abzugleichen. Puffern Sie zunächst alle Lösungen und Reagenzien für den Wasserstoff-Deuterium-Austausch an.Starten Sie den Wasserstoff-Deuterium-Austausch, indem Sie 18 µL Puffer D₂O zu 2 µL einer 10 mg/mL-Lösung hinzufügen. Führen Sie die Reaktionen im Tripelat über einen Zeitverlauf durch. Stoppen Sie die Wasserstoff-Deuterium-Reaktion mit 180 µL eiskalter 0,1 %iger TFA bei pH 2,2.Verteilen Sie nun Aliquote von je 100 Mikroliter Wasserstoff-Deuterium. Geben Sie jeweils zwei Aliquote auf 30 Mikroliter aktivierte pepin-konjugierte Aggregat-Beads. Inkubieren Sie die Pepin-Digestion fünf Minuten lang auf Eis.Wirbeln Sie alle 30 Sekunden, um die Verdauungsreaktionen wirksam durch Zentrifugation zu beenden, um das Pepin schnell zu entfernen. Gefrieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff für die Schimmelanalyse. Bereiten Sie die Matrix vor und lagern Sie sie bei null Grad Celsius; tauen Sie jede Probe teilweise schnell auf.Mischen Sie ein Mikroliter Probe mit einem Mikroliter Matrix und geben Sie die Mischung 30 Sekunden vor der Analyse auf eine mit Schimmel kontaminierte Targetplatte, die auf vier Grad Celsius gehalten wird. Legen Sie ein mäßiges Vakuum an, um die Probe zu trocknen. Die Flecken werden weiterhin verwendet, um Massenspektren zu erfassen, wobei im Durchschnitt 100 Scans innerhalb von zwei Minuten durchgeführt werden.Verwenden Sie das Computerprogramm Data Explorer 4.0, um die Dauer jedes Fragments zu berechnen. Berechnen Sie anschließend den Back-Exchange basierend auf dem Verhältnis des tatsächlich eingebauten Deuteriums nach 24 Stunden Wasserstoff-Deuterium-Austausch zur Gesamtanzahl der möglichen austauschbaren Positionen, die aus den Peptid-Rückgrat-Amiden bestehen, mit Ausnahme des terminalen Amids. In diesem Beispiel werden die Spaltung und die Autophosphorylierung von CASP Bay durch SDS-Page-Kumasi-Färbung verifiziert.Das nicht phosphorylierte inaktive PAC zwei ist ein einzelnes Band von 58 Kilodalton CASP bay's. Die Spaltung von PAC zwei ist vollständig und erzeugt zwei Fragmente, P 27, die regulatorische Domäne, und P 34, die katalytische Domäne, nach der Autophosphorylierung. Die Wanderung des autophosphorylierten P 27 und P 34 zeigt eine Überlappung im Proteingel aufgrund der verzögerten Migration des vollständig phosphorylierten P-27-Fragments im Vergleich zum nicht phosphorylierten PAC zwei.Dieses Massenspektrum zeigt einen zeitlichen Verlauf der Deuterium-Inkorporation für inaktives PAC zwei. Der m/z-Peak bei 1697,85 setzt sich aus mehreren isotopischen Peaks zusammen, wie die Verschiebung des Massen-Envelopes zeigt. Im Zeitverlauf gibt die rote gestrichelte Linie den Durchschnitt des Massen-Envelopes an, und die Verschiebung des Massen-Envelopes zeigt die Dauer eines Peptids an, sobald dieser Zustand erreicht ist.Diese Technik kann in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann, daher sind Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, wie beispielsweise das Anbringen eines Lochs in der Kappe des 1,5-ml-Eppendorf-Gefäßes, bevor es in flüssigen Stickstoff gegeben wird.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.

Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme

Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Sample-Multiplexing-Strategie, die in der Lage ist, die Anzahl der Proben zu erhöhen, die gleichzeitig mit verfügbaren isobarischen Tags analysiert werden können. Die Integration einer Roboterplattform hat den experimentellen Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit erheblich erhöht.

Automatisiertes Sample-Multiplexing mit kombinierter Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobaischer Kennzeichnung (cPILOT)

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung von endogenen Phosphoproteinphosphatasen und ihren interagierenden Proteinen aus Zellen und Geweben und deren Identifizierung und Quantifizierung durch massenspektrometriebasierte Proteomik vor.

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Erfahren Sie, wie MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Analyse von Wasserstoff/Deuterium-Austausch bei der Aktivierung der Protein-Kinase Pak2 eingesetzt wird. Diese Methode liefert Einblicke in strukturelle Dynamik.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch & MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

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