Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch & MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Dieses Experiment zeigt, wie die Massenspektrometrie genutzt werden kann, um den mit Proteinen assoziierten Wasserstoff-Deuterium-Austausch zu überwachen. Strukturelle Veränderungen, die zu Aktivierungszuständen führen, spalten zunächst die Proteinkinase PAC2 mit Caspase-3 und aktivieren anschließend PAC2 durch Autophosphorylierung unter Verwendung von TP als Substrat. Im zweiten Schritt wird PAC2 mit Pepsin verdaut und die resultierenden Proteolyse-Fragmente von PAC2 mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Anschließend werden die Muster des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs von PAC2 durch „Mold-off“-Überwachung des Deuteriumanreicherungsgrades jedes PAC2-Fragments analysiert. Der präzise Grad des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs, ermittelt mittels Mold-to-Analyse, liefert wichtige Einblicke in die Spaltung von PAC2 durch Caspase-3 sowie in die Autophosphorylierung von PAC2.

Mithilfe dieser Methode lassen sich Fragestellungen zur Proteindynamik beantworten, wie beispielsweise konformationelle Proteinänderungen, Wechselwirkungen zwischen Protein und Ligand sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber etablierten Methoden wie der HD-Austausch-LCQ-Massenspektrometrie liegt in der Instrumentierung. Zur Analyse der HD-Austauschergebnisse ist kein mit einer Massenspektrometrie gekoppeltes HPLC-System erforderlich, und die Durchführung des Verfahrens ist einfach. Um 0,6 Mikrogramm PAC zwei zu spalten.

Fügen Sie Caspase-3 hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei 34 Grad Celsius für 30 Minuten. Überprüfen Sie PAC-2 und die vollständige Spaltung von PAC-2 durch Analyse der Produkte mittels SDS-Page. Für die Aktivierungsreaktion geben Sie das gespaltene PAC-2 zu 20 Mikroliter Aktivierungspuffer B hinzu und inkubieren bei 34 Grad Celsius für 30 Minuten.

Verwenden Sie die SDS-Gelelektrophorese, um die Autophosphorylierung durch die Wanderung der P34- und P27-Fragmente nachzuweisen. Waschen Sie die Purin-konjugierten Aro-Beads zunächst zweimal mit je einem Milliliter 0,1 %iger Trifluoressigsäure. Verdünnen Sie zwei Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter-Lösung auf zwei in 100 Mikroliter 0,1 %iger TFA. Geben Sie 30 Mikroliter der gewaschenen Pepsi-konjugierten Agro-Beads hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Führen Sie die Equilibrierung einer umgekehrten Phase HPLC-C18-Säule mit 0,1 % TFA bei pH 2,5 durch. Laden Sie nun den Pepin-Digest auf und eluieren Sie mit einem linearen 100-minütigen Gradienten. Sammeln Sie die Fraktionen alle zwei Minuten, nachdem Sie die HPLC-Fraktionen mit einem Speed-VAC-Gerät eingeengt haben.

Suspendieren Sie die Proben in fünf µL Acetonitril und 0,1 % TFA bei pH 2,5. Führen Sie als Erstscreening eine Analyse jeder Fraktion auf Peptide mittels Moldy durch, und zwar für alle Fraktionen, die Peptide enthalten.

Identifizieren Sie die Fragmente mittels Tandem-Massenspektrometrie. Verwenden Sie die MS-Produktfunktion in Protein Prospector, um Tochterionen mit den theoretischen m/z-Verhältnissen basierend auf der Primärsequenz von PAC zwei abzugleichen. Puffern Sie zunächst alle Lösungen und Reagenzien für den Wasserstoff-Deuterium-Austausch an.

Starten Sie den Wasserstoff-Deuterium-Austausch, indem Sie 18 µL Puffer D₂O zu 2 µL einer 10 mg/mL-Lösung hinzufügen. Führen Sie die Reaktionen im Tripelat über einen Zeitverlauf durch. Stoppen Sie die Wasserstoff-Deuterium-Reaktion mit 180 µL eiskalter 0,1 %iger TFA bei pH 2,2.

Verteilen Sie nun Aliquote von je 100 Mikroliter Wasserstoff-Deuterium. Geben Sie jeweils zwei Aliquote auf 30 Mikroliter aktivierte pepin-konjugierte Aggregat-Beads. Inkubieren Sie die Pepin-Digestion fünf Minuten lang auf Eis.

Wirbeln Sie alle 30 Sekunden, um die Verdauungsreaktionen wirksam durch Zentrifugation zu beenden, um das Pepin schnell zu entfernen. Gefrieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff für die Schimmelanalyse. Bereiten Sie die Matrix vor und lagern Sie sie bei null Grad Celsius; tauen Sie jede Probe teilweise schnell auf.

Mischen Sie ein Mikroliter Probe mit einem Mikroliter Matrix und geben Sie die Mischung 30 Sekunden vor der Analyse auf eine mit Schimmel kontaminierte Targetplatte, die auf vier Grad Celsius gehalten wird. Legen Sie ein mäßiges Vakuum an, um die Probe zu trocknen. Die Flecken werden weiterhin verwendet, um Massenspektren zu erfassen, wobei im Durchschnitt 100 Scans innerhalb von zwei Minuten durchgeführt werden.

Verwenden Sie das Computerprogramm Data Explorer 4.0, um die Dauer jedes Fragments zu berechnen. Berechnen Sie anschließend den Back-Exchange basierend auf dem Verhältnis des tatsächlich eingebauten Deuteriums nach 24 Stunden Wasserstoff-Deuterium-Austausch zur Gesamtanzahl der möglichen austauschbaren Positionen, die aus den Peptid-Rückgrat-Amiden bestehen, mit Ausnahme des terminalen Amids. In diesem Beispiel werden die Spaltung und die Autophosphorylierung von CASP Bay durch SDS-Page-Kumasi-Färbung verifiziert.

Das nicht phosphorylierte inaktive PAC zwei ist ein einzelnes Band von 58 Kilodalton CASP bay's. Die Spaltung von PAC zwei ist vollständig und erzeugt zwei Fragmente, P 27, die regulatorische Domäne, und P 34, die katalytische Domäne, nach der Autophosphorylierung. Die Wanderung des autophosphorylierten P 27 und P 34 zeigt eine Überlappung im Proteingel aufgrund der verzögerten Migration des vollständig phosphorylierten P-27-Fragments im Vergleich zum nicht phosphorylierten PAC zwei.

Dieses Massenspektrum zeigt einen zeitlichen Verlauf der Deuterium-Inkorporation für inaktives PAC zwei. Der m/z-Peak bei 1697,85 setzt sich aus mehreren isotopischen Peaks zusammen, wie die Verschiebung des Massen-Envelopes zeigt. Im Zeitverlauf gibt die rote gestrichelte Linie den Durchschnitt des Massen-Envelopes an, und die Verschiebung des Massen-Envelopes zeigt die Dauer eines Peptids an, sobald dieser Zustand erreicht ist.

Diese Technik kann in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann, daher sind Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, wie beispielsweise das Anbringen eines Lochs in der Kappe des 1,5-ml-Eppendorf-Gefäßes, bevor es in flüssigen Stickstoff gegeben wird.