Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch & MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Dieses Experiment zeigt, wie die Massenspektrometrie zur Überwachung des mit Proteinen verbundenen Deuteriumwasserstoffaustauschs eingesetzt werden kann. Strukturelle Veränderungen, die zu Aktivierungszuständen führen: Zuerst Cleve-Proteinkinase PAC zwei mit Caspase drei und dann Aktivierung von PAC zwei durch Autophosphorylierung unter Verwendung eines TP als Substrat als zweiter Schritt, PAC zwei mit Pepin verdauen und das Prote PAC zwei Fragmente mittels Tandem-Massenspektrometrie analysieren; fahren Sie mit der Analyse von Wasserstoff-Deuterium-Austauschmustern von PAC zwei durch Schimmelpilzüberwachung des Dauerniveaus jedes PAC zwei Fragments fort. Höhe des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs unter Verwendung von Schimmelpilzen zur Analyse. Geben Sie wichtige Einblicke in die Spaltung von Caspase drei und die Autophosphorylierung von PAC zwei.

Diese Methode kann helfen, Fragen der Proteindynamik zu beantworten, wie z. B. Proteinkonformationsänderungen, Proteinligandeninteraktionen und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der HD-Austausch-LCQ-Massenspektrometrie ist entscheidend. Dieses Verfahren erfordert keine HPLC-gekoppelte Massenspektrometrie, um die Ergebnisse des Huntington-Austauschs zu analysieren, und das Verfahren ist einfach zu bedienen: Um 0,6 Mikrogramm PAC zwei zu spalten.

Caspase drei zugeben und die Reaktion 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie PAC zwei und vollständige Spaltung von PAC zwei durch Analyse der Produkte nach SDB-Seite. Für die Aktivierungsreaktion fügen Sie der gespaltenen Packung zwei bis 20 Mikroliter Aktivierungspuffer B hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius.

Verwenden Sie die SDS-Seite, um die Autophosphorylierung durch Migration der P 34- und P 27-Fragmente zu bestätigen. Waschen Sie zuerst die purinkonjugierten Aro-Geschwindigkeiten zweimal mit einem Milliliter 0,1%Trifluoressig verdünnen Sie zwei Mikroliter zu 10 Milligramm pro Milliliter. Packen Sie zwei in 100 Mikroliter 0,1 % TFA, fügen Sie 30 Mikroliter gewaschene Pepsi in konjugierte Agro-Kügelchen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Fahren Sie fort, eine Umkehrphasen-Säule H-P-L-C-C 18 mit 0,1 % TFA bei einem pH-Wert von 2,5 zu äquilibrieren. Laden Sie nun den Pepin Digest und verdünnen Sie ihn mit einem linearen 100-Minuten-Gradienten. Sammeln Sie alle zwei Minuten Fraktionen nach dem Trocknen der HPLC-Fraktionen mit einer Geschwindigkeit VAC reus.

Die Proben werden in fünf Mikrolitern Acetonitril und 0,1 % TFA bei einem pH-Wert von 2,5 suspendiert. Als Einstiegsbild. Analysieren Sie jede Fraktion auf Peptide, indem Sie sie auf alle Fraktionen untersuchen, die Peptide enthalten.

Identifizieren Sie die Fragmente durch Tandem-Massenspektrometrie. Verwenden Sie die MS-Produktfunktion im Proteinprospektor, um Tochterionen und die theoretischen MZ-Verhältnisse basierend auf der primären Sequenz von PAC zwei abzugleichen. Zuerst werden alle Lösungen und Reagenzien für den Austausch von Deuteriumwasserstoff äquilibriert.

Den Austausch von Deuteriumwasserstoff wird durch Zugabe von 18 Mikrolitern Puffer D, zwei O zu zwei Mikrolitern à 10 Milligramm pro Milliliter eingeleitet. Paket zwei, führen Sie Reaktionen in dreifacher Ausfertigung über einen Zeitverlauf durch. Quenden Sie die Deuteriumwasserstoffreaktion mit 180 Mikrolitern eiskalter 0,1%TFA bei pH 2,2.

Verteilen Sie nun 100 Mikroliter Aliquots Deuteriumwasserstoff. Packen Sie zwei bis jeweils 30 Mikroliter aktivierte Pepin-konjugierte Zuschlagstoffkügelchen. Inkubieren Sie diese Pepin-Verdauung fünf Minuten lang auf Eis.

Durch das Vortexen alle 30 Sekunden werden die Aufschlussreaktionen durch Zentrifugation effektiv beendet, um das Pepin schnell zu entfernen. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein, damit sie verschimmelt können. Bereiten Sie die Matrix vor und lagern Sie sie bei null Grad Celsius, tauen Sie jede Probe schnell teilweise auf.

Mischen Sie einen Mikroliter Probe mit einem Mikroliter Matrix und tupfen Sie dann 30 Sekunden vor der Analyse auf eine vier Grad Celsius schimmelige Zielplatte. Wenden Sie zum Trocknen ein mäßiges Vakuum auf die Platte an. Die Flecken nehmen weiterhin schimmelige bis Massenspektren auf, durchschnittlich 100 Scans in zwei Minuten.

Fahren Sie mit dem Computerprogramm Data Explorer 4.0 fort, um die Dauer jedes Fragments zu berechnen. Berechnen Sie dann den Rückaustausch auf der Grundlage des Verhältnisses des tatsächlich eingebauten aufgrund einer Zahl nach 24 Stunden Wasserstoff-Deuterium-Austauschs dividiert durch alle möglichen austauschbaren Stellen, die die Rückgratamide mit Ausnahme des endterminalen Amids sind. In diesem Beispiel werden die Spaltung und die Autophosphorylierung von CASP Bay durch die Kumasi-Färbung auf der SDS-Seite verifiziert.

Das nicht phosphorylierte inaktive PAC two ist eine einzelne Bande von 58 Kilodalton CASP Bay's. Die Spaltung von PAC zwei ist abgeschlossen und erzeugt zwei Fragmente, P 27, die regulatorische Domäne und P 34, die katalytische Domäne nach der Autophosphorylierung. Die Migration von autophosphoryliertem P 27 und P 34 zeigt eine Überlappung auf dem Proteingel aufgrund der verzögerten Migration des vollständig phosphorylierten P 27-Fragments im Vergleich zum nicht phosphorylierten Paket zwei.

Dieses Massenspektrum zeigt einen zeitlichen Verlauf des Deuteriumeinbaus für inaktives PAC zwei. Der MZ-Peak 1697,85 setzt sich aus mehreren Isotopenpeaks zusammen, wie die Verschiebung der Massenhülle zeigt. Im Laufe der Zeit zeigt die rote gestrichelte Linie den Durchschnitt der Massenhülle an und die Verschiebung der Massenhülle zeigt die Dauer eines Peptids nach der Beherrschung.

Diese Technik kann in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff extrem gefährlich sein kann, also treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. ein Loch in die Kappe des 1,5-mil-EOL-Rohrs zu stechen, bevor Sie es in flüssigen Stickstoff geben.