Name: Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Mikroverkapselung menschlicher embryonaler Stammzellen zur effizienten Differenzierung in dopaminerge Neuronen in 3D-Alginate. Diese Methode verbessert die Zell-Zell-Interaktion und ermöglicht die Immunisolierung bei Transplantationen.

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Diese Arbeit wird durch NHMRC Programm Grant # 568969 (PSS) und der Medizinischen Fakultät der University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS) unterstützt.

Alle der unten beschriebenen Verfahren werden unter aseptischen Bedingungen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Reagenzien und Geräte verwendet werden in der untenstehenden Tabelle aufgelistet. 1. Herstellung von 1,1% Alginat (w / v) <ol><li> In 0,275 g gereinigtes Natriumalginat (high Glucuronsäure-Gehalt ≥ 60%, Viskosität&gt; 200 mPa · s, und Endotoxin ≤ 100 EU / g) in einem sterilen 50 ml-Röhrchen und 25 ml sterilem 0,1% Gelatinelösung früheren (0,5 g hergestellt gelatin/500 ml Milli-Q-H 2 O gelöst und durch Autoklavieren). </li><li> Vortex das Rohr für ca. 30 Sekunden, um die teilweise aufzulösen Alginatpulver legen Sie dann das Rohr auf einer Orbitalmischer bei 10 xg über Nacht (Raumtemperatur). </li><li> In 2,778 ml von 9% steriler NaCl (4,5 g NaCl/50 ml Milli-Q-H 2 O) in 25 ml Alginatlösung. Vortex das Rohr für etwa 30 Sekunden durch Zentrifugation bei 95 × g für 5 min. </li><li> Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 °, C für die kurzfristige Lagerung (1-2 Monate) oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung (ungefähr ein Jahr). </li></ol> 2. Vorbereitung von CaCl 2 Fällbad <ol><li> Man löst 14,7 g CaCl 2. 2H 2 O und 2,38 g HEPES in 1 Liter Milli-Q H 2 O. </li><li> Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung mit dem 0,22 um-Filter. </li><li> Fällbad kann bei Raumtemperatur (6-12 Monate) gelagert werden. </li></ol> 3. Herstellung von Lösung Entkapseln <ol><li> In 500 ml Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS), 50 ml 0,5 M EDTA und 5 ml 1 M HEPES. </li><li> Sterilisieren mit einem 0,22 um Filter oder Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Bewahren Sie die decapsulating Lösung bei Raumtemperatur (6-12 Monate). </li></ol> 4. Vorbereitung von Serum-Ersatz (SR) Medium <ol><li> Vor der Einkapselung vorbereiten SR Medium im Voraus, da debeschrieben in der Tabelle von spezifischen Reagenzien und Geräte. </li></ol> 5. Vorbereitung der ROCK-Inhibitor (Y-27632) <ol><li> Verdünnte Y-27632 Pulver in 0,1% humanes Serumalbumin (HSA) in D-PBS, um einen 5 mM Lösung herzustellen. </li></ol> 6. Vorbereitung für die Verkapselung von HES <ol><li> Pre-behandeln die Zellen mit Kulturmedien mit 10 uM von ROCK-Inhibitor (RI) für zwei Stunden bei 37 ° C (vor Licht schützen) ergänzt. </li><li> Nach der Behandlung RI, waschen Sie die Zellen mit D-PBS zweimal verdrängen die Zellen von Kulturplatten enzymatisch mit Accutase für 10 min bei 37 ° C </li><li> Vorsichtig kratzen die Zellen mit der Pipette oder Zellschaber und sammeln sich in einem 15 ml-Tube. Neutralisieren Sie die Accutase mit SR Medium im Verhältnis 1:1. </li><li> Um eine einzelne Zellsuspension herzustellen, filtern Sie die neutralisierte Zellen unter Verwendung eines 40 um Filter zu sammeln und in einem frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Lösung unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. </li&gt; <li> Zentrifugieren der Zellsuspension 95 xg für 5 min und vorsichtig den Überstand verwerfen danach. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten 0,9% NaCl. Zentrifugieren 95 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. </li></ol> 7. Verkapselung der Zellen <ol><li> Eine 1 ml-Spritze an einem weichen Kunststoffschlauch 14G x 2 &quot;IV-Katheter. Dies wird verwendet, um die Zellsuspension auf der Spritzenpumpe geladen werden, wie in 1 gezeigt anzusaugen. </li><li> Die Zellen mit vorgewärmter Alginatlösung in einer Dichte von 1,25 Millionen Zellen / ml Alginat. Vorsichtig mit der Spritze zu mischen und zu vermeiden Blasen zu erzeugen. </li><li> Einrichten des Wulstes Generator, Spritzenpumpe und die Luft-Durchflußmesser wie in 1 gezeigt. Weitere Details dieser Vorrichtungen sind in Tabelle der Reagenzien und Geräten angegeben. </li><li> Mit den Zellen in die Spritze gesaugt, verwerfen Sie den Kunststoffschlauch von IV-Katheter und legen Sie die Spritze mit der Kapselung Maschine. Stellen Sie sicher, dass es eine 10 cm Abstand sein<html> zwischen das Ende der Einkapselungsmaschine und die Sammelstelle wie in 1 gezeigt. </li><li> Kapseln der Zellen, indem die Spritzenpumpe mit 20 ml / h, Luftdurchsatz in 8 l / min und einem Druck von 100 kPa (die Größe der Kapseln können durch Veränderung der Luftmenge geändert werden). </li><li> Sammeln Sie die verkapselten Zellen in eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 20 ml vorgewärmten Fällbad für 7 min, um die Kapseln zu stabilisieren gefüllt. </li><li> Übertragen Sie die verkapselten Zellen durch leichtes Ansaugen in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 20 ml 0,9% NaCl gefüllt. </li><li> Willkommen, dass die Kapseln in den Boden des Röhrchens absetzen dann vorsichtig der Überstand verworfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 0,9% NaCl. </li><li> Resuspendieren Sie die verkapselten Zellen in vorgewärmten Kulturmedium mit der RI (10 uM), Transfer in eine Kulturflasche ergänzt und bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 8. Differenzierung von hES-Encapsulated zu DA-Neuronen ve_content &quot;&gt; Die gekapselte hESC sind mit RI für 3 Tage vor der Differenzierung behandelt. <ol><li> Samen der Maus Stroma-Zelllinie, PA6 Zellen bei einer Dichte von 1,0 x 10 4 pro cm 2 in 0,1% Gelatine beschichteten T75-Kolben und den Zustand der Zellen in PA6 DA neuronalen Differenzierung Medium (Tabelle Materialien) 24 Stunden vor der Differenzierung. </li><li> Übertragen der Kapseln in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, in den Boden des Rohrs zu regeln. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kapseln in PA6 Zelle klimatisierte DA neuronalen Differenzierung Medium. </li><li> Kultur der gekapselte hESC mit der PA6 Zellmonolayer (9 x 10 6 hESCs pro 7,5 x 10 5 PA6-Zellen) für 28 Tage mit einem Medienwechsel an Tag 4 und jeden zweiten Tag danach (ändern nur die Hälfte des Mediums jedes Mal). </li><li> Nach 3 Wochen in Kultur mit PA6-Zellen, zu ergänzen, die neurale Differenzierung DA-Medium mit 100 ng / ml SHH und 100 ng / ml FGF8a für die restliche Woche. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation von Encapsulated hESC <ol><li> Saugen Sie die Kapseln in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, am Boden des Röhrchens zu begleichen. Dann vorsichtig den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Kapseln mit D-PBS zweimal. Lassen Sie die Kapseln am Boden des Röhrchens absetzen entfernen Sie dann den Überstand. </li><li> 5 ml decapsulating Lösung für die Kapseln. Mischen Sie die Suspension gründlich durch Absaugen vor der Inkubation bei Raumtemperatur für 4-5 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die nebennierenlosen Zellen bei 95 xg für 3 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Zellpellets mit D-PBS, gefolgt von Zentrifugation bei 95 × g für 3 min. Wiederholen. </li><li> Die nebennierenlosen Zellen können weiter kultiviert als Mono-oder verwendet für Downstream-Analyse. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Der Durchmesser der Alginat-Mikrokapseln ist 400-500 um. Die Anzahl der Zellen innerhalb der Kapsel war eine Schätzung dered durch Berechnen der Gesamtzahl der Zellen durch die Gesamtzahl von Kapseln pro Lauf unterteilt. Daher wurden etwa 5,0 × 10 4 Zellen pro Kapsel geschätzt. Daraus gehen wir davon aus, dass die maximale Anzahl von Zellen kann die Kapsel enthalten etwa 1,0 x 10 5 ist. Die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC ist&gt; 80% (Abbildung 2) wie durch Verwendung Carboxyfluoresceindiacetat succinimidly Ester (CFDA) / Propidiumiodid (PI)-Assay bestimmt. Wir haben die Bedingungen von HES-Kapselung durch eine Verringerung der Alginat-Konzentration von 2,2% auf 1,1% gesunken und durch Änderung der Fällbad von Bariumchlorid zu Calciumchlorid optimiert. Von diesen Bedingungen haben wir gezeigt, dass nur die Zellen, die mit 1,1% Calciumalginat verkapselt waren, konnten überleben, vermehren sich und bilden EBs in vitro ein. Zur weiteren Optimierung der Bedingungen, die Auswirkungen von Kulturmedien und RI, Y-27632 wurden untersucht. Die Daten, wie in Abbildung 2 und 3 zeigen, dass die präsentierte RI Prévented Dissoziation-induzierten Apoptose und die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht erhalten und gefördert Clusterbildung 1,6. Außerdem war die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC in HFF-CM + RI kultiviert deutlich höher als andere Gruppen ohne RI-Supplementierung, aber das war nicht signifikant unterschiedlich zu gekapselten hESC in SR + RI kultiviert. In ähnlicher Weise erhöhte Zellproliferation mit BrdU-Assay von 25% bis 75% als einzelne Zellen in Cluster (3), entwickelt. Apoptoseassay durch TUNEL zeigte, dass die einzelnen Zellen in Mikrokapseln in der SR-Medium apoptotischen waren (Daten nicht gezeigt), während die abgerufenen Cluster der HFF-CM waren überwiegend negativ für TUNEL. Bis zu einem gewissen Ausmaß, HFF-CM mit bFGF ergänzt gefördert das Überleben und die Proliferation von eingekapselten HES in Abwesenheit von Y-27632. Die Behandlung mit Y-27632 vor (2 Stunden) und nach der Verkapselung (für weitere 4 Tage) deutlich verbesserte Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Clusterbildung von verkapselten hESCin 1,1% Calcium-Alginat-Mikrokapseln. Bisher haben wir gezeigt, dass gekapselten hESC erfolgreich auf definitive Entoderm 1 unterschieden werden. Hier untersuchten wir die Anwendung der Verkapselung von Zellen als 3D-Plattform, um gekapselte hESC in DA-Neuronen zu differenzieren. hESC, die Embryoidkörpern (EB) in Kapseln gebildet waren direkte differenzierte und auf Entkapselung unter den beschriebenen Bedingungen zeigten eine progressive neuronale Morphologie (Abbildung 4) nach 2-3 Tagen Kultur mit mehr als 90% Lebensfähigkeit. Genexpressionsanalysen zeigten eine Down-Regulation von pluripotenten Marker, während OCT4 neuroprogenitor Marker, PAX6 und DA neuronalen Marker, TH wurden nach 7 Tagen der Differenzierung (5A) hochreguliert. Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass differenzierte HES PAX6-positiv (&gt; 80%), aber OCT4-negativ waren am Tag 7. Weitere differenzierte hES zeigte TH-positiv (&gt; 90%) Neuronen nach 21 Tagen (Abbildung 5B). Western-Blot-Analyse zeigte auch,eine Hochregulation der Expression TH ab Tag 14 (5C), während PAX6 Expression wurde nach Tag 21 nach unten reguliert. Im Vergleich dazu die Zellen unter zweidimensionalen (2D)-Umgebung unter ähnlichen Bedingungen kultiviert (zB RI Vorbehandlung für 2 Stunden und RI Nachbehandlung für 3 Tage vor der Differenzierung) gehalten einen hohen Prozentsatz von Pax6-positiven Zellen (&gt; 80 %) während der Differenzierung und Zeit waren nicht so effizient bei der Differenzierung zu TH-positiven Zellen (&lt;60%) wie in 3D-Umgebung durch Kapselung (5A und C) zur Verfügung gestellt.

<ol><li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li>
<li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li>
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<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li>
<li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li>
<li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Mehrere Studien mit embryonalen Stammzellen der Maus und menschlichen embryonalen Stammzellen haben die Vorteile der 3D-Kultur-System in den Bereichen Biomaterialien und Tissue Engineering 2,3 demonstriert. Wir verwendeten Kalzium-Alginat-Mikrokapseln als eine geeignete Plattform, um 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen im Vergleich zu Barium-Alginat studieren seit hESC zeigten signifikant höhere Rentabilität als in Calciumalginat als Barium-Alginat verkapselt. Diese Kultur System ermögli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> Alginat (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> hohe Glucuronsäure Gehalt ≥ 60%, Viskosität&gt; 200 mPa s, und Endotoxin &lt;100 EU / g </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% NaCl </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Typ J1 Wulst Generator </td><td> Nisco Engineering Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser Spritzenpumpe </td><td> New Era Pump Systems Inc </td><td> Modell NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow-Medical-Durchflussmesser </td><td> Gascon-Systeme</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> Human Serum Albumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;IV-Katheter </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout-DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Für SR mittel (basal) </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Für SR Medium (2 mM) </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Für SR-Medium (20%) </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Für SR-Medium (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Für SR Medium (1x) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Für SR-Medium (0,1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Für SR Medium (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow Minimum Essential Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung mittel (basal) </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung Medium (10%) </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung Medium (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Für DA nEURAL Differenzierungsmedium (0,1 mM) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung Medium (0,1 mM) </td></tr><tr><td> Sonic Hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8a (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginat-mikrokapseln als 3d-plattform für die vermehrung und differenzierung von humanen embryonalen stammzellen (hes) auf verschiedenen linien

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) werden als attraktive Alternative Quelle für Zellersatztherapie Schwellenländern, da sie in der Kultur erweitert werden kann, auf unbestimmte Zeit und unterschieden werden, um alle Zelltypen des Körpers. Verschiedene Arten von Biomaterialien wurden auch in Stammzellkulturen verwendet worden, um eine Mikroumgebung imitiert die Stammzellnische 1-3 bereitzustellen. Letzteres ist für die Förderung von Zelle-zu-Zell-Wechselwirkung, Zell-Proliferation und Differenzierung in spezifische Linien als auch Gewebe, unter Angabe eines dreidimensionalen (3D) Umgebung 4 wie Kapselung wichtig. Das Prinzip der Verkapselung von Zellen umfasst Einfangen von lebenden Zellen innerhalb der Grenzen der semipermeablen Membranen in 3D-Kulturen 2. Diese Membranen können für den Austausch von Nährstoffen, Sauerstoff und Impulse über die Membranen, während Antikörper und Immun-Zellen aus dem Wirt, der größer als der Kapsel Porengröße 5 sind ausgeschlossen. Hier vorab wirschickte einen Ansatz zur Kultur und zu differenzieren hESC DA-Neuronen in einer 3D-Mikroumgebung mit Alginat-Mikrokapseln. Wir haben uns verändert den Kulturbedingungen 2, um die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC verbessern. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Zugabe von p160-Rho-assoziierte Coiled-Coil-Kinase (ROCK)-Inhibitor, Y-27632 und menschliche fetale Fibroblast-konditionierten Mediums Serumersatz (HFF-CM) an die 3D-Plattform signifikant erhöht die Lebensfähigkeit der eingekapselten HES in dem die Zellen exprimiert endgültigen Endoderm Markergene 1. Wir haben nun diese 3D-Plattform für die Vermehrung von menschlichen embryonalen Stammzellen und effiziente Differenzierung zu DA-Neuronen verwendet. Protein-und Genexpressionsanalysen nach der letzten Stufe der DA neuronalen Differenzierung zeigte eine erhöhte Expression von Tyrosin-Hydroxylase (TH), ein Marker für die DA-Neuronen,&gt; 100 Falten nach 2 Wochen. Wir stellten die Hypothese, dass unsere 3D-Plattform mit Alginat-Mikrokapseln kann nützlich sein, um die Proliferation zu studieren und gerichtete Differenzierungvon HES auf verschiedenen Linien. Das 3D-System erlaubt auch die Trennung von Feeder-Zellen aus hES während des Prozesses der Differenzierung und hat auch Potenzial für Immun-Isolierung während der Transplantation in der Zukunft.

Wir haben eine Mikroverkapselung Technik als eine effektive Plattform für 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Endoderm und dopaminerge (DA) Neurone optimiert. Es bietet auch eine Chance für Immun-Isolierung von Zellen aus dem Wirt während der Transplantation. Diese Plattform kann für andere Zelltypen angepasst werden.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Humane embryonale Stammzellen (hESC) entwickeln sich zu einer attraktiven alternativen Quelle für die Zellersatztherapie, da sie in Kultur expandiert werden können ...

Dieses Protokoll ist optimiert, um pluripotente humane embryonale Stammzellen einzukapseln und sie in einem 3D-System in dopaminerge Neuronen zu differenzieren. Zunächst behandeln Sie die Kolonien mit Rock-Inhibitor oder RI und dissoziieren sie in Einzelzellen mit Acuat, das mit Natriumalginat gemischt wurde, und führen die Mischung durch die Einkapselungsvorrichtung. Setzen Sie die RI-Behandlung drei Tage lang fort, übertragen Sie die eingeschlossenen Zellen auf PA-sechs-Zellen und differenzieren Sie sie 28 Tage lang.Schließlich zeigen die Analyse der Gen- und Proteinexpression eine höhere Effizienz bei der Generierung dopaminerger Neuronen. Der wesentliche Vorteil dieser speziellen Technik gegenüber dem bestehenden 2D-Differenzierungsprotokoll besteht darin, dass wir versuchen, diese Zellen und zu differenzieren unter 3D-Bedingungen zu kultivieren, und diese 3D-Umgebung bietet die Möglichkeit, die Zellen in hoher Dichte zu vermehren. Außerdem ergibt sich die Gelegenheit, eine bessere Zell-Zell-Interaktion während der Differenzierung zu ermöglichen.Und drittens ermöglicht dies auch eine bessere Differenzierungseffizienz im weiteren Verlauf. Außerdem, wenn ich das hinzufügen darf,

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt die Entwicklung und Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen innerhalb eines dreidimensionalen Gerüsts. Eine Lamininbeschichtung auf dem Gerüst fördert die Zelladhäsion, während ein wachstumsfaktorfreies neuronales Medium die Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen induziert, die ihre Prozesse innerhalb einer porösen Architektur in mehrere Richtungen ausdehnen und eine dreidimensionale Kultur...

Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen in 3D-Kultur mit Hilfe eines porösen Gerüsts

In diesem Video wird ein schrittweises Protokoll für humane embryonale Stammzellen in neuronale Organoide demonstriert. Die Methode beinhaltet die Induktion der Bildung neuronaler Rosetten, gefolgt von einer kontrollierten Reifung und einer abschließenden Kultivierung auf einer hydrophoben Membran, um voll entwickelte neuronale Organoide zu erhalten.

Differenzierung und Reifung humaner embryonaler Stammzellen zu neuronalen Organoiden

Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Wir haben eine Methode zur Verkapselung von pluripotenten Stammzellen (PS-Zellen) in Alginat-Hydrogel-Kapseln mit einer koaxialen Düse etabliert.  Dies verhindert eine übermäßige Aggregation der Zellen und begrenzt die Scherspannung, der Zellen in Suspensionskulturen ausgesetzt sind.  Die Technik ist sowohl auf die Massenproduktion von PS-Zellen als auch auf die Forschung in der Stammzellnische anwendbar.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.

Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Erfahren Sie die Mikroverkapselung menschlicher embryonaler Stammzellen zur effizienten Differenzierung in dopaminerge Neuronen in 3D-Alginate. Diese Methode verbessert die Zell-Zell-Interaktion und ermöglicht die Immunisolierung bei Transplantationen.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien (Video) | JoVE Journal

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

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