Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Dieses Protokoll ist optimiert, um pluripotente menschliche embryonale Stammzellen einzukapseln und sie in einem 3D-System in dopaminerge Neuronen zu differenzieren. Behandeln Sie zuerst die Kolonien mit einem Gesteinsinhibitor oder RI und assoziieren Sie sie zu einzelnen Zellen mit Akuat, das mit Natriumalginat gemischt und durch die Verkapselungsvorrichtung geleitet wird. Setzen Sie die RI-Behandlung drei Tage lang fort, übertragen Sie die verkapselten Zellen auf PA-Sechs-Zellen und differenzieren Sie sich 28 Tage lang.

Letztendlich zeigen Gen- und Proteinexpressionsanalysen eine höhere Effizienz bei der Generierung dopaminerger Neuronen. Der Hauptvorteil dieser speziellen Technik gegenüber dem bestehenden 2D-Differenzierungsprotokoll besteht darin, dass wir versuchen, diese Zellen in einer 3D-Umgebung zu vermehren und zu differenzieren, und diese 3D-Umgebung bietet Ihnen die Möglichkeit, dass Zellen in einer hohen Dichte vermehrt werden können. Und dann bietet es auch die Möglichkeit, eine bessere Zell-zu-Zell-Interaktion für die Differenzierung zu haben.

Und drittens gibt es Ihnen auch eine bessere Effizienz der Differenzierung auf der Strecke. Und wenn ich noch hinzufügen darf, dass diese spezielle Technik auch für andere Arten von Zellen angepasst werden kann, die wir in einer 3D-Umgebung vermehren können. Erinnern Sie sich auch daran, wie zum Beispiel, dass diese spezielle Technik auf der Grundlage der Verwendung eines bestimmten Gesteinsinhibitors optimiert wurde, der die Apoptose der Zellen verhindert und auch die Ablösung der Zelle von den Kulturschalen verhindert.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, am Anfang Schwierigkeiten haben, da diese Technik normalerweise nicht in Gewebekulturen durchgeführt wird. Die folgende Verkapselungstechnik wurde auf der Grundlage der zusammenfassenden Studien von Dr. Dean Dr. Chad zur Anwendung des Alginattyps R-Inhibitor, zur Alginatkonzentration und zu den Einstellungen des Verkapselungsgeräts optimiert. Jamie und Kim, ein Doktorand aus unserem Labor, werden dieses Protokoll nun demonstrieren.

Geben Sie 25 Milliliter sterile 0,1%ige Gelatinelösung zu 275 Milligramm gereinigtem Natriumalginat in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchenwirbel, um das Alginatpulver teilweise aufzulösen. Stellen Sie dann das Rohr über Nacht bei 10 mal G auf einen Orbitalmischer. Geben Sie anschließend 9% steriles Natriumchlorid in die Alginatlösung.

30 Sekunden lang vortexen und dann fünf Minuten lang bei 95 mal G zentrifugieren. Lagern Sie die Alginatlösung bei vier Grad Celsius. Zuerst werden die menschlichen embryonalen Stammzellen in einer dunklen Umgebung mit Kulturmedien vorbehandelt, die mit 10 Mikromolaren Gesteinsinhibitor ergänzt sind.

Zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie nun die Zellen zweimal mit DPBS, um die Zellen enzymatisch zu entfernen. Accutane hinzufügen und 10 Minuten inkubieren.

Bei 37 Grad Celsius werden die Zellen mit einem Zellschaber schonend geerntet und in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt. Neutralisieren Sie das Accutane mit einem gleichen Volumen SL-Medium. Anschließend werden die neutralisierten Zellen durch einen 40-Mikron-Filter in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geleitet.

Verwenden Sie nun ein Hämozytometer, um die Zellen aufzuzählen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, entsorgen Sie das Supinat vorsichtig. Waschen Sie die Zellen dann einmal mit Vorwärmung.

0,9% Natriumchlorid. Zentrifugen Sie Ihren Gewinn und verwerfen Sie das Supinat. Um die menschlichen embryonalen Stammzellen zu verkapseln, beginnen Sie mit Resus, indem Sie die Zellen mit vorwarmer Alginatlösung suspendieren.

Befestigen Sie dazu eine 20-Milliliter-Spritze an einem weichen Kunststoffschlauch und aspirieren Sie Alginat in die Spritze. Mischen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig mit der Spritze, ohne Blasen zu bilden. Aspirieren Sie nun die Zellen in die Spritze.

Entsorgen Sie den Plastikschlauch und befestigen Sie die Spritze an der Verkapselungsmaschine. Fahren Sie mit der Einrichtung der Instrumente für den Bead-Generator, die Spritzenpumpe, den Luftmassenmesser und das Calciumchlorid-Fällungsbad fort. Vergewissern Sie sich, dass zwischen dem Ende der Verkapselungsmaschine und der Entnahmestelle für die Petrischale ein Abstand von 10 Zentimetern vorhanden ist.

Stellen Sie anschließend die Spritzenpumpe auf 10 Milliliter pro Stunde ein. Der Luftdurchsatz beträgt acht Liter pro Minute und einen Druck von 100 Kilo Pascal. Sammeln Sie die verkapselten Zellen sieben Minuten lang in einem vorwarmen Niederschlagsbad.

Übertragen Sie sie dann durch sanftes Absaugen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 20 Millilitern 0,9 % Natriumchlorid, lassen Sie die Kapseln am Boden des Röhrchens absetzen, entsorgen Sie vorsichtig das Supinat und waschen Sie es einmal mit 0,9 % Natriumchlorid. Fahren Sie fort, die verkapselten Zellen in vorwarmem Kulturmedium zu resuspendieren, das mit einem Gesteinsinhibitor ergänzt wird. In einen Kulturkolben umfüllen und drei Tage inkubieren.

Säen Sie die Maus-Stromalinie PA sechs Zellen in einem 0,1 %igen gelatinebeschichteten T 75-Kolben aus und konditionieren Sie dopaminerges neuronales Differenzierungsmedium für 24 Stunden. Füllen Sie die Kapseln in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie sie am Boden des Röhrchens absetzen. Verwerfen Sie das Supinat und resuspendieren Sie die Kapseln in der PA-Sechszellbedingung dopaminerge neuronale Differenzierung.

Mittlere Kultur. Die verkapselten humanen embryonalen Stammzellen werden 21 Tage lang mit der PA-Sechs-Zell-Monoschicht versorgt. Beim Nachfüllen des Mediumswechsels.

Nur die Hälfte der Medien kultiviert jedes Mal die PA-sechs Zellen in dopaminerger neuronaler Differenzierung. Medium eine Woche lang mit induzierenden Faktoren ergänzt. Aspirieren Sie zunächst die Kapseln und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Wenn sich die Kapseln am Boden abgesetzt haben, entsorgen Sie das Supinat. Zweimal mit DPBS waschen und das Supinat wegwerfen. Geben Sie dann fünf Milliliter Entkapselungslösung hinzu und mischen Sie die Suspension gründlich.

Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Zentrifugieren des Pellets werden die Decap-Zellen und das zweimalige Waschen mit DPBS verwendet, um die Decap-Zellen entweder als Monolayer-Kultur oder für die unmittelbare nachgelagerte Analyse zu verwenden. In einem typischen Präparat liegt der Durchmesser von Alginat-Mikrokappen zwischen 400 und 500 Mikrometern.

Hier C-F-D-A-P-I-Assay. Die Ergebnisse bestimmen die grün lebensfähigen verkapselten Zellen bei 80%Analysen der Lebensfähigkeit, Proliferation und Apoptose von verkapselten humanen embryonalen Stammzellen zu verschiedenen Zeitpunkten dienen der Optimierung der Kultivierungsbedingungen. Interessanterweise verhindern die Effekte von Gesteinsinhibitoren die Dissoziations-induzierte Apoptose und erhalten die Lebensfähigkeit der Zellen, was auf ein überlegenes Wachstum von verkapselten humanen embryonalen Stammzellen hinweist, die in H-F-F-C-M plus ri kultiviert wurden.

In diesem Beispiel wird die Zellverkapselung als 3D-Plattform angewendet, um verkapselte menschliche embryonale Stammzellen in dopaminerge Neuronen zu differenzieren. Wie erwartet nimmt die Größe der Embryokörper mit der Zeit zu, wenn die Verkapselungszellen nach zwei bis drei Tagen Kultur eine progressive neuronale Morphologie mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 90% aufweisen. Die Genexpressionsanalyse deutet auf eine Herunterregulierung des pluripotenten Markers OCT 4 hin.

Wichtig ist, dass der Neuro-Vorläufermarker PAC six und der dopaminerge neuronale Marker th nach sieben Tagen der Differenzierung immer noch hochreguliert sind. Darüber hinaus weisen differenzierte humane embryonale Stammzellen nach 21 Tagen mehr als 90%TH positive Neuronen auf. Die westliche Verlustanalyse bestätigt die günstigen Expressionsmuster von TH und PAC sechs unter 3D- gegenüber 2D-Zellkultursystemen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden effektiv durchgeführt werden. Denken Sie daran, die Zellen vor und nach der Verkapselung mit einem Gesteinsinhibitor zu behandeln. Varianteninduktoren oder -inhibitoren können das 3D-Differenzierungsprotokoll für zukünftige Experimente anpassen.

Diese spezielle Technik zur Verkapselung menschlicher ESL und zur Differenzierung in einer 3D-Umgebung oder für das Potenzial für die Zelltherapie bei einer Reihe von Krankheiten, insbesondere der Parkinson-Krankheit.