Name: Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Erfahren Sie, wie funktionelle motorische Einheiten in vitro durch Ko-Kultur menschlicher Muskelzellen mit Rückenmark-Explantaten von Rattenembryonen reproduziert werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Muskelinnervation und Zellphänotypen.

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Unsere Arbeit wird durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF), die Schweizer Initiative in Systembiologie (SystemsX.ch), der Gesellschaft für Muskelkranke USA (MDA), die Association Française contre les Myopathien (AFM), das Vereinigte Mitochondriopathie Stiftung unterstützt (UMDF), die Gebert-Rüf-Stiftung Seltene Erkrankungen Programm (GRF), der Schweizerischen Gesellschaft für Forschung der Muskelerkrankungen (SSEM / FSRMM), die Swiss Life &quot;Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und medizinische Forschung&quot;, der Roche Research Foundation und der Universität Basel.

1. Vorbereitung des Primary Human Muscle Cell Culture <ol><li> Stellen Sie die menschliche Muskelkraft Zellkulturen gemäß der Explantation-Re-Explantation Technik 4. Entfernen Sie zunächst nicht Muskelgewebe aus den Biopsien. Dann betten 1 mm 3 Muskel Explantate in einem Koagulum von Plasma, das Fibroblasten aus den Explantaten entstehen können. </li><li> Die eingebetteten Explantate werden auf einem Plasma-Gelatine beschichtete Schale überführt und lassen Sie sie in normalen Nährmedium wachsen (MEM mit 25% Medium 199, 10% fötalem Rinderserum [FBS], 1% Penicillin / Streptomycin, 10 pg / ml Insulin, ergänzt 10 ng / ml humanen epidermalen Wachstumsfaktor [EGF], 12,5 ng / ml menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor [FGF]) in einer Monoschicht. Die Zellen, die aus den Explantaten entstehen unter diesen Bedingungen sind Muskelzellen. Diese Zellen werden weiter in einer Monoschicht nach dem Entfernen der Explantate wachsen. </li><li> Kultivieren der Zellen aneurally auf 0,1% Gelatine-beschichteten Platten in normalem Wachstumsmedium. Die Zellen könnenaneurally kultiviert und verstärkt nach Bedarf. Es ist besser, Muskelzellen mit einer Passage zwischen 3 und 8 verwenden, um die Co-Kulturen durchzuführen. Es ist wichtig, junge Myotuben innervieren; nach diesem Punkt haben die Co-Kulturen ein hohes Risiko des Scheiterns. Darüber hinaus sollte Myotuben nicht zu groß und zu dick. </li><li> Zwei Tage vor der Innervation vorgesehen ist, die Platte Muskelzellen auf 35 mm-Gewebekulturschalen (oder 6-Well-Platten) in einer Dichte von 500.000 Zellen pro Schale in normalem Wachstumsmedium. Bei dieser Dichte sind die Zellen in der richtigen Konfluenz, um die Fusion am folgenden Tag zu beginnen, und anschließende Innervation am Tag nach. Mit Hilfe dieser Voraussetzungen sind die Myotuben zum richtigen Zeitpunkt für eine optimale Innervation und damit spätere Faser Kontraktion. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie den normalen Nährmedium mit einer Fusion Medium MEM komponierte mit 25% Medium 199, 5% FBS, 10 pg / ml Insulin und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. </li></ol> 2. Isolati<html> auf der Ratte Embryonale Spinal Cord Explantate Das gesamte Verfahren, um die Wirbelsäule zu isolieren Explantate wird unter einem binokularen Mikroskop durchgeführt, in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). <ol><li> Es ist entscheidend, dass die Ratte Embryonen sind zwischen ED 13 und 14 als eine andere Entwicklungsstufe würde das gesamte Verfahren zu gefährden. Opfere eine schwangere Frau mit CO 2 und das gesamte Embryo-Kette in HBSS Medium. Isolieren Sie jedes Embryo und enthaupten sie für Euthanasie. </li><li> Präparieren Sie den Embryo Rückenmark vom Rest des Körpers in einem Stück zu entfernen und umliegenden Muskel-und Bindegewebe. Seien Sie sehr vorsichtig, um die hintere Wurzel Ganglien (DRGs), die an der Wirbelsäule, funktionelle Innervation gewährleisten zu halten. </li><li> Schneiden jedes Rückenmark quer in einer Weise, dass jeder Explantat mindestens 2 DRG gebunden ist (Explantate von 1 mm 3). </li></ol><html> ove_title &quot;&gt; 3. Innervation des menschlichen embryonalen Muskelzellen mit der Wirbelsäule der Ratte Explantate <ol><li> Entfernen Sie das Medium Fusion auf den Muskel-Zellkultur, so dass eine feine Schicht von Medium auf der Monoschicht. </li><li> Legen Sie die Explantate vorsichtig auf die Muskelzelle Schicht, fünf gleichmäßig verteilte Explantate pro 35 mm Schale. </li><li> In sehr langsam, tropfenweise, Fusion Medium auf jede Explantat. Es ist notwendig, Medium für den Muskelzellen hinzu, um zu überleben, aber nicht zu viel, damit die Explantate auf erste haften und Kontakt mit den Zellen. Wenn das Medium nicht richtig aufgenommen wird (zu stark oder zu viel Medium) werden die Explantate zu schweben und wird scheitern, die Muskelzellen zu innervieren. </li><li> Sobald die Explantate zu haften beginnen, ganz oben auf der Fusion mittel-bis 2 ml pro 35 mm Schale, und stellte das Geschirr sehr sorgfältig zurück in den Inkubator. </li></ol> 4. Wartung der heterologen Nerv-Muskel-Co-Kulturen <ol><li> Ändern Sie die Fusion Medium zweimal pro Woche. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. repräsentative Ergebnisse Sobald zwei Tage nach der Innervation, ist es möglich, die Neuriten, die aus jedem Explantat und der Herstellung von Kontakten mit den Muskelzellen, die von den Button-ähnliche Strukturen (Abb. 1) dargestellt zu sehen. Bereits 4-6 Tage nach der Innervation, ein paar einzelne Fasern zur Kontraktion zu starten. Die Wehen bestehen seit vielen Monaten, gewartet indem Sie einfach den Nährboden zweimal pro Woche. Nach ca. 2 Wochen, degeneriert das Rückenmark Explantat selbst, sondern die Innervation konserviert ist. Das ist normal. Eine feine Schicht von Nervenzellen Komponente bleibt auf der Oberfläche der Muskelzelle Schicht. Diese Nervennetzwerk ausreichend ist, um die Funktionalität der Motoreinheit zu halten. Wenn die Explantate im Medium der Tag nach der Innervation schweben, werden sie nie einhalten. Dies geschieht, wenn die Muskelzelle Schichtnicht ausreichend konfluent, oder wenn das Medium zu grob zugegeben. Manchmal werden die Explantat hält aber keine Neuriten hervor. Dies ist wahrscheinlich auf das Fehlen von DRG-ähnliches enthalten. In diesem Fall ebenso wird die Innervation nicht hergestellt werden. Manipulieren Sie das Geschirr sehr sorgfältig in der ersten Woche, als die Explantate noch leicht zu lösen. Um die Fusion Media tauschen, fügen Sie die Flüssigkeit tropfenweise mit einer minimalen Geschwindigkeit zu Zellablösung zu vermeiden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" /> Abbildung 1. Rückenmark Explantate-Muskelzelle Co-Kulturen von Tag 1 bis Tag 15.

<ol><li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li>
<li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord%3A+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li>
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<li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li>
<li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li>
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<li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene%2C+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy%2C+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li>
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<li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex%3A+an+overview+of+current+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Standard+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li>
<li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li>
<li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li>
<li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically%3A+relevance+to+inclusion-body+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Eine physiologische In-vitro-Werkzeug, um Muskel-Zell-Funktion in normalen und pathologischen Kontext zu studieren, ist von höchstem Interesse für die myologists, weil Muskel-Zellkulturen in der Regel nicht rekapitulieren die Bedeutung der mehrere Zellen und Zell-Typ-Verbindungen. Die Zugabe von gereinigtem motorischen Neuronen zu Muskelzellen ist nicht genug, um eine funktionelle Einheit Motors zu erreichen, da die Anwesenheit von Schwann-Zellen für die Innervation effizient zu sein 5 erforderlich i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31095 </td></tr><tr><td> Medium 199 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31153 </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Fetal Clone Perbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td></tr><tr><td> Human-EGF </td><td> Sigma </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Humanen FGF </td><td> Sigma </td><td> F0291 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin-Lösung </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr></tbody></table>

ein functional motor unit in der kulturschale: co-kultur von spinal cord explantate und muskelzellen

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Humane primäre Muskelzellen aneurally in Monoschicht kultiviert sich selten spontan, weil, in Abwesenheit eines Nerven-Komponente, Zelldifferenzierung begrenzt ist und Motorneuronen Stimulation fehlt 1. Diese Einschränkungen erschweren die in vitro-Studie von vielen neuromuskulären Erkrankungen in kultivierten Muskelzellen. Wichtig ist, dass die experimentellen Randbedingungen von einschichtigen, kultivierten Muskelzellen durch funktionelle Innervation der Muskelfasern mit Rückenmark Explantate in Co-Kulturen überwunden werden. Hier zeigen wir die verschiedenen Schritte, um eine effiziente, ordnungsgemäße Innervation von humanen primären Muskelzellen erzielen, was zu Differenzierung und Kontraktion Faser nach dem Verfahren von Askanas 2 entwickelt abzuschließen. Dazu werden Muskelzellen mit Rückenmark Explantate von Rattenembryonen bei ED 13,5 co-kultiviert, mit der Spinalganglien noch an das Rückenmark Scheiben befestigt. Nach ein paar Tagen, fi der MuskelMitglieder starten zu kontrahieren und schließlich zu quergestreiften durch Innervation durch funktionelle Neuriten Projektion aus dem Rückenmark Explantate, dass zu den Muskelzellen verbinden. Diese Struktur kann für viele Monate aufrechterhalten werden, einfach durch einen regelmäßigen Austausch des Kulturmediums. Die Anwendungen dieser sehr wertvolles Werkzeug sind zahlreich, wie es ein funktionierendes Modell für multidisziplinäre Analysen der menschlichen Entwicklung der Muskulatur und Innervation darstellt. In der Tat tritt eine komplette De-novo-neuromuskulären Synapse Installation in einer Kulturschale, so dass eine einfache Messung vieler Parameter bei jedem Schritt in einer grundlegenden und physiologischen Kontext. Nur um ein paar Beispiele, genomische und / oder Proteom-Studien zitieren kann direkt auf die Co-Kulturen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Vor-und postsynaptischen Effekte gezielt und separat an der neuromuskulären Synapse beurteilt werden, da beide Komponenten aus verschiedenen Spezies stammen,Ratte und Mensch, beziehungsweise. Der Nerv-Muskel-Co-Kultur kann auch mit menschlichen Muskelzellen von Patienten mit Muskel-oder neuromuskuläre Erkrankungen 3 isoliert durchgeführt werden, und kann somit als Screening-Instrument für Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden. Schließlich wird keine spezielle Ausrüstung, sondern eine regelmäßige BSL2 erforderliche Hilfe zu einer funktionellen Einheit Motor in der Kulturschale zu reproduzieren. Diese Methode ist somit sowohl für den Muskelaufbau sowie die neuromuskuläre Forschungsgemeinschaften für physiologische und mechanistische Studien der neuromuskulären Funktion wertvoll, in einem normalen Rahmen und Krankheit.

Cultured Muskelzellen sind ein unzureichendes Modell zu rekapitulieren innervierten Muskel<em&gt; In-vivo-</em&gt;. Eine funktionale Motoreinheit reproduziert werden kann<em&gt; In-vitro-</em&gt; Durch Innervation der differenzierten humanen primären Muskelzellen mit Rattenembryo Rückenmark Explantate. Dieser Artikel beschreibt die Co-Kulturen von Rückenmark und Muskelzellen Explantate etabliert werden.

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Aneural in Monolayer kultivierte primäre menschliche Muskelzellen kontrahieren nur selten spontan, da die Zellen in Abwesenheit einer Nervenkomponente ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine funktionelle motorische Einheit in vitro zu reproduzieren. Dies wird erreicht, indem humane primäre Muskelzellen gemeinsam mit isolierten Rückenmarks-Explantaten von Rattenembryonen kultiviert werden. Anschließend werden die Rückenmarksimplantate in der Weise innerviert, dass sie weiterhin mit dem Explantat verbunden sind, das die humanen Muskelzellen versorgt.Die Kultur wird vorsichtig mit Medium versorgt, bis sich die Muskelzellen vollständig differenziert haben. Danach kann das molekulare und/oder zelluläre Phänotyp der differenzierten Muskelzellen mithilfe einer Auswahl molekularer Methoden untersucht werden. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da es zum einen schwierig ist, die Isolierung des Rückenmarks zu erlernen.Und vor allem müssen Sie äußerst vorsichtig sein, wenn Sie das Kulturmedium den neuartigen Muskelzellen hinzufügen. Töten Sie eine trächtige Ratte mit Embryonen zwischen den Stadien ED 12,5 und ED 13,5 human.Seien Sie präzise, da dieser Schritt für den gesamten Vorgang entscheidend ist. Entfernen Sie die Gebärmutter und sammeln Sie die gesamte Embryokette in HBSS-Medium mit 10 % FBS

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Neurowissenschaften

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

Engineered Muskelgewebe hat ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, als Krankheit Modell und auch als alternative Quelle für Fleisch. Hier beschreiben wir die Konstruktion von einem Muskel-Konstrukt, in diesem Fall von der Maus Myoblasten Vorläuferzellen, und die Stimulation durch elektrische Impulse.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Scheibe Kulturen ermöglichen die Manipulation der Embryonalentwicklung durch Gen-und pharmakologische Störungen. Allerdings müssen Kulturbedingungen sicherzustellen, dass eine normale Entwicklung innerhalb der reduzierten Umfeld der Scheibe gehen. Wir stellen ein Protokoll, das normale Entwicklung Rückenmarks erleichtert, um für wenigstens 24 Stunden fort.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das am Rückenmark Scheiben auf Multielektrodenarrays kultiviert, um funktionelle Regeneration propriospinale Verbindungen in vitro-Studie basiert.

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Der axonale Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die Gesundheit des motorischen Neurons. In diesem Protokoll bieten wir eine detaillierte Methode zur Verfolgung des axonalen Transports von sauren Kompartimenten und Mitochondrien in motorischen Neuronaxonen mit mikrofluidischen Kammern.

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Die Skelettmuskulatur besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich residenter Stammzellen, von denen jede einen besonderen Beitrag zur Muskelhomöostase und -regeneration leistet. Hier werden die 2D-Kultur von Muskelstammzellen und die Muskelzellnische in einer ex vivo Umgebung beschrieben, die viele der physiologischen, in vivo und Umwelteigenschaften bewahrt.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

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