Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen dorsalen Neuralrohr-Explan von einem Wachtelembryo in einen gematchten Hühnerembryo zu transplantieren, um die Migration und das Schicksal der Neuralleistenzellen zu verfolgen. Dazu wird zunächst ein kleines Loch in die IGN-Membran des Wirtshühnerembryos gerissen, um Zugang zum Neuralrohr zu erhalten. Der gespendete Wachtelembryo wird dann aus seiner Eizelle entnommen, um ihn für die Transplantatentfernung vorzubereiten.

Im nächsten Schritt wird die interessierende Region aus dem Neuralrohr des Wirtsembryos herausgeschnitten. Eine ähnliche Region wird dann aus dem Neuralrohr des Spenders für die Transplantation herausgeschnitten. Als nächstes wird das gespendete Neuralrohr in das Neuralrohr des Wirts transplantiert.

Schließlich wird der chimäre Embryo bis zum gewünschten Stadium inkubiert, um die bei der Neuralleiste angekommenen Zellen im Organ der Wahl zu erkennen. Letztendlich kann die Migration und Differenzierung von von Spendern stammenden Neuralleistenzellen zu verschiedenen Orten im Wirtsembryo durch Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Mikrodissektion und des Pfropfens eine sehr feine Motorik erfordern und daher schwer zu erlernen sind.

Beginnen Sie damit, alle Rückstände von den Kükeneiern mit lauwarmem Wasser zu waschen. Ordnen Sie die Eier horizontal auf einem Tablett an und markieren Sie dann mit Bleistift die Seiten nach oben, um die Region zu markieren, in der der Embryo lokalisiert werden soll. Für die X-Ovo-Präparation von Spenderembryonen die Wachtelbeine mit der stumpfen Seite inkubieren.

Legen Sie die Eier anschließend in einen 38 Grad Celsius feuchten Brutkasten und schalten Sie die Schaukelfunktion ein. Nachdem die Eier fertig sind, inkubieren Sie die Oberteile, indem Sie sie mit 70% Ethanol besprühen und dann schnell mit einem Kim-Tuch abwischen. Um eine Aufnahme durch das Ei zu vermeiden, legen Sie jedes sterilisierte Ei in der Schale auf einen einzelnen Eierhalter, ähnlich wie die Petrischale, die mit gefalteten Kim-Tüchern ausgekleidet ist. Klopfen Sie dann mit einer sterilisierten AA-Pinzette ein kleines Loch in die Oberseite der Eierschale am spitzen Ende des Eies.

Rüsten Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 18-einhalb-Gauge-Injektionsnadel aus. Führe dann die Nadel mit der Fase zum spitzen Ende des Eies senkrecht in das Loch in der Eierschale ein. Um ein versehentliches Beschädigen des Eigelbs durch Saugen zu vermeiden, reinigen Sie das Loch wie zuvor mit 70%Ethanol und verschließen Sie das Loch mit Klebeband.

Klopfen Sie dann mit der Doppel-A-Pinzette ein weiteres Loch in die markierte Oberseite des horizontalen Beins, nicht ganz an der Spitze. Führen Sie dann eine Seite der gebogenen Iriszange in das Loch parallel zum Ei ein. Die Schale drückt dann auf die Schale und arbeitet in kreisenden Bewegungen.

Schlagen Sie ein Fenster mit einem Durchmesser von zwei Zentimetern in das Hühnerei ein, entsorgen Sie die entfernte Eierschale. Der Embryo sollte als undurchsichtige Scheibe auf dem Eigelb erscheinen. Entsorgen Sie unbefruchtete Eier, die durch einen kleinen weißen Fleck auf der Oberfläche des Eigelbs oder das Fehlen des Blaster-Derms gekennzeichnet sind.

Biegen Sie nun beim Tragen des richtigen Augenschutzes eine 26,5-Gauge-Injektionsnadel in einem 45-Grad-Winkel, beginnend an der Basis der Nadel. Nachdem Sie die gebogene Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben an eine Ein-Milliliter-Spritze befestigt haben, füllen Sie die Nadel mit verdünnter Tusche. Durchstechen Sie die Dottermembran außerhalb des Umfangs des Blasters und schieben Sie die Spitze der Nadel unter den Embryo, nahe an der Oberfläche des Dotters, aber nicht in den Embryonalschichten.

Injizieren Sie dann gerade so viel Tinte, dass der Embryo umrissen wird, und vermeiden Sie die Injektion von Blasen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig heraus. Nun mit einem Stereomikroskop und einer Lichtquelle mit begrenzter Wärmebelastung, wie der hier gezeigten faseroptischen Schwanenhalslampe.

Ordnen Sie die Embryonen nach Hamburger und Hamilton ein. Halten Sie die Bühne auf den Eierschalen fest. Tragen Sie dann zwei bis drei Tropfen warme sterile Ringerlösung auf die Oberfläche der Embryonen auf, um Austrocknung und Kontamination zu verhindern.

Spannen Sie dann Para-Folie über die Oberfläche der Eier, um die Fenster vorübergehend abzudichten. Bereiten Sie anschließend die Wachteleier für die Transplantation vor. Bevor Sie die Eier aus dem Brutkasten nehmen, füllen Sie eine Petrischale mit Ringerlösung.

Öffnen Sie dann die Eizellen auf der stumpfen Seite mit einer gebogenen Pinzette, um den Embryo freizulegen. Machen Sie mit einer Präparierschere vier Schnitte in Form eines Quadrats durch die Zilimembran und das Blaster-Derm außerhalb des Embryos und achten Sie darauf, dass sich alle Schnitte treffen. Fassen Sie dann mit einer gebogenen Iriszange vorsichtig eine Schnittkante an, heben Sie den Embryo aus der Eizelle und übertragen Sie ihn in die vorbereitete Petrischale.

Entfernen Sie zum Schluss vorsichtig die Vitellinmembran mit einer Pinzette Nummer fünf und inszenieren Sie die Embryonen unter einem Präpariermikroskop. Entfernen Sie die Para-Folie vom Embryo des Wirtskükens. Reißen Sie dann mit einer geschärften Wolframnadel ein kleines Loch in die VII-Membran an der gewünschten Stelle des Neuralrohrs.

Geben Sie einen Tropfen Ringerlösung auf den Embryo. Als nächstes verwenden Sie für einseitige Transplantate, wie die, die in diesem Video durchgeführt werden, eine gegossene Glasnadel, um vorsichtig quer versale rostrale und cordale Schnitte in die Mittelhirnregion des Neuralrohrs zu machen, die nicht über das Lumen hinausgehen. Dann beidseitig zwischen dem dorsalen Neuralrohr und dem parialen Mesoderm schneiden.

Trennen Sie schließlich vorsichtig den exzidierten ex explan vom Neuralrohr und entfernen Sie ihn dann aus dem Embryo, indem Sie ihn in eine Mikropipette aus Glas aspirieren. Verwenden Sie zunächst einen Wachtelembryo, der dem Stadium entspricht. Excizieren Sie dann einen ähnlich großen Bereich des Neuralrohrs wie gerade gezeigt und aspirieren Sie den Spender X Explan in eine Mikropipette aus Glas, die Ringerslösung enthält.

Übertragen Sie den X-Plan neben die herausgeschnittene Region des Wirts des Kükens. Richten Sie dann mit einer gezogenen Glasnadel den ex explan aus und führen Sie ihn sanft in den abgetragenen Bereich. Geben Sie vorsichtig ein paar Tropfen Ringerlösung in den Embryo, um eine Austrocknung zu verhindern.

Verschließen Sie abschließend das Fenster mit Klebeband, stellen Sie sicher, dass das Klebeband den gesamten Bereich des Fenstereies versiegelt, bringen Sie das Ei bis zum gewünschten Stadium in den Inkubator zurück, schalten Sie die Schaukelfunktion aus, während Sie die Kyira inkubieren, die X kann zweimal täglich vorsichtig von Hand gedreht werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhöhen. Wenn spätere Entwicklungsstadien ins Visier genommen werden, zeigt dieses repräsentative Bild der transplantierten Region des Neuralrohrs nach sechsstündiger Reinkubation zu HH 11 den erwarteten Einbau des transplantierten Wachtelspendergewebes in das Neuralrohr des Wirtskükens. Dieser Querschnitt durch die transplantierte Region an HH 11 zeigt mit hnk markierte Neurokammzellen, von denen eine lateral vom Neuralrohr weg wandert.

Wachtelzellen, die zum Migrationsstrom der Neuralleistenzellen und zum Neuralrohr beitragen, sind eindeutig mit QCPN gekennzeichnet. In späteren Stadien können aus Wachtel-Neuralleistenzellen abgeleitete Zellen bis zu ihrem endgültigen Zielgewebe zurückverfolgt werden. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, sind QCPN-markierte Zellen in das Meen Chi des Hühnerembryos des Oberkieferfortsatzes eingestreut. Bei E fünf kann der QCPN-Antikörper leicht mit anderen Antikörpern kombiniert werden, um die Differenzierung von von Wachteln abgeleiteten Neuralleistenzellen zu untersuchen.

In der Hostumgebung. Wie hier zu sehen ist, werden aus Wachtel-Neuralleistenzellen abgeleitete trigeminale sensorische Neuronen mit QCPN- und T-UJ-on-Antikörpern markiert. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Gewebe aus Neurokammzellen hervorgehen und welche Gene Neurokammzellen exprimieren, wenn sie sich in verschiedene Gewebe differenzieren.