In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie ein doppelt markierter DNA-Schadenssensor, der zwei Haupttypen von DNA-Strangbrüchen in Gewebeschnitten markiert, zusammengebaut und verwendet wird. Der Sensor besteht aus einem 30 Tumor, einem DNA-Oligonukleotid, das doppelt mit ZI und Rumine markiert ist, sowie einem Enzym, der Vaccinia-Topoisomerase I oder Vac-Topo, die sich selbstständig zusammenbaut. Wenn Vac-Topo an den 30 Tumor bindet, beginnt der Maschinenbetrieb, wenn Topo die Spaltung des Oligonukleotids am drei-prim-Ende der Erkennungssequenz bewirkt, wodurch eine Vac-Topo-aktivierte, Fitzy-markierte Einheit und ein aminmarkierter freier Haarnadelstrang entstehen.

Mit einem terminalen dreiprime Hydroxyl sind die Einheiten kurzlebig und werden schnell wieder zum ursprünglichen Konstrukt zusammengesetzt, das anschließend gespalten wird. In Abwesenheit zusätzlicher extramolekularer DNA-Brüche trennen sich diese beiden Einheiten kontinuierlich und reassemblieren zyklisch. Wenn der molekulare Sensor auf Gewebeschnitte mit DNA-Schäden angewendet wird, bindet die mit Fitz markierte Detektoreinheit gezielt an stumpfe DNA-Enden mit fünfpri­mem Hydroxyl.

Die mit dem R-Domänen-markierte Detektoreinheit ligiert an einen stumpfen, am 5'-Ende phosphorylierten Bruch. Wenn T4-DNA-Ligase vorhanden ist, erhält man Ergebnisse, die mittels Fluoreszenzmikroskopie die Präsenz und Verteilung von DNA-Einzelstrang- und Doppelstrangbrüchen in Zellen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Detektion von HESIs, wie beispielsweise TUNEL, liegt in ihrer höheren Spezifität und der zusätzlichen Information, die durch die Markierung sowohl der selbstautonomen als auch der phagozytotischen Phasen der Apoptose bereitgestellt wird.

Aus Sicht der Nanotechnologie ist der Sensor ein Beispiel für einen biologisch ermöglichten Ansatz, der tatsächliche biologische Strukturen und Architekturen für die Herstellung nichttoxischer, molekularer Geräte nutzt. Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da ihr Erfolg von der Verwendung einer hochaktiven Toro-SOM-Präparation und der korrekten Aufarbeitung der Schnitte abhängt, um eine Überverdauung durch Proteinase K zu vermeiden. Die Gewebeschnitte für dieses Verfahren sollten vor dem Zusammenbau des molekularen Geräts hergestellt werden. Fünf bis sechs Mikrometer dicke Schnitte, geschnitten aus Paraldehyd.

Fest eingebettete Paraffin-Gewebeproben werden empfohlen. Legen Sie den Objektträger mit dem Gewebeschnitt in einen Objektträgerbehälter und entfernen Sie das Paraffin mit Xylol für 15 Minuten. Nach 15 Minuten überführen Sie ihn in ein frisches Xylolbad für zusätzliche fünf Minuten.

Rehydrieren Sie den Schnitt, indem Sie den Objektträger durch diese abgestuften Ethanol-Konzentrationen führen: zweimal 96 % Ethanol je fünf Minuten, danach 80 % Ethanol fünf Minuten, gefolgt von Wasser.

Zweimal je fünf Minuten. Nach der Rehydratisierung die Schnittprobe mit Proteinase K verdauen. Verwenden Sie 100 Mikroliter einer Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter pro Schnittprobe und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Je nach Gewebetyp muss möglicherweise die Verdauungszeit angepasst werden; achten Sie jedoch darauf, eine Überverdauung zu vermeiden, da diese zum Verschwinden des Signals und zur Beschädigung des Schnitts führen kann, sobald die Verdauung abgeschlossen ist.

Spülen Sie den Objektträger zweimal für jeweils 10 Minuten mit destilliertem Wasser. Geben Sie 2 % BSA zur Vorblockierung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Während dieser Zeit bauen Sie die molekulare Maschine wie im nächsten Teil dieses Videos gezeigt zusammen.

Alle Reagenzien für die Zusammenstellung der molekularen Maschine sind für ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern bemessen, was für eine einzelne Detektion in einem Gewebeschnitt durchschnittlicher Größe ausreicht. Das Volumen kann bei Bedarf in einem kleinen Plastikröhrchen entsprechend vergrößert werden. Geben Sie die folgenden Reagenzien in dieser Reihenfolge mit destilliertem Wasser zusammen.

15 % Polyethylenglykol 8.000, T4-DNA-Ligase-Puffer, doppelt markiertes Oligonukleotid, Vaccinia-Topoisomerase I und T4-DNA-Ligase vorsichtig per Pipette mischen. Der molekulare Konstrukt setzt sich in dieser Lösung nahezu augenblicklich selbst zusammen und kann sofort bei Raumtemperatur verwendet werden. Um mit dem Verfahren zur Markierung von DNA-Strangbrüchen zu beginnen, die Vorblockierungslösung vom Objektträger abpipettieren.

Tragen Sie 25 Mikroliter der vollständigen Reaktionsmischung auf jeden Schnitt auf. Legen Sie eine Plastikdeckglas über den Schnitt und geben Sie den Objektträger in eine befeuchtete Kammer. Schützen Sie vor Licht, indem Sie die Kammer mit Aluminiumfolie umwickeln, und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.

Obwohl sowohl Ligase- als auch Topo-Signale nach der einstündigen Inkubation beobachtet werden können, lässt sich das Ligase-Signal in vielen Fällen weiter verstärken. Um das Signal zu verstärken, geben Sie die Reaktionsmischung erneut zu, jedoch ohne vac-Topo und Oligonukleotid eins, dafür mit Oligonukleotid drei und T4-DNA-Ligase, legen Sie ein Plastik-Deckglas auf den Schnitt und inkubieren Sie 18 Stunden in einer befeuchteten Kammer. Am folgenden Tag bei Raumtemperatur tauchen Sie die Probe vorsichtig senkrecht in ein Coplin-Gefäß mit Wasser bei Raumtemperatur ein, um das Deckglas zu entfernen.

Anschließend die Probe dreimal für jeweils 10 Minuten mit destilliertem Wasser waschen. Die Probe mit Natriumbicarbonat-Puffer spülen. Dieser alkalische Spülschritt verstärkt die fitzige Fluoreszenz, die pH-empfindlich ist und unter einem pH-Wert von sieben deutlich abnimmt.

Schließlich bedecken Sie den Schnitt mit einer Anti-Fading-Lösung, die außerdem DPI zur Kontrastfärbung der Kerne enthält, und bringen Sie einen Deckglaser auf. Die Schnitte sind nun bereit für die Fluoreszenzmikroskopie. In dieser Abbildung ist ein Gewebeschnitt des mit Dexamethason behandelten Thymus dargestellt, bei dem die molekulare Maschine DNA-Ein- und DNA-Zwei-Typ-DNA-Strangbrüche mit stumpfen Enden in den kortikalen Thymusbereichen detektiert hat, die einer Apoptose untergehen, sowie grüne zytoplasmatische Fluoreszenz, die auf DNA-Zwei-Typ-Strangbrüche hinweist, und kortikale Makrophagen nach Marx, die das nukleäre Material apoptotischer Thymozyten verdauen.

Dieses Signal wird durch vac topo erzeugt und lokalisiert sich in FGA-Lysosomen mit DNA, die eine fünf-prime Hydroxylgruppe enthält. Doppelstrangbrüche zeigen rote Fluoreszenz, die eine Art von DNA-Brüchen markiert, in den Kernen apoptotischer Thymozyten, die nicht von Makrophagen phagozytiert wurden. Massive Mengen an Thymozyten durchlaufen gleichzeitig Apoptose.

Begleitet von der Entstehung von Doppelstrangbrüchen mit fünfprim-phosphatgruppen, die mittels ligasebasierter Markierung sichtbar gemacht werden. Diese Brüche befinden sich am nuklearen Rand und bilden ringförmige Muster. Alle zellulären Kerne sind durch Gegenfärbung mit DAPI blau dargestellt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets darauf zu achten, dass die Schnitte zwischen den Zugaben der verschiedenen Lösungen niemals austrocknen. Halten Sie außerdem alle enzymatischen Präparationen vor dem Hinzufügen der Schnitte auf Eis und schützen Sie Ihre fluoreszierenden Sonden während der Markierungsreaktion nach der Entwicklung vor Licht. Die Technik ermöglichte die Visualisierung aller Phasen der Heto-Zell-Demontage.

Dieser Sensor selbst ist ein Beispiel für den grünen Nanotechnik-Ansatz bei der Konstruktion von nanoskaligen Partikeln, Sonden und Maschinen. Dieser Ansatz kombiniert künstliche Komponenten mit natürlich vorkommenden molekularen Maschinenteilen. Ziel ist es, Toxizität und unerwünschte biologische Reaktivität dieser hochdispergierten Nanomaterialien auszuschließen.