Silk Film Culture-System für In-vitro- Analyse und Design-Biomaterial

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Seidenfilm-in-vitro-Kultursystem einzurichten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Seidenlösung zur Herstellung des gewünschten Films hergestellt wird. Im zweiten Schritt wird die Seidenlösung auf die Silikonkautschuk-Formoberfläche gegossen und die Folie trocknen gelassen.

Die Seidenfolie wird anschließend für die Zellkultur aufbereitet. Als nächstes wird das Kultursystem in steriler Technik zusammengebaut. Der letzte Schritt besteht darin, die Seidenfolien mit dem gewünschten Zelltyp zu besäen.

Letztendlich können die Oberflächen der Seidenfilmkultur entweder direkt abgebildet oder innerhalb der Kultur untersucht werden. Platten oder Proben können bei Bedarf zur Fixierung und Weiterverarbeitung entnommen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Kultivierung auf Standard-Gewebekulturkunststoffen, besteht darin, dass Seidenfilm-Biomaterialien hochgradig biokompatibel sind und von Forschern leicht auf nachgelagerte In-vivo- und In-vitro-Anwendungen übertragen werden können.

Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen in den Bereichen Zellbiologie und Biomaterialien zu beantworten, wie z.B. wie die Oberflächentopographie genutzt werden kann, um die Zellantwort zu beeinflussen? Obwohl diese Methode einen Einblick in die Reaktion des Hornhautepithels geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen erste In-vitro-Experimente vorläufige Antworten auf komplexere In-vivo-Systeme liefern können. Um mit der Herstellung von Silikonkautschukformen zu beginnen, erhalten Sie die gewünschte topografische Oberfläche für den Guss Für diese Demonstration.

Weit außen wird ein standardmäßiger 100-Millimeter-Siliziumwafer verwendet. PDMS-Verguss- und Katalysatorlösung im Verhältnis neun zu eins, wie in einem gekauften Kit enthalten. Mischen Sie die Lösungen gründlich, um den Aushärtungsprozess einzuleiten.

Nachdem Sie die Oberfläche des Siliziumwafers in einer Gießschale platziert haben, wiegen Sie 4,5 Gramm PDMS-Lösung auf den Siliziumwafer. Nachdem sich die PDMS-Lösung gleichmäßig über den Wafer verteilt hat, decken Sie den Wafer mit einem Deckel der Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern ab und legen Sie ihn zwei Stunden lang auf 10 Millimeter Quecksilbersäule. Um Luftblasen aus der PDMS-Lösung zu entgasen, legen Sie das Gießsetup über Nacht auf eine ebene Fläche in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen und legen Sie den ausgehärteten PDMS-Siliziumwafer in ein 100%iges Ethanolbad.

Bevor Sie das PDMS entfernen, beginnen Sie mit dem Entfernen des PDMS vom Wafer, indem Sie mit einer Rasierklinge die Umfangskante mit einer Pinzette anheben. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig im 100%igen Ethanolbad ab. Achten Sie darauf, dass der Silikonkautschuk-Guss nicht zerreißt, stanzen Sie einzelne PDMS-Formen mit einem 14-Millimeter-Locher aus. Dieser Durchmesser ist so konzipiert, dass er in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte passt.

Um die Seidenlösung zuzubereiten, bringen Sie zwei Liter destilliertes Wasser zum Kochen. Schneiden Sie in einem Glaslautsprecher fünf Gramm Bombex-Maori-Seidenraupenkokons in Drittel, entsorgen Sie stark kontaminierte Kokons, wie durch übermäßige Insektenpartikel auf der inneren Kokonoberfläche angezeigt. Geben Sie 4,24 Gramm Natriumcarbonat langsam zum Volumen des kochenden Wassers, um ein Überkochen zu verhindern.

Sobald sich das Natriumcarbonat aufgelöst hat, die Kokonstücke in das kochende Wasser geben und mit einem teflonbeschichteten Rührstab 40 Minuten lang umrühren. Nach dem Kochen das destillierte Wasser vorsichtig in die Spüle abgießen und den Seidenextrakt von Hand auswringen, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Waschen Sie dann den Seidenextrakt, indem Sie ihn mit einem Liter destilliertem Wasser in ein Plastikbecherglas geben und 20 Minuten lang umrühren.

Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal mit frischem Wasser. Den gewaschenen Seidenextrakt von Hand ausklingen lassen und den Seidenfaserextrakt in eine chemische Haube geben, um ihn 12 Stunden lang trocknen zu lassen. Wiegen Sie am nächsten Tag die getrockneten Seidenfasern, die in der Regel etwa 3,5 Gramm wiegen.

Bereiten Sie dann eine 9,3 molare Lithiumbromidlösung für eine 20%ige Gewichts-zu-Volumen-Lösung von Seide gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Anschließend wird der Seidenextrakt in den Becher gegeben. Gießen Sie die Lithiumbromidlösung über die Seidenfasern.

Achte darauf, dass die Seidenfasern in die Lösung eingetaucht sind. Legen Sie die aufgelöste Seide dann mit einem Laborspatel für vier Stunden in einen 60 Grad Celsius heißen Ofen. Verwenden Sie nach vier Stunden eine Spritze geeigneter Größe, um 12 Milliliter der Seidenlösung aufzuziehen.

Nach dem Einsetzen einer 18-Gauge-Nadel. Injizieren Sie die Lösung am Ende der Spritze in eine Dialysekassette. Nach dem Befüllen der Kassette wird mit der entleerten Spritze die restliche Luft aus der Kassette abgesaugt.

Legen Sie die gefüllte Dialysekassette in einen Liter destilliertes Wasser. Wechseln Sie das Wasser nach einer Stunde, vier Stunden, acht Stunden und dann dreimal alle 12 Stunden, um insgesamt sechs Wechsel zu erhalten. Nach der Dialyse.

Sammeln Sie die Seidenlösung langsam mit der Spritze aus den Kassetten und geben Sie sie in Zentrifugenröhrchen. Die Lösung wird nach dem Zentrifugieren 20 Minuten lang bei 10.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Geben Sie das Super Natin in eine neue Tube.

Nachdem Sie diesen Vorgang ein zweites Mal wiederholt haben, pipettieren Sie zwei 0,5-Milliliter-Seidenlösungsproben in separate kleine Molkeschalen. Stellen Sie die Molkeschalen für 12 Stunden oder bis die Seidenlösung antreibt in einen bei 60 Grad Celsius warmen Ofen. Die Seidenlösung kann bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Wiegen Sie den verbleibenden festen Seidenfilm aus beiden Proben, um die Dichte der Seidenproteinkonzentration der Lösung zu messen. Bereiten Sie PDMS-Gussoberflächen vor, indem Sie durchsichtiges Klebeband verwenden, um Staub zu entfernen. Reinigen Sie anschließend die PDMS-Substrate, indem Sie sie eine Minute lang in 100 % Ethanol einweichen.

Dann herausnehmen und trocknen lassen. Um einen 50 Mikrometer dicken Film herzustellen, verteilen Sie 70 Mikroliter 8%ige Seidenlösung auf PDMS-Formen. Lassen Sie die Seidenfolien mit einem flüssigen Spreizwerkzeug, wie z. B. einer Ein-Milliliter-Spritzenspitze, unbedeckt auf einer Laminar-Flow-Reinbank trocknen, indem Sie einen Luftstromdruck von 150 Pascal für einen Zeitraum von 90 Minuten laufen lassen oder bis die Filme trocken sind.

Sobald die Folien getrocknet sind, legen Sie den gesamten Foliensatz einschließlich der PDMS-Formen für mehr als vier Stunden in eine Wasser- und Kniekammer, um einen wasserunlöslichen Film zu erzeugen. Dabei handelt es sich in der Regel um eine leere getrocknete Kammer mit Wasser am Boden des Beckens, das mit einem Vakuum von 25 Kilopascal gezogen wird, nachdem die Seidenfilme aus der Wasser- und Kniekammer entfernt wurden. Arbeiten Sie an einer Laminar-Flow-Reinbank, um ein 70%iges Ethanolbad in einer 35-Millimeter-Petrischale vorzubereiten.

Legen Sie dann alle Kontrollsubstrate und Edelstahlringe für mindestens 10 Minuten in die Schale, um sie zu sterilisieren. Entfernen Sie anschließend die Seidenfolien mit einer Pinzette von den PDMS-Formen. Tauchen Sie sie in 70 % Ethanol und legen Sie jede Folie in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit einem Milliliter 70 % Ethanol vorgefüllt ist.

Stellen Sie sicher, dass die Musterseite nach oben zeigt, um eine Zelladhäsion zu ermöglichen. Um den Erfolg in diesem Schritt zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Seidenfolien korrekt und steril in die Vertiefungen gelegt werden. Legen Sie die Edelstahlringe auf die SILT-Folien und lassen Sie sie 10 Minuten lang inkubieren. Nach der Probe: Filmwäsche gemäß den Anweisungen im Text, Bereiten Sie die Zelllinie wie dort angewiesen für das Platzieren vor. In dieser Demonstration wird eine humane limbale Hornhautepithelzelllinie als letzter Schritt verwendet: Probe 500 Mikroliter HCLE-Suspension pro Well, typischerweise unter Verwendung einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter, und fahren Sie fort, das gewünschte experimentelle Protokoll durchzuführen. Hier sind rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der HCLE-Zelllinie zu sehen, die am zweiten Tag auf gemusterten und flachen Seidenfilmen haftet.

In der Kultur-HCLE vermehren sich die Kulturen weiter, bis sie am achten Tag auf gemusterten und flachen Oberflächen zusammenfließen. In der Kultur hier werden gemusterte und flache Seidenfilme kultiviert, HCLE-Zellen werden am ersten, vierten und achten Tag mit Kontrollsubstraten aus Glas verglichen. In der Kulturquantifizierung mit SQU-Nukleinsäuregehalt und MTT-Stoffwechselaktivitäts-Assays zeigen die Assay-Daten von HCLE sowohl auf strukturierten als auch auf flachen Seidenfilmsubstraten im Vergleich zu Kontrolloberflächen aus Glas im Laufe der Zeit.

Hier ist eine Zeitraffer-Phasenkontrast-Bildgebung von HCLE-Zellen zu sehen, die über eine gemusterte Seidenfilmoberfläche wandern. Während eines Zeitraums von 18 Stunden wurden die Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter platziert und zwei Stunden lang kultiviert, bevor die Bildgebung zum Vergleich der Zeitraffer-Phasenkontrastbildgebung von HCLE-Zellen, die über eine flache Kontrolloberfläche wandern, über einen Zeitraum von 18 Stunden unter den gleichen Kulturbedingungen gezeigt wird. Sobald die Seidenlösung und der Silikonguss vorbereitet sind, kann diese Technik in acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren

Andere Methoden wie Immunfluoreszenz-Scanning, Elektronenmikroskopie und molekularbiologische Techniken wie Western Blots und Immunoassays sowie chemische Assays wie Zellviabilität, Zellproliferation und Stoffwechselrate können bewertet werden, um die Zellreaktion auf diese verschiedenen kundenspezifischen Designdienstleistungen besser zu verstehen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Seidenlösungen herstellen, benutzerdefinierte Muster, Seidenfilme und Kultur erstellen. Jeder Zelltyp auf diesen Substraten.