MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, 3D-Kokulturmodelle zu erstellen, die als Brustarchitektur- und Mikroumgebungstechnik, oder MAM, bezeichnet werden und für die Live-Cell-Bildgebung von Zell-Zell-Interaktionen in Echtzeit verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Deckgläser mit einer von Fibroblasten abgebauten, also DQ-Kollagen I. Kollagen-I-Matrix beschichtet werden.

Danach wird DQ-kollagenisiertes Kollagen verwendet. Vier. Rekonstituierte Basalmembranmatrix wird auf die erstarrte DQ-Kollagen-Schicht, Kollagen Typ I Matrix mit eingebetteten Fibroblasten, aufgegeben. Im dritten Schritt wird eine epitheliale oder tumoröse Zellsuspension auf die Deckgläser aufgebracht, wodurch die Zellen an das DQ-Kollagen und die vierfach rekonstituierte Basalmembranmatrix andocken können, danach wird das Kulturmedium hinzugefügt.

Schließlich wird die konfokale Mikroskopie zur Durchführung der Vier-D-Bildgebung verwendet, die ein Bild in drei räumlichen Dimensionen sowie über die Zeit hinweg analysiert, und zwar an lebenden Mammakarzinom-Kokulturen. Letztendlich ermöglicht die Vier-D-Bildgebung die Visualisierung und Analyse der dynamischen Interaktionen zwischen Brusttumorzellen und anderen Zellen des Tumormikromilieus, die die Progression zu einem invasiven Phänotyp beeinflussen können. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intravitale Bildgebung besteht darin, dass die in unserem Modell beobachteten Interaktionen zwischen Zellen einer einzigen Spezies stattfinden – nämlich menschliche Tumorzellen und menschliche tumorassoziierte Zellen – und nicht beispielsweise zwischen menschlichen Tumorzellen und murinen Stromazellen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Zusammenbauen der Hauptkernkulturen zunächst visualisiert werden muss und dann mäßige Fähigkeiten und Übung für den Erfolg erfordert. Beginnen Sie damit, einen alkoholsterilisierten rechteckigen Kunststoffdeckel zu platzieren. Führen Sie ihn in eine 35-Millimeter-Kulturschale ein oder verwenden Sie eine IBI tree, 35-Millimeter-mu-Schale.

Anschließend mischen Sie die gewünschte Anzahl an Fibroblasten mit DQ-Kollagen. Verwenden Sie danach eine 100-Mikroliter-Mikropipette, um vorsichtig 70 Mikroliter der Fibroblasten-DQ-Kollagen-Lösung abzupipettieren und gleichmäßig über die gesamte Oberfläche des Deckgläschens zu verteilen. Stellen Sie die Kulturschale 30 Minuten lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Nachdem die Matrizes erstarrt sind, lassen Sie sie 10 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid equilibrieren.

Danach die Schale unter eine Haube stellen, bis sie Raumtemperatur erreicht hat. Fügen Sie 60 Mikroliter DQ-Kollagen, vier rekonstituierte Basalmembranmatrix auf die erstarrte DQ-Kollagen-Schicht und darauf eine Kollagen-eins-Matrix mit eingebetteten Fibroblasten hinzu. Anschließend mit einer Pipettenspitze vorsichtig die DQ-Kollagen-vier-rekonstituierte Basalmembranmatrix gleichmäßig verteilen, wobei darauf geachtet werden muss, die Fibroblasten in der DQ-Kollagen-eins-Kollagen-eins-Matrix nicht zu beschädigen.

Überführen Sie anschließend die Petrischale und die Deckglasabdeckung in den 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für 10 Minuten, während die DQ-Kollagen-vier-rekonstituierte Basalmembranmatrix erstarrt, Trypsin-Augen und zählen Sie die Zellen für die Kokultur. Geben Sie nun 50 Mikroliter der Zellsuspension auf das beschichtete Deckglas und stellen Sie die Schale in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für 40 bis 60 Minuten, damit sich die Zellen an das DQ-Kollagen anheften können. Vier, rekonstituieren Sie eine Basalmembranmatrix; nachdem sich die Zellen an die Matrix angeheftet haben, geben Sie zwei Milliliter Kulturmedium, das 2 % rekonstituierte Basalmembran enthält, in die 35-Millimeter-Schale.

Danach für die gewünschte Zeitspanne inkubieren, bevor die Bildgebung nach dem Waschen mit PBS erfolgt; die Ko-Kulturen mit fünf µM Cell Tracker Orange in MEGM-Medium in einem 37 °C, 5 % CO₂-Inkubator für 45 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation die Ko-Kulturen erneut mit PBS waschen und anschließend in vorerwärmtem MEGM-Medium für 30 Minuten in einem 37 °C, 5 % CO₂-Inkubator inkubieren, bevor die Bildgebung erfolgt. Die Ko-Kulturen werden in niedriger Vergrößerung lebend abgebildet, beispielsweise bei 10× mit einer Wassereintauchlinse an einem konfokalen Mikroskop, wobei optische Schnitte in 10 µm-Abständen über die gesamte Tiefe der Strukturen aufgenommen werden.

Verwenden Sie die optischen Schnitte, um die Bilder mithilfe von Velocity-Software oder einem ähnlichen Programm dreidimensional zu rekonstruieren. Erstellen Sie Filme der 3D-Rekonstruktionen, sodass die Strukturen, Zell-Zell-Interaktionen und Wechselwirkungen mit der umgebenden Matrix visualisiert werden können. In diesem repräsentativen schematischen Diagramm einer Maim-Kokultur wurde eine IBI-Treat-Mu-Schale zunächst mit Kollagen beschichtet, eine mit DQ-Kollagen, eine mit Fibroblasten, wie hier in Magenta dargestellt.

Danach wurde eine zweite Schicht aus rekonstituiertem Basalmembranmaterial, das DQ-Kollagen vier enthielt, hinzugefügt. Anschließend wurden rote Tumorzellen darauf ausplattiert und mit 2 % rekonstituiertem Basalmembranmaterial überzogen. Im Kulturansatz.

Das durch die cremefarbenen Punkte dargestellte Medium wurde bei jedem Mediumwechsel aufgelegt. Die fluoreszierenden Spaltprodukte von DQ-Kollagen Typ I und IV sind in grün dargestellt. Während der 23 Tage dauernden repräsentativen Kultur von MCF 10 DCIS und WS 12 TI als Kokultur kam es hier und in den folgenden Abbildungen zur Proliferation der abgebildeten Zellen, rot dargestellt, sowie zum Abbau von DQ-Kollagen IV und I, hier und in den folgenden Abbildungen grün dargestellt, und zu einer Degradation der Kollagenmatrizen, wie durch die Volumenabnahme der Kokulturen angezeigt.

Dieselben lebenden Co-Kulturen wurden über einen Zeitraum von 23 Tagen beobachtet, wobei Bilder mittels konfokaler Mikroskopie am dritten, 16. und 23. Tag der Co-Kultur aufgenommen wurden. Die Wechselwirkungen in den Mame-Co-Kulturen sind dynamisch und können sich im Verlauf der Zeit verändern. Wie in diesem 3D-Modell der Zell-Mam-Co-Kultur am dritten Tag zu sehen ist, beginnen die Zellen zu diesem Zeitpunkt gerade erst mit der Proliferation in den Matrizes und sind noch relativ stabil, wie das Fehlen grüner Fluoreszenz belegt.

Jedoch, am Tag 16, da die Zellen weiter proliferiert sind, haben sie begonnen, die Matrixstruktur abzubauen, wie hier durch die DQ-Kollagen, ein- und vierfache Spaltprodukte in grün, und das aktive Abbauen der Matrix durch die Zellen, wo Matrix und Zellen gemeinsam fluoreszieren, wie in Gelb beobachtet. Am Tag 23 wurde fast die Hälfte der Matrix durch die schnell proliferierenden Zellen abgebaut, verglichen mit Tag drei, als das Volumen der Co-Kultur 110.000 Kubikmikrometer betrug. Zwischen Tag 16 und 23 hat sich das Volumen in diesem Fall auf nur noch 46.250 Kubikmikrometer verringert.

16 Co-Kultur kann die Proteolyse von DQ-Kollagen vier an der Oberfläche der DCIS-Zellen in Rot sowie die diffuse Proteolyse von DQ-Kollagen eins in Bereichen nahe den Fibroblasten in Weiß beobachtet werden. Die in dieser Co-Kultur verwendete differenzielle Färbung ermöglicht zudem die Beobachtung der unterschiedlichen Migrations- und Proliferationsmuster der beiden Zelltypen nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich Brustkrebs, um die Auswirkungen des Tumor-Makroumfelds auf das Fortschreiten des Krebses zu untersuchen, unter Verwendung von Live-Cell-Imaging zur dynamischen Interaktion zwischen Krebszellen und umgebenden Stroma-Zellen.