In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hela-Zellen mit gedeckelter und unverschlossener mRNA und Transkripten von Gal-Luciferase zu transfizieren und die Zellkultur auf Luziferase-Aktivität zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein T 7-RNA-Synthesekit mit hoher Ausbeute verwendet wird, um sowohl unverschlossene als auch verschlossene mRNA, Transkripte der Gaia-Luciferase, durch In-vitro-Transkription zu synthetisieren. Es werden zwei Methoden zum Verschließen der mRNA demonstriert.

Eine verwendet ein Cap-Analogon während der Transkription und die andere das Vaccinia-Capping-Enzym für das posttranskriptionelle Capping. Der nächste Schritt besteht darin, die gedeckelten und unverschlossenen mRNA-Transkripte in Helizellen zu transfizieren. Letztendlich wird die Luciferase-Aktivität, die aus unverschlossener oder verschlossener mRNA resultiert, in der Helizellkultur mit dem Namen "Super" verglichen.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber der Einrichtung einer eigenen Transkriptionsreaktion besteht darin, dass das T Seven-RNA-Synthesekit mit hoher Ausbeute getestet und optimiert wurde, um RNA-Transkripte mit hoher Ausbeute und vor allem qualitativ hochwertige RNA-Transkripte in voller Länge herzustellen. Dies ist äußerst wichtig für die erfolgreiche RNA-Translation und Expression von funktionell aktivem Protein. Diese Methode bietet also Einblicke in die RNA-Transfektion: In vitro transkribierte RNAs können auch für andere Anwendungen wie Mikroinjektions-Microarray-Analysen, hybridisierungsbasierte Blots und RNA-Struktur- und Funktionsstudien verwendet werden.

Das DNA-Template für diese Beispielreaktion ist ein linearisiertes Plasmid, das das Gaußsche Luciferase- oder Gluc-Gen enthält. Mit einem T-Sieben-Promotor werden sowohl verschlossene als auch nicht verschlossene Produkte synthetisiert. Beginnen Sie damit, die Komponenten aus dem T seven High Yield RNA-Synthesekit aufzutauen und auf Eis zu legen.

Um eine RNA-Kontamination zu vermeiden, tragen Sie Handschuhe und reinigen Sie die Pipetten und andere Materialien gründlich. Die Verwendung von nukleasefreien Pipettenspitzen, Röhrchen und Glaswaren wird dringend empfohlen, um unverschlossene RNA zu synthetisieren. Richten Sie die Reaktion bei Raumtemperatur ein, beginnend mit dem 10 x Puffer und Wasser, gefolgt von den Nukleotiden, dem DNA-Template. Und schließlich die Polymerase-Mischung.

Die Reihenfolge der Reagenzienzugabe ist wichtig für die Synthese von gedeckelter RNA. Stellen Sie mit einem Kappenanalogon ein ähnliches Reaktionsgemisch her, fügen Sie jedoch die Kappenanalogon-Nukleotide hinzu. Nach der Zugabe der Standardnukleotide mischen Sie nun die Reaktionskomponenten durch sanftes Vortexen, pulsieren, drehen und inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden in einem Trockenluftinkubator, während eine interne Kontrolle eine zweite Reaktion zur Synthese von Cap-Transkripten von c Luke aus einem linearisierten Plasmid einrichtet. C Die Luke-Expression wird verwendet, um die Gluc-Expression zu normalisieren.

Entfernen Sie nach der Inkubation das DNA-Template aus jedem Reaktionsgemisch. Fügen Sie 70 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, gefolgt von 10 DNAs, einem Reaktionspuffer und dann zwei Mikrolitern DNAs. Erstens, lassen Sie die DNAs 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Trockenluftinkubator reagieren.

Aufreinigen Sie nun die Reaktionen mit einem beliebigen Spin-Säulen-basierten RNA-Aufreinigungskit und quantifizieren Sie die RNA mit einem NanoDrop TM Spektralphotometer. Beurteilen Sie abschließend die Qualität der RNAs mit den Bioanalysatoren Agilent RNA 6, 000 nano Kitt und Agilent 2100. Für eine Standard-Verschließungsreaktion bringen Sie 10 Mikrogramm der gereinigten, unverschlossenen Gluc-mRNA in 15 Mikroliter nukleasefreies Wasser nach oben.

Dies kann entsprechend skaliert werden. Erhitzen Sie die RNA 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um die Sekundärstrukturen zu stören, und legen Sie sie dann fünf Minuten lang auf Eis. Um die Verschließreaktion in Gang zu setzen, geben Sie den Verschließpuffer, GTP, frisch verdünntes Schneckenmethionin und das Vaccinia-Verschließenzym zu der denaturierten RNA. Die Reaktionskomponenten werden vorsichtig vortext, pulsieren, drehen und inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten in einem Trockenluftinkubator.

Reinigen und analysieren Sie die RNA nach der Inkubation wie am Ende des vorherigen Abschnitts beschrieben. Beginnen Sie mit dem Plattieren von Hela-Zellen. In 28 Vertiefungen einer 48-Well-Platte sollte jede Vertiefung 70 bis 230.000 Zellen und 150 Mikroliter DMEM mit hohem Glukosegehalt enthalten, ergänzt mit 10 % Serum.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen zu 60 bis 90 % konfluent sind, was zwischen 16 und 24 Stunden dauern sollte. Wenn die Zellen fertig sind, bereiten Sie die Transfektionsmischungen vor. Verdünnen Sie die RNA auf eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter.

Richten Sie dann 24 Mikrozentrifugenröhrchen für drei verschiedene Reaktionen ein. Achtmal auf acht Röhren dupliziert. Fügen Sie einen Mikroliter unverschlossene Gluc-RNA, einen Mikroliter gedeckelte Gluc-RNA zur Normalisierung und 25 Mikroliter Serum frei hinzu.

DMEM mit einer Pipette in den nächsten acht Röhrchen immer gut mischen. Richten Sie die gleiche Reaktion ein, aber fügen Sie anstelle der unverschlossenen Gluc-RNA in den letzten acht Röhrchen gekapselte Gluc-RNA hinzu, die mit einem Kappenanalogon hergestellt wurde. Anstelle der Gluc-RNA, die mit einem Cap-Analogon hergestellt wurde, geben Sie jetzt die verschlossene Gluc-RNA aus der Vaccinia-Reaktion in den ersten Satz von acht Röhrchen mit unverschlossener Gluc-RNA, mischen Sie sie in 0,2 Mikroliter mRNA-Boost-Reagenz, gefolgt von 0,2 Mikrolitern.

Transit-mRNA-Reagenz ermöglichen es, dass die Reaktionen nicht länger als fünf Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Beginnen Sie zwei Minuten nach Beginn der Reaktion damit, jede Mischung tropfenweise in eine Vertiefung mit kultivierten Zellen zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den nächsten beiden Röhrchensätzen, die Kappe, analoges Kappengluc, RNA und gedeckelte Gluc-RNA aus der Vaccinia-Reaktion enthalten.

Lassen Sie vier Vertiefungen als Negativkontrollen und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Assay. Die oben genannte Verwendung des Biox GIA Luciferase Assay-Kits für den Gluc-Assay. Bereiten Sie eine frische Assay-Lösung vor, indem Sie 15 Mikroliter Biox-Gluc-Substrat zu 1,5 Millilitern Biox-Gluc-Assay-Puffer hinzufügen.

Die Endmischung nicht verwirbeln. Mischen Sie es durch Tubeninversionen für den CLU-Assay. Bereiten Sie 100 x frisch rekonstituiertes Substrat vor.

Stellen Sie dann die Assay-Lösung her, indem Sie 15 Mikroliter des rekonstituierten Substrats zu 1,5 Millilitern Blu Ciena Luciferase Assay-Puffer hinzufügen. Mischen Sie die C Luke-Assay-Lösung ohne Vortexing und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Lichteinfall. Mit den vorbereiteten Assay-Lösungen.

Messen Sie die Lumineszenz der Zelle mit einem Mikroplatten-Luminometer. Stellen Sie das Luminometer so ein, dass 50 Mikroliter Testlösung über einen Zeitraum von zwei bis 10 Sekunden injiziert werden. Übertragen Sie als nächstes 10 Mikroliter jedes Zellkultur-Supernamens in eine Vertiefung einer 96 schwarzen Platte.

Grundieren Sie den Injektor mit der Testlösung und fahren Sie mit der Lumineszenzmessung fort. Das T seven High Yield RNA-Synthesekit kann bis zu 180 Mikrogramm unverschlossene RNA und 40 bis 50 Mikrogramm verschlossene RNA pro 20-Mikroliter-Reaktion produzieren, wenn es auf dem Agilent 2100 Bioanalysator analysiert wird. Gute Qualität intakt.

Die RNA sollte einen einzelnen scharfen Peak aufweisen, der das RNA-Transkript darstellt. Ein breiter Peak oder mehrere Peaks deuten auf einen RNA-Abbau hin. Es ist auch wichtig, die Größe des R-N-A-R-N-A zu überprüfen.

Transkripte mit einer längeren Länge als erwartet können auf einen unvollständigen Verdau des Template-Plasmids zurückzuführen sein, der Abbau von D-N-A-R-N-A und eine geringere Ausbeute sind in der Regel das Ergebnis von Kontaminanten, die aus dem Template in die Reaktion eingebracht werden. Auf die DNA-Transfektion folgte eine Inkubation und ein Assay der Luciferase-Aktivität. Die Fünf-Prime-Cap-Struktur ist wichtig, um die RNA vor dem Abbau von Exonuklease zu schützen und die Initiation der Translation zu fördern.

Daher ist das RNA-Capping ein wesentlicher Schritt für Transfektionsexperimente. Der Unterschied in der gemessenen Lumineszenz zwischen Zellkulturen, die mit gedeckelten und unverschlossenen Transkripten transfiziert wurden, unterstützt dies deutlich und zeigt auch, dass sowohl die Capping-Techniken mit dem Cap-Analogon als auch die Verwendung des Vaccinia-Capping-Enzyms erfolgreich funktionelle gecappte RNA-Transkripte produzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie qualitativ hochwertige gedeckelte RNA-Transkripte für die Verwendung in der Transfektion und anderen verschiedenen Anwendungen synthetisieren können.