Name: In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie die in vitro Transkription und enzymatische Cappung von Gaussia-Luciferase-mRNA für Transfektionsstudien in HeLa-Zellen. Diese Methode demonstriert zwei Capping-Verfahren zur Optimierung der RNA-Stabilität.

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Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower

RNasen sind üblicherweise auf der Haut, im Haar, im Staub, auf Laborflächen, in Lösungen usw. vorhanden. Tragen Sie Handschuhe und reinigen Sie die Arbeitsfläche, Pipetten usw. gründlich vor der Verwendung, um eine Kontamination mit RNasen zu vermeiden. Die Verwendung nukleasefreier Pipettenspitzen, Röhrchen, Glasgeräte und Reagenzien wird dringend empfohlen.
1. In-vitro-Transkription unter Verwendung des T7 High-yield RNA Synthesis Kit
Die DNA-Vorlage für die Transkriptionsreaktion ist ein linearisiertes Plasmid, das das Gaussia-Luciferase-Gen und einen T7-Promotor upstream der kodierenden Sequenz enthält (Abbildung 1B).
<ol>
	<li>Tauen Sie die Komponenten aus dem T7 High Yield RNA Synthesis Kit auf und bewahren Sie sie auf Eis auf.</li>
	<li>Stellen Sie für nicht kappte RNA die Reaktion bei Raumtemperatur in der folgenden Reihenfolge ein:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Volumen (μl)</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nukleasefreies Wasser*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Reaktionspuffer</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorlagendna*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-RNA-Polymerase-Mix</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gesamt</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*1 μg DNA hinzufügen und mit nukleasefreiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 μl auffüllen. Die Menge an Wasser, die zugegeben werden muss, variiert je nach der Konzentration der Matrizen-DNA.
<ol start="3">
	<li>Für kapptes RNA: Führen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur in der folgenden Reihenfolge durch:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Volumen (μl)</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nukleasefreies Wasser*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Reaktionspuffer</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Cap-Analogon (ARCA) (40 mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorlage-DNA*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-RNA-Polymerase-Mix</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gesamt</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*1 μg DNA hinzufügen und mit nukleasefreiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 μl auffüllen. Die Menge an hinzuzufügendem Wasser variiert je nach der Konzentration der Matrizen-DNA.
<ol start="4">
	<li>Versetzen Sie die Ansätze gründlich durch Vortexen und inkubieren Sie die Reaktionen 2 Stunden bei 37 °C in einem Trockenluftinkubator.</li>
	<li>Synthetisieren Sie mithilfe der Schritte 1,3–1,4 cappierte Transkripte der Cypridina-Luciferase (CLuc) aus einem linearisierten Plasmid, das das CLuc-Gen enthält. Diese mRNA wird zusammen mit den cappierten und nicht cappierten GLuc-mRNAs zur Normalisierung der GLuc-Expression cotransfiziert.</li>
</ol>
2. Entfernung der Matrizen-DNA
Die Transkriptionsreaktionen werden mit DNase I behandelt, um die DNA-Vorlage vor der anschließenden Aufreinigung zu entfernen.
<ol>
	<li>Geben Sie 70 μl nukleasefreies Wasser zu den Transkriptionsreaktionen, gefolgt von 10 μl DNase-I-Reaktionspuffer.</li>
	<li>Geben Sie 2 μl DNase I zu den Reaktionen hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C in einem Trockenluftinkubator.</li>
</ol>
3. Säulenaufreinigung von kapptem und nicht kapptem RNA
<ol>
	<li>Reinigen Sie die kappten und nicht kappten RNA-Stränge mithilfe des MEGAclearKit gemäß den Anweisungen des Herstellers (jeder RNA-Reinigungskit auf Basis von Säulenchromatographie kann verwendet werden).</li>
	<li>Bestimmen Sie die RNA-Menge mit einem NanoDrop-Spektrophotometer.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Qualität der RNA-Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers mithilfe des Agilent RNA 6000 Nano Kit und des Agilent 2100 Bioanalyzer.</li>
</ol>
4. RNA-Kappung unter Verwendung des Vaccinia-Kappungssystems
<ol>
	<li>Nehmen Sie 10 μg der gereinigten, nicht kappten GLuc-mRNA.</li>
</ol>
Eine Standard-Cap-Reaktion kann bis zu 10 μg (100 nt oder größer) RNA kapuzieren. Falls eine größere Menge RNA kapuziert werden muss, kann die Reaktion entsprechend hochskaliert werden.
<ol start="2">
	<li>Erhöhen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 15 μl.</li>
	<li>Erhitzen Sie die RNA bei 65 °C für 10 Minuten, um sekundäre Strukturen zu entfernen. Stellen Sie sie anschließend für 5 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Zur Durchführung der Capping-Reaktion geben Sie 2 μl 10X Capping-Puffer, 1 μl GTP (10 mM), 1 μl frisch verdünntes S-Adenosylmethionin (2 mM) und 1 μl (10 Einheiten) Vaccinia-Capping-Enzym zu den 15 μl denaturierten RNA hinzu.</li>
	<li>Vortexen Sie die Probe vorsichtig, um sie gut zu mischen, und inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten bei 37 °C in einem Trockenluftinkubator.</li>
</ol>
5. Säulenaufreinigung von kapptem RNA
<ol>
	<li>Reinigen Sie die kappte RNA mithilfe des MEGAclear-Kits (jedes auf Säulenchromatographie basierende RNA-Reinigungs-Kit kann verwendet werden).</li>
	<li>Beurteilen Sie die Qualität der RNA-Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Agilent RNA 6000 Nano Kit und dem Agilent 2100 Bioanalyzer.</li>
</ol>
6. Transfektion von HeLa-Zellen mit dem TransIT-mRNA-Transfektionskit
<ol>
	<li>HeLa-Zellen in einer 48-Well-Platte in 150 μl Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (0,7–2,3 × 105 Zellen/Well), ansäen.</li>
	<li>16–24 Stunden bei 37 °C inkubieren, sodass die Zellen 60–90 % konfluent sind.</li>
	<li>Die GLuc- (kappt und unkappiert) und CLuc-RNA auf eine Konzentration von 100 ng/μl verdünnen.</li>
</ol>
Jede Transfektion wird in acht Replikaten durchgeführt.
<ol start="4">
	<li>Stellen Sie 8 Eppendorf-Röhrchen bereit Röhrchen. Geben Sie jedem Röhrchen hinzu 1 μl unkappiertes GLuc-RNA, 1 μl cappiertes CLuc-RNA (zur Normalisierung) und 25 μl des serumfreien DMEM. Gut mischen.</li>
	<li>Richten Sie 8 Eppendorf-Röhrchen ein. Geben Sie in jedes Röhrchen 1 μl cappiertes GLuc-RNA (Cap-Analogon), 1 μl kappiertes CLuc-RNA (zur Normalisierung) und 25 μl des serumfreien DMEM. Gut mischen.</li>
	<li>Richten Sie 8 Eppendorf-Röhrchen ein. Geben Sie in jedes Röhrchen 1 μl cappiertes GLuc-RNA (Vaccinia), 1 μl cappiertes CLuc-RNA (zur Normalisierung) und 25 μl des serumfreien DMEM. Gut mischen.</li>
	<li>Hinzufügen 0.2 μl mRNA-Boost-Reagenz zu dem ersten Satz von 8 Röhrchen hinzufügen und mischen.</li>
	<li>Hinzufügen 0.2 μl TransIT-mRNA-Reagenz zu dem ersten Satz von 8 Röhrchen hinzufügen und mischen.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 2–5 Minuten inkubieren. (Nicht länger als 5 Minuten inkubieren.)</li>
	<li>Geben Sie das Transfektionsgemisch tropfenweise in die Vertiefungen mit HeLa-Zellkulturen (siehe Abbildung 3 für die Plattenpräparation).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7 bis 10 mit dem 2nd und 3rd Sätze mit je 8 Röhrchen</li>
	<li>Übernacht bei 37 °C in 5 % CO₂2.</li>
</ol>
7. Gaussia-Luciferase-(GLuc-)Assay
Analysieren Sie den Überstand aus jedem Well auf GLuc-Aktivität mithilfe des BioLux Gaussia-Luciferase-Assay-Kits wie folgt:
<ol>
	<li>Stellen Sie frisch die Assay-Lösung her, indem Sie 15 μl BioLux GLuc Substrat zu 1,5 ml BioLux GLuc Assay-Puffer hinzufügen (pro Probe werden 50 μl Assay-Lösung benötigt). Bereiten Sie eine ausreichende Menge für die Proben und zur Spülung des Luminometers-Injektors vor (siehe Herstelleranleitung).</li>
	<li>Mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens (nicht wirbeln).</li>
</ol>
Die Lumineszenz wird mit dem Centro LB 960 Mikroplatten-Luminometer von Berthold Technologies gemessen.
<ol start="3">
	<li>Stellen Sie das Luminometer auf ein Injektionsvolumen von 50 μl und eine Integrationszeit von 2–10 Sekunden ein.</li>
	<li>Geben Sie jeweils 10 μl des Zellkulturüberstandes aus jedem Well in eine 96-Well-Schwarzplatte.</li>
	<li>Spülen Sie den Injektor mit der Ansatzlösung vor und führen Sie anschließend die Lumineszenzmessung durch.</li>
	<li>Die Werte aus nicht transfizierten Wells werden als negative Kontrollen verwendet.</li>
</ol>
8. Cypridina-Luciferase-(CLuc-)Assay
Analysieren Sie das Überstand aus jedem Well auf CLuc-Aktivität mithilfe des BioLux Cypridina-Luciferase-Assay-Kits wie folgt:
<ol>
	<li>Rekonstituierten Substrat (100x) frisch gemäß den Anweisungen im Kit-Handbuch herstellen.</li>
	<li>Den BioLux Cypridina Luciferase-Assay-Puffer auftauen und gut mischen (vor Licht schützen).</li>
	<li>Um die CLuc-Assay-Lösung herzustellen, 15 μl des rekonstituierten Substrats (100x) zu 1,5 ml BioLux Cypridina Luciferase-Assay-Puffer hinzufügen (pro Probe werden 50 μl Assay-Lösung benötigt). Reichen Sie Menge für die Proben und zum Spülen der Injektionsnadel des Luminometers vorbereiten (siehe Herstelleranweisungen).</li>
	<li>Mehrere Male durch Umdrehen des Röhrchens gut mischen (nicht wirbeln).</li>
	<li>Die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen (vor Licht schützen).</li>
</ol>
Die Lumineszenz wird mit dem Centro LB 960 Mikroplatten-Luminometer von Berthold Technologies gemessen.
<ol start="6">
	<li>Stellen Sie das Luminometer auf eine Injektion von 50 μl, eine Verzögerung von 1–2 Sekunden und eine Integrationszeit von 2–10 Sekunden ein.</li>
	<li>Geben Sie 10 μl des Zellkulturüberstandes aus jedem Well in eine 96-Well-Schwarzplatte.</li>
	<li>Spülen Sie den Injektor mit der CLuc-Assay-Lösung vor und messen Sie die Lumineszenz.</li>
	<li>Die Werte aus nicht transfizierten Wells werden als negative Kontrollen verwendet.</li>
</ol>
9. Repräsentative Ergebnisse
Mit dem T7 High Yield RNA Synthesis Kit können pro 20-µl-Reaktion bis zu 180 µg nicht kappte RNA und 40 bis 50 µg kappte RNA hergestellt werden. Bei Analyse am Agilent 2100 Bioanalyzer sollte qualitativ hochwertige, intakte RNA einen einzelnen, scharfen Peak aufweisen, der das RNA-Transkript darstellt. Ein breiter oder mehrere Peaks deuten auf RNA-Abbau hin. Es ist außerdem wichtig, die Größe der RNA zu überprüfen. RNA-Transkripte, die länger sind als erwartet, können auf eine unvollständige Verdauung der Template-Plasmid-DNA zurückzuführen sein. RNA-Abbau und geringere Ausbeute sind in der Regel auf Kontaminationen zurückzuführen, die durch die Template-DNA in die Reaktion eingetragen wurden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für ein Elektropherogramm und ein Gelbild, die nach der Analyse von qualitativ hochwertiger, intakter RNA am Bioanalyzer erhalten wurden.
Die Transfektion von HeLa-Zellen mit sowohl kapptem als auch nicht-kapptem GLuc-RNA wird gefolgt von einer Inkubation und der Bestimmung der Luciferase-Aktivität in den Zellkulturüberständen. Die 5'-Cap-Struktur ist wichtig, um die RNA vor der Degradation durch Exonukleasen zu schützen8 und um die Translationinitiierung9 der mRNA zu fördern. Daher ist die RNA-Kappung ein wesentlicher Schritt für Transfektionsexperimente. Die ko-transkriptionelle Methode (Cap-Analogon) liefert etwa 40 μg RNA, die zu 80 % gekappt ist. Das Protokoll unter Verwendung des Vaccinia-Kappungsenzyms kann bis zu 10 μg RNA (100 nt oder größer) pro Reaktion mit nahezu 100 %iger Effizienz kappen.
Abbildung 4 zeigt den Unterschied in der Luciferase-Expression zwischen Kulturen, die mit kappten und unkappierten RNA-Proben transfiziert wurden. Deutlich ist zu erkennen, dass Zellkulturen, die mit gekappter RNA transfiziert wurden, eine deutlich höhere Luciferase-Expression aufweisen im Vergleich zu solchen, die mit ungekappter RNA transfiziert wurden (die keine Luciferase-Aktivität zeigen). Zusätzlich bestätigt Abbildung 4 auch, dass beide Kappmethoden – unter Verwendung eines Kappanalogs und unter Verwendung des Vaccinia-Kappenzyms – erfolgreich funktionelle, gekappte RNA-Transkripte erzeugen, die in Protein translatiert werden können. Der zweiseitige p-Wert, erhalten aus dem t-Test, betrug 0,2583, was darauf hinweist, dass kein signifikanter statistischer Unterschied zwischen den Lumineszenzdaten der beiden Kappmethoden besteht.
<img alt="T7-Transkriptionsdiagramm; DNA-Vorlage, RNA-Transkript; Nukleotidsequenzprozess." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1.">
Abbildung 1A. RNA-Synthese durch T7-RNA-Polymerase
 
<img alt="Plasmidkarten-Diagramm von pCMV-GLuc, 5764 bp; Genexpression, Klonierungsvektoren, Restriktionsstellen." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2."> 
Abbildung 1B. pCMV-GLuc-Vektor, der das GLuc-Gen und einen T7-Promotor enthält.
 
<img alt="Ergebnisse der RNA-Chromatographie; Analyse von gecappter und ungecappter RNA; Elektrophorese-Diagramm" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2."> 
Abbildung 2. Elektropherogramme des Bioanalyzer und Gel-Bild von gecappter und ungecappter RNA. Die X-Achse zeigt die Größe der RNA in Nukleotiden (nt), die Y-Achse stellt Fluoreszenzeinheiten (FU) dar. A) Elektropherogramm von GLuc-mRNA (ungecapped) nach der Reinigung. B) Elektropherogramm von GLuc-mRNA (gecapped mit Vaccinia-Capping-Enzym). C) Elektropherogramm von GLuc-mRNA (gecapped ko-transkriptionell unter Verwendung eines Cap-Analogs). D) Gel-ähnliches Bild, erzeugt vom Bioanalyzer. Die Spur „L“ ist die RNA-Größenleiter, Spur 1 enthält ungecappede GLuc-mRNA, Spur 2 enthält mit Cap-Analog gecappede GLuc-mRNA und Spur 3 enthält mit Vaccinia-Capping-Enzym gecappede GLuc-RNA.
 
<img alt="Plattenlayout-Diagramm für Genexpressionsversuch; Probentypen: entkappelt/kappiert GLuc &amp; CLuc." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3."> 
Abbildung 3. Beispiel für die Plattenanlage zur Transfektion von HeLa-Zellen. Jeder Well enthält ausgesäte HeLa-Zellen mit einer Konfluenz von 60–90 %. Der Transfektionsansatz, bestehend aus der jeweiligen GLuc-RNA (unkappiert, mit Kappanalog kappiert oder mit Vaccinia-Kappierenzym kappiert), kappierter CLuc-RNA (zur Normalisierung), mRNA Boost Reagent und TransIT-mRNA-Reagenz, wird jedem Well zugegeben. Jede Transfektion wird in achtfacher Wiederholung durchgeführt (im Bild Wells gleicher Farbe).
 
 
<img alt="Balkendiagramm der normalisierten Lumineszenz; GLuc-RNA kappt und nicht kappt; Ergebnisse der RNA-Analyse" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4."> 
Abbildung 4.GLuc-Expression in HeLa-Zellen. Gereinigte, kappte und nicht kappte GLuc-mRNA wurde in HeLa-Zellen transfiziert und über Nacht (16 h) bei 37 °C inkubiert. Die Kulturüberstände aus jedem Wells wurden auf GLuc- und CLuc-Aktivität analysiert, und die Lumineszenzwerte wurden aufgezeichnet. Die GLuc-Lumineszenzwerte wurden relativ zu den Lumineszenzwerten der kappten CLuc-RNA normalisiert.
<img alt="GLuc-Lumineszenz-Verhältnisformel, Lumineszenzmessung, Gleichung für normalisierte Werte, RLU." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Gleichung 1">
* Die Lumineszenz nicht transfizierter Zellen wurde von den GLuc- und CLuc-Werten vor der Normalisierung subtrahiert.
 
Marken
BioLux ist eine Marke der New England Biolabs, Inc.
TransIT ist eine eingetragene Marke von Mirus Bio LLC.
MEGAclear ist eine Marke von Ambion.

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<li>Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+ribose+methylation+of+c-mos+mRNA+stimulates+translation+and+oocyte+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis.</a> Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).</li>
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</ol>

Alle Autoren sind Angestellte von New England Biolabs, Inc.

In-vitro-Transkription ist eine nützliche Methode, um hohe Ausbeuten an RNA für eine Vielzahl von Anwendungen zu erhalten. Der Hauptvorteil der Verwendung des T7 High Yield RNA Synthesis Kit liegt darin, dass seine Zusammensetzung optimiert wurde, um hohe RNA-Ausbeuten zu erzielen. Außerdem sind die im Kit enthaltenen Reagenzien frei von kontaminierenden Nukleasen, was zur Synthese von hochwertigen, intakten RNA-Transkripten führt. Das Kit ist so konzipiert, dass es eine hohe Stabilität und Flexibilität bietet und somit zur Herstellung von mRNA, mit Farbstoff markierter RNA, radioaktiv markierten Sonden mit hoher spezifischer Aktivität sowie gecappter RNA verwendet werden kann. Die Kit-Anleitung enthält eine Liste spezifischer Protokolle und zusätzlicher Materialien, die für jede dieser Anwendungen erforderlich sind. Sie beinhaltet auch technische Informationen zur Verwendung von PCR-Produkten und synthetischen DNA-Oligonukleotiden als Vorlagen für die Transkription. Es ist wichtig zu beachten, dass das Transkriptionskit nur DNA-Vorlagen verwenden kann, die einen T7-Promotor enthalten.
Die in diesem Artikel beschriebene Methode demonstriert die posttranskriptionelle RNA-Kappung unter Verwendung des Vaccinia-Kappungsenzyms sowie die kotranskriptionelle Kappung unter Verwendung eines RNA-Kappstruktur-Analogs. Wir konnten zeigen, dass beide Methoden kappte RNA synthetisieren, die nach der Transfektion funktional aktiv ist. Die 5'-Kappstruktur verbessert die Stabilität der RNA und die Translations-Effizienz und ist daher wichtig für Mikroinjektions11- und Transfektions7-Experimente. Die kotranskriptionelle Kappungsmethode erzeugt 40–50 μg einer etwa zu 80 % kappten RNA. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung des 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G-RNA-Kappanalogons (ARCA), das am 3'-Hydroxyl des m7G blockiert ist, die Einlagerung der Kappe in korrekter Orientierung sicherstellt17. Um größere Mengen an RNA zu kappten, können die Standardreaktionen für beide Kappmethoden hochskaliert werden. Allerdings ist die Verwendung des Vaccinia-Kappungssystems kostentechnisch günstiger, da die kotranskriptionelle Kappung ein Kapp-Analogon verwendet, das eine relativ teure Komponente darstellt. Das Vaccinia-Kappungssystem ist zudem die bessere Methode, da es eine Kappungseffizienz von nahezu 100 % aufweist.
Die oben beschriebenen RNA-Kappungsverfahren synthetisieren RNA mit einer Cap-0-Struktur am 5'-Ende. Die Cap-1-Struktur beinhaltet eine zusätzliche Methylierung an der 2'-O-Position des Ribosezuckers des ersten Nukleotids am 5'-Ende der RNA. Es wurde berichtet, dass die Cap-1-Struktur die Translations-Effizienz der RNA erhöht18 und kann durch Verwendung von 2'-O-Methyltransferase20, 21 eingebaut werden.
Die in dieser Arbeit beschriebene Methode kann verwendet werden, um jede gewünschte mRNA zu transkribieren, zu kapptieren und zu transfizieren. Die Luciferasen GLuc und CLuc wurden in diesem Protokoll speziell aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile eingesetzt. Sie werden direkt in das Zellmedium sezerniert, wodurch die Notwendigkeit einer Zelllyse entfällt. Außerdem erzeugen sie eine hohe biolumineszente Signalintensität, und die Aktivitätsassays sind äußerst empfindlich und einfach durchzuführen. Es ist wichtig zu beachten, dass die GLuc-Expression in den Zellen durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden kann, die unabhängig von der Funktionalität der RNA selbst sind. Dazu zählen beispielsweise Pipettierfehler, unterschiedliche Zellzahlen pro Mulde, Transfektionseffizienz usw. Eine Datennormalisierung wird verwendet, um diese Faktoren auszugleichen. In unserem Protokoll ko-transfizieren wir CLuc-RNA als internen Kontrollstandard zusammen mit der GLuc-RNA. Wenn die GLuc-Lumineszenz durch die CLuc-Kontrollwerte dividiert wird, erfolgt eine Normalisierung bezüglich der Fehler und Variabilität bei der Transfektion19.

<table><tbody><tr><td>T7 High Yield RNA-Synthese-Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G-RNA-Cap-Struktur-Analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-frei)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia-Capping-System</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear-Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop-Spektrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT mRNA-Transfektionskit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* Klassisches Flüssigmedium: Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle&amp;rsquo;s Medium, hoher Glucosespiegel</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt;-Luciferase-Assay-Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt;-Luciferase-Assay-Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor, murin</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor, humanes Plazenta</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc-Kontrollplasmid</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transkription und capping von gaussia-luciferase mrna von hela-zelle transfektion gefolgt

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In-vitro-Transkription ist die Synthese von RNA-Transkripten durch RNA-Polymerase anhand einer linearen DNA-Vorlage, die die entsprechende Promotorsequenz (T7, T3, SP6) und das zu transkribierende Gen enthält (Abbildung 1A). Eine typische Transkriptionsreaktion besteht aus der DNA-Vorlage, RNA-Polymerase, Ribonukleosidtriphosphaten, einem RNase-Inhibitor und einem Puffer, der Mg2+-Ionen enthält.
Für eine Vielzahl von Anwendungen werden häufig große Mengen an hochwertiger RNA benötigt. Die in vitro-Transkription wurde für Untersuchungen zur RNA-Struktur und -funktion, wie zum Beispiel Spleißen1, RNAi-Experimente in Säugerzellen2, Antisense-RNA-Amplifikation nach der „Eberwine-Methode“3, Mikroarray-Analysen4 und RNA-Impfstoffstudien5, beschrieben. Die Methode kann außerdem zur Herstellung radioaktiv markierter und mit Farbstoffen markierter Sonden verwendet werden6. Kürzlich berichteten Warren et al. über die Reprogrammierung menschlicher Zellen durch Transfektion mit in vitro transkribierter, kap-versehener RNA7. Mit dem T7 High Yield RNA Synthesis Kit von New England Biolabs können bis zu 180 μg RNA pro 20 μl Reaktion synthetisiert werden. Mit diesem Kit wurde bereits die erfolgreiche Transkription von RNA mit einer Länge von bis zu 10 kb durchgeführt. Als Matrizen für die Transkription können linearisiertes Plasmid-DNA, PCR-Produkte und synthetische DNA-Oligonukleotide verwendet werden, sofern sie die T7-Promotorsequenz upstream des zu transkribierenden Gens enthalten.
Die Hinzufügung einer 5'-End-Cap-Struktur zur RNA ist ein wichtiger Prozess in Eukaryoten. Sie ist entscheidend für die RNA-Stabilität8, eine effiziente Translation9, den nukleären Transport10 und das Spleißen11. Der Prozess umfasst die Anlagerung einer 7-Methylguanosin-Cap-Struktur an das 5'-Triphosphat-Ende der RNA. Die RNA-Cap-Bildung kann posttranskriptionell mithilfe von Capping-Enzymen oder kotranskriptionell unter Verwendung von Cap-Analoga durchgeführt werden. Bei der enzymatischen Methode wird die mRNA mittels des Vaccinia-Virus-Capping-Enzyms12,13 kappt. Das Enzym fügt unter Verwendung von GTP und S-Adenosylmethionin als Donatoren eine 7-Methylguanosin-Cap-Struktur (Cap-0-Struktur) an das 5'-Ende der RNA an. Beide Methoden liefern funktionell aktive, kappte RNA, die für Transfektionen oder andere Anwendungen geeignet ist14, beispielsweise zur Herstellung genomischer RNA von Viren für revers-genetische Systeme15 und für kristallographische Untersuchungen von Cap-bindenden Proteinen wie eIF4E16.
In der unten beschriebenen Methode wird das T7 High Yield RNA Synthesis Kit von NEB verwendet, um kappte und nicht-kappte RNA-Transkripte der Gaussia-Luciferase (GLuc) und der Cypridina-Luciferase (CLuc) zu synthetisieren. Ein Teil der nicht-kappten GLuc-RNA wird mithilfe des Vaccinia Capping Systems (NEB) kappiert. Als Matrizen-DNA dient ein linearisiertes Plasmid, das das GLuc- oder CLuc-Gen sowie einen T7-Promotor enthält. Die transkribierte RNA wird in HeLa-Zellen transfiziert, und die Zellkulturüberstände werden auf Luciferase-Aktivität untersucht. Kappte CLuc-RNA dient als interne Kontrolle zur Normalisierung der GLuc-Expression.

Diese Methode beschreibt die hochgradige in vitro-Synthese von sowohl kapptem als auch nicht kapptem mRNA aus einem linearisierten Plasmid, das das Gaussia-Luciferase-Gen (GLuc) enthält. Die RNA wird gereinigt, und ein Teil der nicht kappten RNA wird enzymatisch mit dem Vaccinia-Virus-Capping-Enzym kappt. Im letzten Schritt wird die mRNA in HeLa-Zellen transfiziert, und die Kulturüberstände der Zellen werden auf Luciferase-Aktivität untersucht.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

Die In-vitro-Transkription ist die Synthese von RNA-Transkripten durch die RNA-Polymerase aus einer linearen DNA-Vorlage, die die entsprechende Promotorsequenz enthält ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hela-Zellen mit kapazitierten und nicht kapazitierten mRNA-Transkripten von Gal-Luciferase zu transfectieren und die Zellkultur auf Luciferase-Aktivität zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst mit dem T7 High Yield RNA Synthesis Kit sowohl nicht kapazitierte als auch kapazitierte mRNA-Transkripte von Gaia-Luciferase mittels In-vitro-Transkription synthetisiert werden. Es werden zwei Methoden zur Kapazierung der mRNA demonstriert.Man verwendet ein Kap-Primer-Analogon während der Transkription, das andere Verfahren nutzt das Vaccinia-Kappungsenzym für die posttranskriptionelle Kappung. Im nächsten Schritt werden die kappten und nicht-kappten mRNA-Transkripte in Heli-Zellen transfiziert. Schließlich wird die aus nicht-kappten oder kappten mRNA resultierende Luciferase-Aktivität in der Heli-Zellkultur Super named miteinander verglichen.Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber dem selbstständigen Einrichten einer Transkriptionsreaktion liegt darin, dass das T7-High-Yield-RNA-Synthese-Kit getestet und optimiert wurde, um eine hohe Ausbeute und, noch wichtiger, hochwertige, vollständige RNA-Transkripte zu erzeugen. Dies ist äußerst wichtig für eine erfolgreiche RNA-Translation und die Expression funktionell aktiver Proteine. Diese Methode bietet somit Einblicke in die RNA-Transfektion; in vitro transkribierte RNAs können außerdem für andere Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise Mikroinjektion, Microarray-Analyse, hybridisierungsbasierte Blots sowie Untersuchungen zur RNA-Struktur und -funktion.Die DNA-Vorlage für diese Beispielreaktion ist ein linearisiertes Plasmid, das das Gaussian-Luciferase- oder gluc-Gen enthält. Mit einem T7-Promotor werden sowohl kappte als auch unkappierte Produkte synthetisiert. Beginnen Sie damit, die Komponenten aus dem T7-High-Yield-RNA-Synthese-Kit aufzutauen und auf Eis zu lagern.Um eine RNA-Kontamination zu vermeiden, tragen Sie Handschuhe und reinigen Sie die Arbeitsfläche, Pipetten und anderes Material gründlich. Es wird dringend empfohlen, nukleasefreie Pipettenspitzen, Röhrchen und Glasware zu verwenden, um nicht kappte RNA herzustellen. Richten Sie die Reaktion bei Raumtemperatur ein, beginnend mit dem 10×-Puffer und Wasser, gefolgt von den Nukleotiden und der DNA-Vorlage. Schließlich geben Sie die Polymerase-Mischung hinzu.Die Reihenfolge der Reagenzienzugabe ist wichtig, um kapptes RNA zu synthetisieren. Unter Verwendung eines Kappanalogs stellen Sie eine ähnliche Reaktionsmischung her, fügen jedoch das Kappanalog-Nukleotid hinzu. Nach Zugabe der Standardnukleotide mischen Sie nun die Reaktionsbestandteile durch vorsichtiges Vortexen, kurz zentrifugieren und inkubieren die Reaktionen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Trockenluftinkubator. Als interne Kontrolle richten Sie eine zweite Reaktion ein, um Kap-Transkripte von c Luke aus einem linearisierten Plasmid zu synthetisieren. Die Expression von c Luke dient zur Normalisierung der gluc-Expression.Nach der Inkubation das DNA-Template aus jeder Reaktionsmischung entfernen. 70 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen, gefolgt von 10 der DNAs, einem Reaktionspuffer und anschließend zwei Mikrolitern der DNAs. Eins, die DNAs 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Trockenluftinkubator reagieren lassen.Reinigen Sie die Reaktionen nun mithilfe eines handelsüblichen RNA-Reinigungs-Kits mit Säulchen und quantifizieren Sie die RNA mit einem NanoDrop™-Spektrophotometer. Bewerten Sie abschließend die RNA-Qualität mit dem Agilent RNA 6,000 Nano Kit und dem Agilent 2100 Bioanalyzer. Für eine Standard-Kappungsreaktion geben Sie 10 Mikrogramm der gereinigten, nicht kappten gluc-mRNA in 15 Mikroliter nukleasefreiem Wasser ein.Dies kann entsprechend hochskaliert werden. Erhitzen Sie die RNA auf 65 Grad Celsius für 10 Minuten, um die sekundären Strukturen aufzubrechen, und stellen Sie sie anschließend für fünf Minuten auf Eis. Um die Capping-Reaktion vorzubereiten, geben Sie Capping-Puffer, frisch verdünntes GTP, snail-Methionin und Vaccinia-Capping-Enzym zur denaturierten RNA. Vortexen Sie die Reaktionsbestandteile vorsichtig, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Trockenluftinkubator.Nach der Inkubation die RNA aufreinigen und analysieren, wie am Ende des vorherigen Abschnitts beschrieben. Beginnen Sie mit dem Ansäen von Hela-Zellen. In 28 Vertiefungen einer 48-Loch-Platte sollte jede Vertiefung 70 bis 230.000 Zellen und 150 µL Hochglukose-DMEM ergänzt mit 10 % Serum enthalten.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen 60 bis 90 % konfluent sind, was zwischen 16 und 24 Stunden dauern sollte. Wenn die Zellen bereit sind, bereiten Sie die Transfektionsmischungen vor. Verdünnen Sie die RNA auf eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter.Dann bereiten Sie 24 Mikrozentrifugenröhrchen für drei verschiedene Reaktionen vor. Jeweils achtmal verdoppelt, also acht Röhrchen. Geben Sie einen Mikroliter unkappte gluk-RNA, einen Mikroliter kappte c-luke-RNA zur Normalisierung und 25 Mikroliter serumfreies Medium hinzu.DMEM immer gut mit einem Pipettiergerät in den nächsten acht Röhrchen mischen. Führen Sie die gleiche Reaktion durch, verwenden jedoch anstelle der nicht kappten gluc-RNA in den letzten acht Röhrchen die mit Kappanalog hergestellte kappte gluc-RNA. Anstelle der mit Kappanalog hergestellten gluc-RNA fügen Sie nun in die erste Serie von acht Röhrchen mit nicht kappter gluc-RNA-Mischung 0,2 Mikroliter mRNA-Boost-Reagenz hinzu, gefolgt von der Zugabe von 0,2 Mikrolitern unter Vermischung.Das Transit-mRNA-Reagenz ermöglicht es, dass die Reaktionen bei Raumtemperatur nicht länger als fünf Minuten lang ablaufen. Zwei Minuten nach Reaktionsbeginn übertragen Sie jede Mischung tropfenweise in eine Vertiefung mit kultivierten Zellen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den nächsten beiden Reihen von Röhrchen, die Kappe, analoge Kappe Gluc, RNA sowie kappte Gluc-RNA aus der Vaccinia-Reaktion enthalten.Vier Wells als negative Kontrollen belassen und die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid-Assay inkubieren. Das Supra wurde mit dem Biox GIA Luciferase-Assay-Kit für den Gluc-Assay benannt. Frische Assay-Lösung herstellen, indem 15 Mikroliter Biox Gluc-Substrat zu 1,5 Millilitern Biox Gluc-Assay-Puffer hinzugefügt werden.Vortexen Sie das Endgemisch nicht. Mischen Sie es durch Umdrehen des Reaktionsgefäßes für den CLU-Assay. Bereiten Sie frisch rekonstituiertes Substrat 100 x vor.Danach wird die Assay-Lösung hergestellt, indem 15 Mikroliter des rekonstituierten Substrats zu 1,5 Milliliter Blu-Ciena-Luciferase-Assay-Puffer gegeben werden. Die C-Luke-Assay-Lösung ohne Vortexen mischen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Nachdem die Assay-Lösungen vorbereitet wurden.Messen Sie die Lumineszenz der Zelle mithilfe eines Mikroplatten-Luminometers. Stellen Sie das Luminometer so ein, dass es 50 Mikroliter Assay-Lösung über einen Zeitraum von zwei bis zehn Sekunden injiziert. Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter jeder Zellkultur-Supernatant-Probe in eine Vertiefung einer 96-Loch-Schwarzen Platte.Befüllen Sie den Injektor mit der Assay-Lösung und messen Sie anschließend die Lumineszenz. Mit dem T7 High Yield RNA-Synthese-Kit können bis zu 180 Mikrogramm nicht kappte RNA und 40 bis 50 Mikrogramm kappte RNA pro 20-Mikroliter-Reaktion hergestellt werden, wie auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer analysiert. Gute Qualität, intakt.Die RNA sollte einen einzigen scharfen Peak zeigen, der das RNA-Transkript darstellt. Ein breiter Peak oder mehrere Peaks deuten auf eine RNA-Degradation hin. Es ist außerdem wichtig, die Größe der R-N-A-R-N-A zu überprüfen.Transkripte, die länger sind als erwartet, können auf eine unvollständige Verdauung des Plasmid-Desoxyribonukleinsäure-(D-N-A)-Templates zurückzuführen sein. Desoxyribonukleinsäure-(D-N-A)-Ribonukleinsäure-(R-N-A)-Abbau und geringere Ausbeute sind in der Regel das Ergebnis von Kontaminationen, die über den Template in die Reaktion eingeführt wurden. Die Desoxyribonukleinsäure-(D-N-A)-Transfektion wurde durch Inkubation und Bestimmung der Luciferase-Aktivität gefolgt. Die 5′-Cap-Struktur ist wichtig für den Schutz der Ribonukleinsäure-(R-N-A) vor Exonuklease-Abbau und für die Förderung der Translationsinitiierung.Daher ist die RNA-Kappung ein entscheidender Schritt für Transfektionsexperimente. Der Unterschied in der gemessenen Lumineszenz zwischen Zellkulturen, die mit gekappten und ungekappten Transkripten transfiziert wurden, untermauert dies deutlich und zeigt zudem, dass beide Kappmethoden – unter Verwendung eines Kappanalogs oder des Vaccinia-Kappungsenzyms – erfolgreich funktionelle gekappte RNA-Transkripte erzeugen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie hochwertige gekappte RNA-Transkripte für die Verwendung in Transfektionen und anderen vielfältigen Anwendungen synthetisiert werden.

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