Name: Hybridisierung In-situ- Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Genexpression in Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektormücken. Diese Methode ermöglicht die räumliche Lokalisierung spezifischer mRNA-Transkripte.

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Die Autoren bedanken sich bei Marika Walters für Beratung bei der Entwicklung von in-situ-Hybridisierung danken Methoden für Weichteile und Yury Goltsev für die Diskussion von Protokollen für die Hybridisierung in situ von Anopheles gambiae Embryonen, die anschließend angepasst und wurden modifiziert, um die hier beschriebene Protokoll für die Hybridisierung in Entwicklung situ von Aedes und Culex Embryonen. Wir erkennen auch hilfreiche Empfehlungen von Adam Paré und David Kosman gegeben. Wir bedanken uns bei Osvaldo Marinotti für wissenschaftliche Diskussion und Bearbeitung der Text-Protokoll.

<ol><li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit.+Vectors%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1(2011).</li>
<li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228(2007).</li>
<li>Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).</li>
<li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSappington%2C+TW+%22The+Molecular+Biology+of+Insect+Disease+Vectors%3A+A+methods+manual%22">The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual</a>. , Chapman & Hall. London. (1997).</li>
<li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li>
<li>Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research.+Malaria+Research+and+Reference+Reagent+Resource+Center+%28MR4%29%22">Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</a>. , (2007).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes%2C+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li>
<li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+nanos+%28nos%29+and+oskar+%28osk%29+orthologues+of+the+vector+mosquito%2C+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).</li>
<li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg%5BTitle%5D)+AND+%22Izv.+Akad.+Nauk+SSSR+ser.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li>
<li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li>
<li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584(2011).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29+I.+Description+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinerlei Angaben.

Die Hybridisierung in situ und kolorimetrischen Färbeprotokoll präsentiert hier für whole-mount Moskito Gewebe und Embryonen ist eine nützliche Technik für die Lokalisierung von spezifischen Transkripte in Organen und Zelltypen. Diese Verfahren sind eine Verbesserung gegenüber den bereits zuvor gemeldeten Methoden, die beide bei der Straffung umfangreiche Waschschritte und zusätzliche technische Details und Reagenz Quellen. Nach unserer Erfahrung ist kolorimetrischen Nachweis der Hybridisierungssignale überlegen in der Empfindlichkeit und Klarheit der Hybridisierung Signal im Vergleich zu Fluoreszenz-basierte Erkennung Systeme. Außerdem kolorimetrischen Nachweis umgeht Probleme mit Signal Diskriminierung in Embryonen, die von Natur aus Auto-Fluoreszenz assoziiert sind. Einschränkungen bei der Aufdeckung von Hybridisierungssignale auftreten, wenn Low-Transkripte Fülle ausgerichtet sind und Hintergrundfärbung ist evident. Eine Erhöhung der Hybridisierungstemperatur auf 65 ° C wurde gefunden, zurück zu verringernBoden Hybridisierungssignale, ist aber nicht eine vorgeschlagene Ersatz für die Planung von einzigartigen Ziel-spezifischen RNA-Sonden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um in situ Hybridisierung von Gesamt-Halterung Speicheldrüsen von Aedes aegypti und der Eierstöcke und Embryonen von Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae durchzuführen. aegypti und Culex quinquefasciatus. Dieses Verfahren ist auch auf andere Gewebe Moskitos, und vermutlich auch von anderen Insekten. Zusätzlich haben wir zum ersten Mal vergleichenden Leitlinien für die Inszenierung der embryonalen Entwicklung in drei Vektor-Mücken, Ae zusammengestellt. aegypti, ein. gambiae und Cx. fatigans. Die Beobachtungen wurden für spezifische Stämme von diesen drei Arten, unter diskret Haltungsbedingungen berichtet worden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Entwicklungszeit natürlich können verschiedene Stämme von Stechmückenarten und unter verschiedenen Haltungsbedingungen variieren. In situ Hybridisierungen Ergänzung der laufenden Bemühungen um die analysieren die Transkriptome Mücken und anderen Arthropoden, und kann ein besseres Bild von der Regulation der Genexpression in diesen Organismen bieten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Weniger undurchsichtig als herkömmliche Röhren; Hilfsmittel bei der Visualisierung von Proben </td></tr><tr><td> Deionisiertem Formamid </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC-Wasser </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% Natriumhypochlorit </td><td> Austins </td><td></td><td> A-1 Marke </td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Einweg-Polyethylen Transferpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-Heptan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-Xylol </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex-9-und Tüpfelplatte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748b </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / Plus Objektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-Liner Toupee Tape </td><td> Hair Direct </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / Haut-Basismaterial in 0,75 x 12 m Klebebandrolle </td></tr><tr><td> TOPOTA Cloning Kit für Sequening mit One Shot Top10 chemisch-kompetente E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 Reaktionen 40 Reaktionen </td></tr><tr><td> Beschallte Lachssperma-DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP-Stammlösung </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Western Blocking Reagent </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech Polyester-Mesh (330,130) </td><td> Saati Drucken </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 Fäden / inch, 34 Mikron Gewindedurchmesser, Farbe orange </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% in PBT </td></tr><tr><td> Heparin-Natrium-Salz </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> 10 ml-Portionen in Ampullen Bernstein </td></tr><tr><td> 16 Unzen Solo Papier Behälter mit Deckel </td><td> Das Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas scintillatIonen-Flasche mit Schraubverschluss ungebunden </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml Fall von 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Luftpolsterfolie celluar Polstermaterial </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10-Fuß-/ Rolle 0,188 Zoll dick </td></tr><tr><td> Hühnerserum </td><td></td><td></td><td> Vollblut wurde entweder vom Flügel Vene oder durch Herzpunktion aus einer juvenilen Hühnern gesammelt. Das Blut wurde bei 37 ° C für 1 h bis koaguliert und dann auf Eis für 30 min inkubiert angeordnet. Das Serum wurde gesammelt und bei 3000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand (geklärte Serum) wurde gesammelt und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Tabelle Reagenzien und Ausrüstung für die in situ Hybridisierung.

hybridisierung<em&gt; in-situ-</em&gt; der speicheldrüsen, ovarien und embryonen von vektor-mücken

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Insektenstiche können für eine vielfältige Reihe von Erregern einschließlich Arboviren, Protozoen und Nematoden. Untersuchung der Transkripte und Genregulatoren, die in Geweben, in denen die Mücke Wirt und Pathogen zu interagieren und in Organen der Fortpflanzung beteiligt sind von großem Interesse für Strategien, um durch Moskitos übertragene Krankheit Übertragung zu verringern und zu stören Ei Entwicklung zum Ausdruck kommen. Eine Reihe von Tools wurden eingesetzt, um Untersuchung und Bestätigung der zeitliche und Gewebe-spezifische Regulation der Genexpression. Hier beschreiben wir Protokolle, die entwickelt wurden, um räumliche Informationen, die unser Verständnis von denen spezifische Gene exprimiert werden und reichern ihre Produkte verstärkt zu erhalten. Die beschriebenen Protokoll wurde verwendet, um die Expression zu verifizieren und festzustellen Akkumulation Muster der Expression in Geweben im Zusammenhang mit Mücken übertragene Erregerübertragung, wie weibliche Speicheldrüsen sowie subzellulären Kompartimenten der Ovarien und Embryonen, die neuspät, um Moskito Fortpflanzung und Entwicklung. Die folgenden Verfahren stellen eine optimierte Methodik, die die Effizienz der verschiedenen Schritte in dem Protokoll verbessert, ohne Verlust der Ziel-spezifischen Hybridisierungssignale. Richtlinien für die RNA-Sonde der Aufbereitung werden die Dissektion der Weichteile und der allgemeinen Vorschrift zur Fixierung und Hybridisierung in Teil A beschrieben, während die spezifischen Schritte für die Gewinnung, Fixierung, Pre-Hybridisierung und Hybridisierung von Embryonen Mücke in Teil B sind detailliert

Zeitliche und räumliche Genexpressionsanalysen spielen eine entscheidende Rolle in der funktionellen Genomik. Whole-mount-Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Ist nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Transkripten in Geweben und subzellulären Kompartimenten. Hier beschreiben wir eine Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Protokoll mit Modifikationen für spezifische Zielgewebe in Mücken.

Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken

Mücken sind Vektoren für eine Vielzahl von Pathogenen, darunter Arboviren, protozoische Parasiten und Nematoden. Die Untersuchung von Transkripten und Genen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Hybridisierung in C zwei durchzuführen, um die Lokalisierungs- und Akkumulationsmuster spezifischer Transkripte in Mückengeweben und -embryonen zu bestimmen. Dazu werden zunächst die Mückengewebe oder -embryonen fixiert, sodass die Gewebeultrastruktur und die mRNA-Zielstrukturen erhalten bleiben und für die Hybridisierung mit Antisense-RNA-Sonden verfügbar sind. Anschließend werden die Antisense-RNA-Sonden mit den Zieltranskripten in den fixierten Geweben oder Embryonen hybridisiert.Dann werden colorimetrische Antikörperanfärbungen durchgeführt, um die Lokalisierung und Akkumulationsmuster des Ziel-mRNA zu detektieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die räumliche Muster der RNA-Akkumulation auf der Grundlage der Hybridisierung in C zwei und colorimetrischen Nachweismethoden zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der funktionellen Genomik zu beantworten, beispielsweise wann und wo Genprodukte in der Mücke akkumulieren.Dieses Verfahren ermöglicht es uns außerdem, räumliche Lokalisierungsinformationen zu erhalten, um besser zu verstehen, wie die Genexpression bei biologischen Prozessen wie der Fortpflanzungsentwicklung und den Wechselwirkungen zwischen Mücken und Krankheitserregern reguliert wird. Um die Hybridisierung von digoxigeninmarkierten RNA-Sonden an Mückengewebe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Dissektion der Eierstöcke und Speicheldrüsen. Anschließend fixieren Sie das Gewebe und behandeln es gegebenenfalls mit Proteinase K.Nach der Nachfixierung der Gewebe werden diese 30 Minuten lang in einem Milliliter einer 1:1-Mischung aus Hybridisierungslösung PBT oder HIB PBT unter Mutation inkubiert; warten Sie, bis sich das Gewebe abgesetzt hat, und dekantieren Sie anschließend so viel HI PBT wie möglich. Geben Sie dann je einen Milliliter HIB in jedes Probenröhrchen. Wickeln Sie das Probenröhrchen in eine luftdicht schützende Verpackung wie z. B. Luftblasenfolie ein und stellen Sie es in eine Hybridisierungsflasche.Verschließen Sie die Flasche mit einer Hybridisierungskappe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 55 Grad Celsius unter Rühren. Nach dem Entnehmen der Flasche aus dem Inkubator und dem vorsichtigen Absatz der Gewebeprobe gießen Sie den Prähybridisierungspuffer vorsichtig ab, wobei 50 Mikroliter Lösung im Gefäß verbleiben sollen, um Probenverlust zu vermeiden. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter vorgewärmte Pufferlösung zum selben Probematerial hinzu und stellen Sie es in ein auf 55 Grad Celsius eingestelltes Heizblock. Den zuvor vorbereiteten RNA-Probemolekül denaturieren Sie fünf Minuten lang bei 85 Grad Celsius.Danach sofort fünf Minuten lang auf Eis stellen. Als Nächstes den RNA-Sonde mit einer Pipette in das Probenröhrchen überführen. Die RNA-Sonde schwimmt an die Oberfläche der HI-Lösung.Mischen Sie durch vorsichtiges Anstoßen des Röhrchens. Inkubieren Sie die Proben vorsichtig in einem festen Mikrozentrifugenröhrchenständer innerhalb eines Hybridisierungsovens bei 55 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Danach eine RNase-Behandlung und Antikörperfärbung wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.Befestigen Sie die Gewebeproben, indem Sie diese zunächst mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze in einzelne runde Vertiefungen einer Pyrex-Tropfplatte überführen. Entfernen Sie so viel PBT wie möglich und bedecken Sie die Probe mit 70 % Glycerin in Wasser. Lassen Sie das Glycerin die Probe bei vier Grad Celsius über Nacht durchdringen.Um Objektträger vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Oberfläche des Objektträgers mit Kim-Tüchern sauber zu wischen. Tragen Sie anschließend mit einem Pinsel zwei Streifen durchsichtigen Klebebands parallel zueinander auf, sodass sie einen schmalen Kanal bilden. Nehmen Sie die Proben nacheinander auf und platzieren Sie sie entlang der Länge des Kanals, wobei jede Probe hinsichtlich anteriorer, posteriorer sowie dorsal-ventraler Ausrichtung in derselben Orientierung positioniert wird.Nachdem jede Probe positioniert wurde, verwenden Sie einen Kim-Tuch-Abstrich, um überschüssige Glycerinlösung um die Gewebe herum aufzusaugen. Das Entfernen des überschüssigen Glycerins ist wichtig, um die Bildung von Blasen zu verhindern, wenn die montierten Proben unter einem Deckglas auf dem Objektträger verschlossen werden. Platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas über den Kanal, der die ausgerichteten Proben enthält. Befestigen Sie das Deckglas mit transparentem Nagellack halbpermanent auf dem Objektträger, indem Sie die Ecken leicht betupfen. Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette langsam 70 % Glycerin in das eine Ende des Kanals, um den Kanal und den Bereich unter dem Deckglas dauerhaft zu füllen.Versiegeln Sie die präparierten Proben, indem Sie Nagellack an allen vier Seiten des Deckglases auftragen. Lassen Sie den Nagellack ausreichend trocknen, bevor Sie die Proben abbilden. Nachdem Sie Embryonen aus einem Käfig mit 300 begatteten adulten weiblichen Mücken gesammelt und sie bis zu den gewünschten Entwicklungsstadien heranwachsen ließen, überführen Sie sie aus ihrem Sammelbehälter in ein Tylene-Maschensieb, Fangröhrchen für Achtziger-Embryonen.Stellen Sie das Auffangröhrchen in ein Becherglas, das mit destilliertem Wasser gefüllt ist, sodass das Volumen des Auffangröhrchens zur Hälfte gefüllt ist. Lösen Sie die Embryonen mit einem Pinsel vom Tylene-Mesh und überführen Sie sie in das mit Wasser gefüllte Auffangröhrchen. Um besonders viele Embryonen abzulösen, trennen Sie das Tylene-Mesh vom Sammelbehälter und falten Sie das Mesh vorsichtig zu einem Trichter, wobei Sie den Mesh-Trichter mit einer Hand halten.Benutzen Sie die andere Hand, um Wasser entlang der Seiten des Trichters zu spritzen, um die Embryonen in das Auffangröhrchen zu spülen. Diese Methode kann auf Anomalie-Embryonen angewendet werden, da ihnen die klebrige Substanz fehlt, die auf der Oberfläche von Achtziger-Embryonen vorhanden ist und es den Eiern ermöglicht, an übergeordneten Substraten zu haften. Bereiten Sie 40 Milliliter Dekorationslösung vor und gießen Sie die Lösung in eine 100 Millimeter große Petrischale.Geben Sie 50 Milliliter destilliertes Wasser in ein 100-Milliliter-Becherglas und stellen Sie es beiseite. Legen Sie anschließend die Embryonen in die Petrischale mit Dekorationslösung. Spülen Sie die Embryonen mit einer Einweg-Polyethylen-Transferpipette, während Sie die Auffangflasche vorsichtig schwenken, damit die Embryonen in der Dekorationslösung untergetaucht bleiben und bewegt werden.Die Dekoration ist einer der empfindlichsten Schritte des Protokolls, und eine übermäßige Behandlung mit Natriumhypochlorit bei Achtziger-Embryonen verhindert eine ordnungsgemäße Endokorion-Bildung. Für Achtziger-Embryonen ist ein maximales Anritzen von 35 Sekunden erforderlich, während 75 Sekunden für QX-Embryonen ausreichend ist. Überprüfen Sie die Dekoration unter einem Stereomikroskop bei niedriger Vergrößerung. Achtziger-Embryonen weisen kein netzartiges Exokorion mehr auf, sondern nur noch die glatte, polierte Oberfläche des schwarzen Endokorions; bei Anomalie-Embryonen ist dies der Fall.Die exo-chorionischen Schwimmkörper und Gratenstrukturen fehlen, sobald die Embryonen beschichtet sind. Fahren Sie fort, indem Sie das Endo-Corion gemäß dem im schriftlichen Protokoll beschriebenen Verfahren fixieren und aufbrechen. Um das aufgebrochene Endo-Corion abzulösen, platzieren Sie ein Stück doppelseitiges Toupeeband in der Mitte einer dreizentimeterigen Petrischale mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser (200 µl).Überführen Sie die Embryonen aus Methanol auf das doppelseitige Klebeband. Lassen Sie ein bis zwei Minuten verstreichen, damit sich die Embryonen setzen und an der Oberfläche des Bandes haften können; gießen Sie überschüssiges Methanol ab und lassen Sie die Oberfläche anschließend ein bis zwei Minuten leicht antrocknen. Geben Sie dann 95 % Ethanol in die Petrischale, um die Embryonen auf dem Band weiter zu fixieren; pipettieren Sie 600 Mikroliter destilliertes Wasser in das Ethanol und schwenken Sie, um die Flüssigkeiten zu vermischen.Verwenden Sie anschließend eine 27,5er Nadel, die an einem Ein-Milliliter-Spritzenzylinder befestigt ist, um das aufgerissene Endochorion abzulösen. Nachdem der weiße Embryo mit einem feinen Pinsel von den schwarzen Resten des Endochorions befreit wurde, überführen Sie die Embryonen unverzüglich mit einem Künstlerpinsel von dem Klebeband in das Ethanol-Behältnis der Petrischale. Übertragen Sie die Embryonen dann mit einer Drei-Millimeter-Pipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter 100 % Ethanol enthält. Spülen Sie die Embryonen abschließend zwei- bis dreimal mit 100 % Ethanol und lagern Sie sie in frischem 100 % Ethanol bei minus 20 Grad Celsius.In dieser Abbildung zeigt die In-situ-Hybridisierung an gesamten Präparaten von Speicheldrüsen weiblicher Aedes aegypti mit mRNA-Sonden, die gegen Amylase 1D, 7S2 und D7L2 gerichtet sind, die Anreicherung dieser Transkripte in den proximalen lateralen, distalen lateralen und distalen lateromedialen Lappen jeweils. In diesem Experiment wurden gesamte Präparate von Zellen dreier Mückenarten mit mRNA-Sonden hybridisiert, die spezifisch die jeweiligen autologen Transkripte von Oscar ansprechen. Hier wurde die In-situ-Hybridisierung an gesamten Embryonen von Anopheles gambiae, Aedes aegypti und Culex quinquefasciatus unter Verwendung von Antisense-RNA-Sonden durchgeführt, die gegen die jeweiligen autologen Oscar-Transkripte der Mücken gerichtet waren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Hybridisierung in C zwei Experiment durchführt, um die Lokalisation und Anreicherung von Transkripten in bestimmten Mückengeweben oder Embryonen zu bestimmen.

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Methoden für den Einsatz Alphavirus transduzierenden Systeme fluoreszierenden Reporter in vitro und in der Erwachsenenbildung Mücken Ausdruck beschrieben werden. Diese Technik kann an jede Protein von Interesse anstelle oder zusätzlich zu einem Reporter zu äußern.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Aufgrund ihrer einfachen Anatomie bieten Anopheles-Hoden ein gutes zytologisches Modell für die Untersuchung der Spermatogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung , eine Technik, die zur Untersuchung dieses biologischen Prozesses verwendet wird, sowie den Phänotyp transgener Stämme, die Mutationen in den Genen aufweisen, die an der Spermienproduktion beteiligt sind.

Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Untersuchung der Spermatogenese in der Anopheles-Mücke

Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.

Hybridisierung Kettenreaktion RNA Whole-Mount Fluoreszenz in situ Hybridisierung von chemosensorischen Genen in Riechanhängen von Mücken

Mikrobielle Gemeinschaften in Mücken sind vielversprechend für biologische Vektorkontrollstrategien. Die meisten Symbionten sind nicht kultivierbar und erfordern metagenomische Analysen. Wir beschreiben eine Methode zur Sezierung weiblicher Mücken und zur Trennung von Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen, um Kreuzkontaminationen zu verhindern, Mikrobiomstudien auf Organebene zu erleichtern und das Verständnis der Rolle von Mikroorganismen in der Mückenbiologie zu verbessern.

Präparierung von Mücken-Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen für Mikrobiomanalysen auf Organebene

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Genexpression in Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektormücken. Diese Methode ermöglicht die räumliche Lokalisierung spezifischer mRNA-Transkripte.

Hybridisierung

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