Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein stabiles, dünnes Schädel-Fenster über dem Maus-Kortex zu erzeugen, um wiederholte Bildgebung durchzuführen, ohne das intrakranielle Milieu zu stören. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kopfhalterung angebracht wird, die es ermöglicht, den Kopf stabil unter der Bildgebungsvorrichtung zu fixieren. Anschließend wird der Schädel in einem Bereich über der dorsalen Gehirnoberfläche vorsichtig ausgedünnt und die Oberfläche mit feinkörnigem Material poliert.

Dann bedecken Sie das Fenster mit einem kleinen Tropfen Cyanoacrylat-Kleber und einem Deckglas, um das Fenster zu verstärken. Der letzte Schritt besteht darin, das Tier für die Bildgebung unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop vorzubereiten. Letztendlich wird die Zwei-Photonen-Mikroskopie in vivo verwendet, um feine Strukturen wie Arteriolen, Venolen, Kapillaren und neuronale Dendriten darzustellen, die über Wochen hinweg bis zu 250 Mikrometer tief in die Hirnrinde hinein abgebildet werden können.

Der Hauptvorteil dieser Schädel-Fenster-Technik besteht darin, dass der über der Großhirnrinde liegende Schädel unangetastet bleibt. Zunächst dünnen wir den Schädel, um optische Klarheit zu erzielen, und verstärken ihn anschließend mit Cyanoacrylat-Kleber sowie dem Deckglas. Diese Methode eignet sich gut zur Untersuchung einer Vielzahl fluoreszierender transgener Mäuse im anästhesierten Zustand oder im Zustand der OIC.

Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die benötigten chirurgischen Instrumente im Autoklaven sterilisieren, und betäuben Sie eine Maus im Alter von etwa drei bis sechs Wochen gemäß den Methoden im beigefügten Manuskript. Überprüfen Sie den Reflex durch Zehenquetschen, um sicherzustellen, dass sich die Maus in der chirurgischen Anästhesietiefe befindet. Befestigen Sie anschließend die Maus im stereotaktischen Rahmen.

Halten Sie die Körpertemperatur der Maus bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie eine rückgekoppelte rektale Sonde und eine Heizplatte. Tragen Sie ein Augensalbe auf die Augen auf, um die Feuchtigkeit zu erhalten.

Dann rasieren Sie die Kopfhaut mit dem kleinen elektrischen Rasierer. Anschließend reinigen Sie die Kopfhaut mit Betadine und wischen sie danach mit 70 % Isopropylalkohol ab. Erwärmen Sie anschließend eine Portion steriler künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit unter dem Mikroskop auf 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Kopfhaut über der gesamten dorsalen Schädeloberfläche mit einer chirurgischen Schere. Schneiden Sie die Haut seitlich bis zu den Rändern der Schläfenmuskulatur auf beiden Seiten des Schädels und hinter den Nackenmuskeln zurück. Entfernen Sie anschließend mit einer Skalpellklinge das dünne Periost von der Schädeloberfläche.

Trocknen und reinigen Sie dann den Schädel. Danach tragen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylat-Klebstoff auf die Schädeloberfläche auf. Lassen Sie den Klebstoff gründlich trocknen.

Diese Klebeschicht ist für eine ordnungsgemäße Haftung des dentalen Zements erforderlich. In den nachfolgenden Schritten bohren Sie Löcher für die Vorbereitung der Bildgebung bei wachen Tieren und bringen zwei selbstschneidende Schrauben der Größe 0 0 0 auf der kontralateralen Schädeloberfläche an.

Danach wird ein starrer, speziell angefertigter Verbinder mit zwei Befestigungspunkten am Schädel angebracht. Dies reduziert die Bewegungsfreiheitsgrade erheblich und vereinfacht die erneute Lokalisation desselben Bildgebungsareals in longitudinalen Studien. Eine breite Querstange bietet zudem ausreichend Platz für die Platzierung von Elektroden und die Stimulation der Vibrationsreize.

Danach die gesamte Schädeloberfläche – mit Ausnahme der Stelle des Fensters – mit einer Schicht Zahnzement bedecken und sicherstellen, dass alle freiliegenden Hautränder vom Zement bedeckt sind. Vor dem Ausdünnen des Schädels sicherstellen, dass die Bohrer scharf sind, und deren Wiederverwendung vermeiden. Mit einem Zahnbohrer bei niedriger Geschwindigkeit einen zwei Millimeter mal zwei Millimeter großen Bereich über dem somatosensorischen Kortex mit einem halb Millimeter großen Bohrer ausdünnen.

Dann verdünnen Sie die trockene Schädeloberfläche nur für wenige Sekunden gleichzeitig mit dem Schädel mit einem CSF, um Überhitzung zu verhindern. Danach verdünnen Sie den Knochen. Wechseln Sie anschließend auf eine langsamere Bohrgeschwindigkeit und schleifen Sie die Schädeloberfläche nur mit leichten Berührungen.

Der Bohrer sollte sich der Oberfläche in einem Winkel von etwa 30 Grad zur Vertikalen nähern. Setzen Sie das Ausdünnen des Knochens jenseits der Gefäßschicht in die zweite Knochenschicht fort. Über der Gehirnoberfläche.

Halten Sie den Bohrer mit kleinen, kontrollierten Bewegungen und üben Sie nur Kraft in lateraler Richtung aus. Wenn der Knochen etwa 50 Mikrometer dick ist, sollten die Ablösegefäße deutlich durch den feuchten Knochen sichtbar sein. In dieser Tiefe werden für einige Sekunden kleine weiße Punkte innerhalb des Knochens sichtbar werden.

Sofort nachdem die trockene Schädeloberfläche angefeuchtet wurde, sollte die endgültige Knochendicke etwa 10 bis 15 Mikrometer betragen. Wenn der Knochen ausreichend dünn ist, sind die kleinen weißen Stellen im Knochen nicht mehr sichtbar, sobald die trockene Schädeloberfläche angefeuchtet wird. Polieren Sie nun das Fenster mit Zinnoxidpulver.

Verwenden Sie eine kleine Prise Pulver, die etwa ein Viertel der Größe des Fensters hat, und rühren Sie eine Suspension des Pulvers mit einer Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) mithilfe eines vorgefertigten Bohrers mit Silikonpeitsche um. Polieren Sie die Oberfläche zehn Minuten lang, spülen Sie das Zinnoxidpulver vollständig vom Fenster ab und trocknen Sie den Knochen. Dieser Vorgang sollte dazu beitragen, eventuelle raue Kanten, die der Bohrer während des Ausdünnens hinterlassen hat, zu verringern.

Schneiden Sie als Nächstes einige quadratische Stücke aus Deckgläsern der Nummer null mit einer Größe, die geringfügig kleiner ist als die Fenstergröße. Verwenden Sie einen Glasschneider, um vorsichtig getrennte horizontale und vertikale Linien auf dem Deckglas anzuritzen. Schlagen Sie entlang einer geraden Kante zu, ohne das Glas zu zerbrechen.

Legen Sie dann das Deckglas in eine Petrischale. Trennen Sie die Glasstücke, indem Sie die Schale gegen eine Tischkante schlagen. Anschließend tragen Sie mit der Holzspitze eines gebrochenen Wattestäbchens einen kleinen Tropfen Sano-ACRL-Kleber über dem Fenster auf.

Platzieren Sie schnell ein vorher zugeschnittenes Deckglas auf den Klebstoff. Vermeiden Sie, nachdem der Klebstoff 15 Minuten lang gründlich getrocknet ist, Blasen unter dem Deckglas. Entfernen Sie überschüssigen Cyanoacrylat-Klebstoff mit einer Skalpellklinge von der Oberfläche des Deckglases.

Versiegeln Sie die Ränder des Fensters mit Zahnzement. Danach bilden Sie am Ende eine leicht erhöhte Kammer, um Wasser für das Tauchobjektiv aufzunehmen. Stellen Sie das Tier in einen warmen Käfig, bis es sich vollständig von der Anästhesie erholt hat.

Stabilisieren Sie in diesem Schritt das Tier auf einer optischen Grundplatte zur Bildgebung und verwenden Sie den Rahmen als Kopfstütze. Unsere separate Platte kann das Tier sowie alle physiologischen Überwachungsgeräte als eine Einheit zwischen dem Operationsplatz und der Zwei-Photonen-Bildgebung transportieren. Falls eine Bildgebung der Durchblutung gewünscht ist, injizieren Sie 0,05 Milliliter eines 5 %igen fluoreszierenden Dextran-Farbstoffs über die infraorbitale Vene, um das Blutserum zu markieren.

Das muss unter Vollnarkose durchgeführt werden, und der Farbstoff verbleibt normalerweise mehrere Stunden im Blutkreislauf. Injizieren Sie eine Ringer-Laktat-Lösung intraperitoneal in einer Menge von drei Mikrolitern pro Gramm alle zwei Stunden, um den Flüssigkeits- und Energiehaushalt aufrechtzuerhalten. Wecken Sie die Maus, indem Sie die Isofluran-Zufuhr beenden.

Eine Stunde nach dem Erwachen ist die Maus bereit für die Bildgebung. Schließen Sie den Käfig über dem Mikroskop, um Lichtkontamination zu verhindern. Gezeigt ist ein Beispiel der kortikalen Gefäßversorgung eines Oberschenkels, einer YFP-Maus, die durch intravenöse Injektion von mit Texas Red konjugiertem Dextran markiert wurde. Duralgefäße sind oft leicht oberhalb der kortikalen Oberfläche im Dura mater sichtbar.

Große Ableitungsarterien und Venen liegen auf der kortikalen Oberfläche. Eindringende Gefäße verzweigen sich von diesem Oberflächennetzwerk und ziehen in die Kortexregion hinein, wo sie sich in ein dichtes Kapillarbett aufteilen, das das kortikale Gewebe versorgt. Dieser Film zeigt die Gefäßstruktur an der Oberfläche des Abzugs bei einem wachen Mausmodell.

Spontane Oszillationen im arteriellen Durchmesser können beobachtet werden, wenn sich das Tier in einem ruhigen Ruhezustand befindet. Diese Methode sollte nützlich sein, um eine Vielzahl fluoreszierender transgener Tiere entweder im anesthetisierten oder wachen Zustand zu untersuchen.