Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Dieses Verfahren erzeugt Daten zur Chromatin-Immunpräzipitation aus disseziertem Fliegengewebe, um den Chromatinzustand in vivo im Drosophila-Gewebe genau widerzuspiegeln. In diesem Fall werden Hunderte von Testes manuell durch Dissektion gewonnen. Chromatin-Immunpräzipitationsanalysen werden unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein von Interesse durchgeführt.

Quantitativer RT-PCR-Analyse-Test zur Anreicherung der spezifischen genomischen Region in der gereinigten, immunpräzipitierten DNA. Alternativ ermöglicht die Hochdurchsatzsequenzierung der Chip-Probe ein genomweites Profil. Letztendlich liefert die Chip-Analyse von mikrodisseziertem Gewebe eine Darstellung des Chromatinzustands in Zellen unter physiologischen Bedingungen.

Dieses Protokoll ist für die Analyse von direkt aus dem Organismus isolierten Geweben optimiert. Um Chromatinzustände und epigenetische Informationen unter realen physiologischen Bedingungen zu erhalten, demonstrieren wir den Einsatz von ChIP bei Drosophila, um den Chromatinzustand zu untersuchen. Dieses Protokoll kann jedoch auch auf andere Organismen wie Maus oder Zebrafisch angewendet werden.

Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist entscheidend, um DNA in ausreichender Qualität und Menge zu erhalten, die für Chips oder die Erstellung von Sequenzierbibliotheken für die Hochdurchsatzsequenzierung verwendet werden kann. Zunächst wird das Gewebe der Untersuchung – in diesem Fall etwa 200 Paare von Drosophila-Testes – in kaltem PBS, das Proteaseinhibitor und 100 Mikrogramm pro Milliliter PMSF enthält, präpariert. Nachdem das Gewebe zweimal gespült wurde, wird es in 200 Mikroliter derselben PBS-Lösung mit Inhibitoren resuspendiert.

Danach die Probe mit 5,5 Mikrolitern erwärmter 37 %iger Formaldehydlösung fixieren. 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dabei alle fünf Minuten vortexen und anschließend das Gewebe auf Eis absetzen lassen.

Zweimal mit 450 µL PBS, enthaltend Inhibitoren, waschen. Die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern. Die 200 Oph-Testisproben in einem 1,75-mL-Einor-Röhrchen kombinieren.

Pipettieren Sie den Puffer ab und resuspendieren Sie die Proben in 200 Mikrolitern Lysepuffer. Dissociieren Sie das Gewebe vollständig mit einem blauen Homogenisator, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Aggregate verbleiben, und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Dann fragmentieren Sie die Probe mit einem Mikrochip-Sonikator und lassen Sie sie 50 Sekunden lang auf Eis ruhen. Wiederholen Sie diesen Vorgang vier bis fünfmal, um die optimale Fragmentgröße für das Chip-Ziel zu erhalten. Anschließend mit 1,8 Millilitern Ripper-Puffer verdünnen, um eine Stammlösung aus Chromatin-Extrakt zu erhalten. Für eine erfolgreiche Chip-Analyse ist es entscheidend, die Größe der DNA-Fragmente empirisch zu bestimmen.

Daher müssen wir eine Gelelektrophorese durchführen, um mit dem Chip-Experiment fortzufahren. Für die Input-Kontrollprobe entnehmen Sie 50 Mikroliter. Geben Sie zwei Mikroliter Fünf-Molar-Natriumchlorid hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Um die Vernetzung umzukehren, fahren Sie mit der Konjugation des Antikörpers an das Protein fort. Geben Sie eine Probe in ein 1,5-Milliliter-Fendor-Gefäß. Fügen Sie 40 Mikroliter Protein-A-Kügelchen und 600 Mikroliter PBS hinzu und schütteln Sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Dann die Perlen auf den Magneten bringen und den Überstand verwerfen. Nun 100 Mikroliter PBS sowie den gewünschten Antikörper hinzufügen. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Nachdem die Kügelchen mithilfe eines Magneten gesammelt wurden, ein Milliliter Gewebenchromatin-Extrakt hinzufügen. Bei vier Grad Celsius über Nacht rotieren lassen. Anschließend die Chip-Probe auf einen Magneten geben und den Überstand entfernen.

Führen Sie anschließend Waschschritte mit je einem Milliliter bei vier Grad SIU für jeweils 10 Minuten durch, resuspendieren Sie die gesammelten Perlen in 100 Mikrolitern TE-Puffer. Um die Quervernetzung der Protein-DNA-Komplexe rückgängig zu machen, geben Sie drei Mikroliter 10 % SDS und fünf Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Die Kügelchen auf einem Magneten pelletieren. Das Überstand, der DNA enthält, in ein neues Röhrchen überführen. Die Kügelchen einmal waschen und die Überstände vereinigen, die 2D-NA enthalten.

Als Nächstes reinigen Sie die DNA mittels Phenol-Chloroform-Extraktion und überführen die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Fällen Sie die DNA mit 20 Mikrogramm pro Milliliter linearer Acrylamid oder Glykogen, 20 Mikrolitern dreimolarer Natriumacetat und 500 Mikrolitern 100%igem Ethanol.

Gut mischen und 10 Minuten bei minus 80 Grad Celsius inkubieren. Pelletisieren Sie die DNA durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet einmal mit 300 µL 70%igem Ethanol, nachdem es an der Luft getrocknet wurde.

Resuspendieren Sie die DNA-Pellets in 50 Mikrolitern TE-Puffer. Lagern Sie die fragmentierte DNA-Proben bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der genomischen DNA für die Standardkurve vor.

In einer 96-Well-Platte unter Verwendung von Vorlagen mit verdünnter genomischer DNA als Eingabekontrolle oder gechippter DNA 20 Mikroliter QPCR in Duplikaten ansetzen, die 96-Well-Platte in einem Mini-Platten-Spinner zentrifugieren. Die Probeplatte in einem Echtzeit-PCR-System laufen lassen, um die Daten zu validieren. Zunächst die Anwesenheit eines einzelnen Peaks im thermischen Dissoziationsplot überprüfen, der auf ein einzelnes Amplikon aus der PCR hinweist.

Als Nächstes zeichnen Sie die Standardkurve auf. Anhand der Daten der Reihe verdünnter genomischer DNA berechnen Sie anschließend die Formel, mit der die DNA-Menge entsprechend der Zykelschwelle bestimmt wird. Ermitteln Sie außerdem die lineare Phase der exponentiellen Amplifikation der PCR für jeden Primer-Satz.

Wenn sich der CT-Wert der Chip-DNA- und Input-Kontrollproben im linearen Bereich des CT-Werts befindet, berechnen Sie die Anreicherung der Chip-DNA im Vergleich zum Input unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors. Die Endreparatur erfolgt mit 0,1 bis fünf Mikrogramm der gechippten DNA in 50-Mikroliter-Reaktionen, die T4-DNA-Polymerase und T4-Polynukleotidkinase enthalten. Inkubieren Sie gemäß den Herstelleranweisungen 45 Minuten bei Raumtemperatur.

Reinigen Sie dann die DNA mithilfe eines MinElute-Reinigungskits. Fügen Sie anschließend Überhänge an das drei-prime-Ende mit DNA-Polymerase, einem großen CLA-NOW-Fragment und dATP hinzu, und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Führen Sie die Reaktion erneut über eine Spin-Säule, um die DNA zu reinigen und zu konzentrieren.

Fahren Sie mit der Ligierung unter Verwendung des Adapter-Oligos von Illumina mithilfe von T4-DNA-Ligase fort und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend reinigen Sie die Probe mit dem MinElute-Reaktionsreinigungs-Kit.

Eluieren Sie die DNA in 20 Mikrolitern. Trennen Sie danach die DNA-Probe mittels Elektrophorese unter Verwendung der Egel-Apparatur. Isolieren Sie das Band im Bereich von 200 bis 400 Basenpaaren im Gel und reinigen Sie es mit dem KYOGEN-Gel-Extraktionskit.

Amplifizieren Sie nun eine Bibliothek unter Verwendung von Paarend-Primern, Fusion-HF- und pH-Enzymen aus dem Illumina-Programm über 20 PCR-Zyklen. Isolieren Sie anschließend auf einem standardmäßigen 2 %igen AOSE-Gel DNA-Fragmente von 200 bis 400 Basenpaaren für die Hochdurchsatzsequenzierung in Ellens Software. Alignieren Sie alle Reads an das Drosophila-Genom, wobei bis zu zwei Mismatches zur Referenzsequenz erlaubt sind.

Behalten Sie eindeutig zugeordnete Reads für die nachgeschaltete Analyse mehrfach identischer Reads bei. Behalten Sie bis zu drei Kopien, um die Möglichkeit von Verzerrungen durch PCR-Amplifikation zu verringern. Verwenden Sie anschließend ein Python-Skript, um die Ausgabe der GA-Pipeline in browsererweiterbare Datendateien umzuwandeln.

Legen Sie eine Fenstergröße von vier Basenpaaren und eine DNA-Fragmentgröße von 160 Basenpaaren fest. Klassifizieren Sie die Drosophila-Gene anhand des RPKM-Werts in stille und exprimierte Gene. Digitale Zahl: weisen Sie Gene mit einem RPKM-Wert gleich null zu.

Als stillen Gruppe klassifizieren Sie Gene mit einem RPKM-Wert größer als eins in eine exprimierte Gruppe mit drei Untergruppen geringer, mäßiger und hoher Expressionsniveaus. Vergleichen Sie abschließend die Histonmodifikationen und Genexpressionsniveaus mithilfe eines Python-Skripts, das zuvor in „basal 2007, the bag of marbles“ beschrieben wurde. Mutante Testes zeigen einen Defekt beim Übergang von proliferierenden Spermatogonien zu differenzierenden Spermatocyten.

Dieses Chip-QPCR-Experiment verwendet BAM-Hoden als Quelle für undifferenzierte Keimzellen, um den Chromatinzustand wichtiger Gene zu untersuchen, die für die Spermien-Differenzierung erforderlich sind, sowie die Anreicherung von Histonmodifikationen, wie Histon-3-Lysin-27-Trimethylierung oder Histon-3-Lysin-4-Trimethylierung. Die Expression der Differenzierungsgene wird durch Normalisierung auf ein konstitutiv exprimiertes Cyclin-A-Gen bestimmt. Zu den Differenzierungsgenen zählen der männlichkeitsspezifische Transkriptionsfaktor 87 Don Juan und fuzzy onion, die in BAM-Hoden nicht exprimiert werden und stark mit der reprimierenden Histon-3-Lysin-27-Trimethylierung assoziiert sind.

Außerdem fehlt ihnen das aktive Histon. Drei, Lysin vier, Methyl drei Histonmodifikation. Eine Chromatinsignatur, die wir monovalent nennen, im Gegensatz zur Valenz mit sowohl Histon drei Lysin vier Methyl drei als auch Histon drei.

Lysin-27-Methyl-3 ist angereichert an Differenzierungsgenen in embryonalen Stammzellen. Chip-Sequenzdaten unter Verwendung desselben Antikörpersatzes. Bestätigen Sie das Chip-qPCR-Ergebnis, das in Abbildung 1 gezeigt wird: Genomische Regionen aller drei getesteten terminale Differenzierungsgene sind stark angereichert mit Histon-3-Lysin-27-Methyl-3, jedoch nicht mit Histon-3-Lysin-4-Methyl-3.

Im Gegensatz dazu weist der konstitutiv exprimierte Cyclin-Aging hohe Histon-drei-Lysin-vier-methyl-drei-, aber geringe Histon-drei-Lysin-27-methyl-drei-Mengen in der Nähe seiner Transkriptionsstartstelle auf. Diese Abbildung zeigt ChIP-seq-Daten zweier Histonmodifikationen in der Nähe der Transkriptionsstartstellen von vier unterschiedlich exprimierten Genklassen. Histon-drei-Lysin-27-methyl-drei ist stromabwärts der Transkriptionsstartstellen angereichert, was umgekehrt korreliert mit dem Genexpressionsniveau ist.

Die stillen Gene weisen den höchsten Methylierungsgrad von Histon drei, Lysin 27, Tri-Methyl auf; stark exprimierte Gene zeigen keine Bindung von Histon drei, Lysin 27, Tri-Methyl, was mit der reprimierenden Rolle von Histon drei, Lysin 27, Tri-Methyl bei der Genexpression übereinstimmt. Umgekehrt zeigte die Anreicherung der Modifikation Histon drei, Lysin vier, Tri-Methyl in der Nähe der Transkriptionsstartstellen eine entgegengesetzte Korrelation zum Genexpressionsniveau, was mit der aktivierenden Rolle von Histon drei, Lysin vier, Tri-Methyl bei der Genexpression übereinstimmt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei bis drei Tagen ordnungsgemäß durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, wenn Sie Phyl, Chloroform und Formaldehyd verwenden. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Ihnen ein ausreichendes Verständnis dafür vermittelt hat, wie die Chromatin-Immunpräzipitation genutzt werden kann, um die Chromatinlandschaft in vivo-Gewebe zu untersuchen.