Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Regionen spezifischer Genexpression zu identifizieren und den Zeitpunkt sowie die Intensität der Genexpression zu charakterisieren, um zum Verständnis der Genfunktion beizutragen. Dies wird erreicht, indem das Gewebe schnell geerntet und für das Verfahren vorbereitet wird, um die Integrität des Gewebes zu bewahren. Als zweiter Schritt wird das Gewebe behandelt, um die unspezifische Bindung von Ribo-Sonden zu verringern.

Anschließend werden die Ribo-Sonden an das Gewebe hybridisiert und die Bindung der RIBA-Sonde wird sichtbar gemacht. Mithilfe von Röntgenfilm oder lichtempfindlicher Emulsion erhält man Ergebnisse, die Ort und Ausmaß der Genexpression anhand von Röntgenaufnahmen oder Dunkel- und Hellfeldmikroskopie sowie deren Analyse zeigen. Mit der Image-J-Software gibt es mehrere kritische Schritte, die korrekt durchgeführt werden müssen und bei denen viele Personen Fehler begehen; einer davon ist die Vermeidung von Hintergrundsignalen.

Es gibt daher eine Reihe von Schritten, die Hintergrundsignal geben können, wie beispielsweise eine schlechte Sation oder das Hybridisieren bei einer ungeeigneten Temperatur. Ein weiterer Faktor ist RNA-Kontamination, die Ihre RNA-Sonde abbauen wird. Daher müssen Sie sorgfältig darauf achten, dass alle Materialien frei von RNasen sind.

Und drittens muss darauf geachtet werden, dass beim Eintauchen der Objektträger in die Emulsion im Dunkelraum keine Lichtundichtigkeiten auftreten oder die Emulsion während sämtlicher Stufen dieses dreiwöchigen Prozesses lichtempfindlich wird. Diese Technik wird Hun Chen demonstrieren, ein Postdoktorand in meinem Labor. Nach der Gewinnung eines frischen Gehirns und dem Spülen in 1× PBS wird das Gehirn in OCT-Gewebe-Einbettungsmedium eingelegt, indem das Gehirn in eine Form getaucht wird, die das Medium bei Raumtemperatur enthält.

Stellen Sie sicher, dass das Gehirn für den Schnitt entsprechend ausgerichtet ist. Danach sprühen Sie Ethanol auf das Trockeneis und frieren das Gewebe ein, indem Sie den Block in die Mischung aus Ethanol und Trockeneis legen. Achten Sie darauf, dass kein Ethanol in den Block gelangt, und schneiden Sie das gefrorene Gewebe mit einem Kryostaten in 10 bis 12 Mikrometer dicke Schnitte, die auf Super-Plus-Objektträgern für Gehirn- und embryonales Gewebe aufgebracht werden.

Die optimale Schnitttemperatur liegt im Bereich von minus 18 Grad Celsius bis minus 20 Grad Celsius. Lagern Sie die Schnitte in einer Objektträgerbox bei minus 80 Grad Celsius. Überführen Sie die Objektträger aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf ein Metallgestell mit Trockeneis.

Dann platzieren Sie den Rack im Gehäuse einer zertifizierten Abzugshaube in eine Lösung mit 4 % Paraformaldehyd, die zuvor auf drei bis fünf Grad Celsius über Raumtemperatur vorgewärmt wurde. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation entfernen Sie den Rack aus dem Paraformaldehyd und waschen die Objektträger, indem Sie den Rack 15-mal in PBS eintauchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, wobei Sie jedes Mal frische PBS-Lösung verwenden.

Als Nächstes werden die Objektträger 10 Minuten lang in frisch zubereiteter Azetylierungspufferlösung getaucht, um die unspezifische Bindung der RIBA-Sonde zu verringern. Anschließend werden die Objektträger wie zuvor gewaschen, diesmal jedoch mit zweifacher SSPE als Waschlösung. Das Gewebe wird durch eine alkoholische Reihe mit 70, 95 und 100 % Ethanol für jeweils zwei Minuten dehydriert.

Trocknen Sie die Objektträger anschließend mindestens 10 bis 15 Minuten im Abzug. Nach der Synthese der RIBA-Sonde gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll berechnen Sie das erforderliche Volumen der RIBA-Sonde und der Hybridisierungslösung, das für alle Objektträger benötigt wird. Prewarmen Sie die Hybridisierungsmischung der Ribo-Sonde fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius.

Um die Ribo-Sonde zu denaturieren, pipettieren Sie 100 Mikroliter der Ribo-Sonden-Hybridisierungslösung und verteilen Sie diese über die Deckglasfläche. Anschließend verwenden Sie ein zweites Deckglas, um die Lösung gleichmäßig über das Gewebe und das Deckglas zu verteilen. Stellen Sie den Objektträger horizontal und aufrecht in ein Metallgestell, und sobald alle Objektträger vorbereitet sind, tauchen Sie das Gestell langsam in ein Ölbad mit 65 Grad Celsius für mindestens vier Stunden und maximal 16 Stunden ein.

Das Öl erzeugt nach der Inkubation um die Deckgläser herum eine luftdichte Abdichtung. Entfernen Sie überschüssiges Öl vom Metallgestell, das die Objektträger enthält. Anschließend stellen Sie das Gestell in eine Glas- oder Metallschale, die Chloroform in einer Abzugshaube enthält. Wiederholen Sie die Wäsche mit einer zweiten Schale, die frisches Chloroform enthält.

Als Nächstes tauchen Sie den Rack in eine 0,1 %ige Beta-Me-Cap-Lösung in Ethanol plus zweifach konzentrierte SSPE-Lösung, um die Deckgläser zu lösen und überschüssige Hybridisierungslösung aufzulösen. Danach überführen Sie die Objektträger in eine zweite Lösung aus frischer 0,1 %iger Beta-Me-Cap-Lösung in Ethanol plus zweifach konzentrierter SSPE-Lösung. Überführen Sie die unbedeckten Objektträger in einen frischen Rack in einer Wanne, die 0,1 %ige Beta-Me-Cap-Lösung in Ethanol in zweifach konzentrierter SSPE enthält, und inkubieren Sie diese Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur, um überschüssige, nicht gebundene RNA-Sonde zu entfernen.

Überführen Sie dann das Objektträgergestell in vorgewärmte SSPE-Pufferlösung (2× SSPE) mit 50 % Hauptwaschlösung bei 65 Grad Celsius, die Beta-ME (Captoethanol) auf eine Endkonzentration von 0,1 % enthält, und inkubieren Sie eine Stunde bei 65 Grad Celsius. Nach der Inkubation entsorgen Sie diese und alle vorherigen wässrigen Waschlösungen sowie die Deckgläser als radioaktiven Abfall. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal je 30 Minuten lang in vorgewärmter SSPE-Pufferlösung (0,1× SSPE) bei 65 Grad Celsius.

Anschließend das Gewebe durch eine Ethanolreihe mit 70 %, 95 % und 100 % für jeweils zwei Minuten entwässern. Zum Schluss die Objektträger mindestens 30 Minuten in einem Abzug trocknen. Zunächst, um festzustellen, ob ein radioaktives Signal im Gewebe vorhanden ist.

Legen Sie die getrockneten Objektträger in eine Filmkassette und arbeiten Sie dabei in einem abgedunkelten Raum mit einer sicheren Beleuchtung. Legen Sie einen Röntgenfilm über die Objektträger. Achten Sie darauf, dass die Objektträger der Emulsionsseite des Films zugewandt sind, und schließen Sie dann die Kassette. Belichten Sie die Objektträger je nach erwarteter Häufigkeit der Transkripte zwischen einem und sieben Tagen auf den Film.

Nach Abschluss der Belichtung wird der Röntgenfilm in Standard-Entwickler und Fixierer entwickelt. Das Hybridisierungssignal erscheint als schwarze Bereiche auf dem Film, die durch belichtete Silberkörner in der Emulsion entstehen, um anschließend die zelluläre Auflösung zu bestimmen und das Signal direkt im Gewebe sichtbar zu machen. Die Objektträger werden in photographische Emulsion getaucht und anschließend kontrastgefärbt.

Wenn die Objektträger mit Crestalviolett kontrastgefärbt werden sollen, müssen die Schnitte gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll entparaffiniert werden. Gießen Sie zu diesem Zeitpunkt im Dunkelraum destilliertes Wasser in ein Reagenzglas. Nehmen Sie UC NTB-Emulsion heraus und verdünnen Sie die Emulsion mit destilliertem Wasser im Verhältnis eins zu eins.

Nachdem die Emulsion 20 bis 30 Minuten in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius geschmolzen wurde, überführen Sie sie in einen Glas-Tauchbehälter in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten. Der Stand der verdünnten Emulsion sollte nun alle Schnitte auf einem Objektträger bedecken, wenn dieser darin getaucht wird. Falls viele Objektträger vorliegen, kann zusätzliche Emulsion erforderlich sein.

Tauchen Sie die Objektträger nun in die verdünnte Emulsion in einem Wasserbad mit 42 Grad Celsius und trocknen Sie die getauchten Objektträger über Nacht in einem geschlossenen, lichtdichten Behälter im Dunkelraum oder zwei bis drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Ofen bei ausgeschaltetem Licht. Nach dem Trocknen bringen Sie die Objektträger in eine Objektträgerbox. Versiegeln Sie die Ränder mit schwarzer Isolierband und überziehen Sie sie anschließend mit Aluminiumfolie.

Bewahren Sie die Kästen bei vier Grad Celsius mehrere Tage bis Wochen lang auf, bis sie entwickelt werden sollen, und erwärmen Sie die Objektträger vor der Entwicklung auf Raumtemperatur. Entnehmen Sie dann im Dunkelraum den Gestellträger mit den Objektträgern den Kästen und entwickeln Sie sie drei bis fünf Minuten lang im Entwickler Codec D 19 bei 16 Grad Celsius. Anschließend waschen Sie die entwickelten Objektträger eine Minute lang bei Raumtemperatur mit Leitungswasser.

Anschließend die Objektträger zweimal je sechs Minuten in Fixierlösung bei 19 Grad Celsius inkubieren; während der zweiten Fixierungsinkubation können die Raumlichter eingeschaltet werden. Danach die Objektträger mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in fließendem Wasser waschen. Verwenden Sie nun ein Rasiermesser, um die Emulsion von der Rückseite des Objektträgers abzukratzen, während dieser noch nass ist.

Schließlich mit 0,3 % Kristallviolettlösung kontrastfärben und die Objektträger gegebenenfalls gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll dehydrieren und eindeckeln. Entfernen Sie überschüssige Emulsion auf der Rückseite der Objektträger, indem Sie sie mit Wasser benetzen und mit einem Rasiermesser abkratzen. Spülen Sie die Objektträger in 80 %iger Ethanolösung und wischen Sie sie ein- bis zweimal vorsichtig ab, um Rückstände und Staub zu entfernen.

Machen Sie Aufnahmen unter Dunkelfeld- oder Hellfeldbeleuchtung. Die Abkratz- und Reinigungsschritte müssen möglicherweise zwei bis drei Mal wiederholt werden, um gute Bilder ohne Staubpartikel zu erhalten, die im Dunkelfeld unter einem Stereomikroskop leicht sichtbar sind. Die folgenden Bilder sind Beispiele der Autoradiographie einer *in situ*-Hybridisierung von Röntgenfilmen.

Dieses Röntgenfilm-Bild zeigt einen sagittalen Gesamtkopfschnitt des Zebrafinken-Songvogels am embryonalen Tag 10, der mit einer Antisense-Ribo-Sonde für Fox P1 hybridisiert wurde. Die schwarzen belichteten Körnchen auf dem Film zeigen die Expression von Messenger-RNA, wie sie innerhalb der vier Gehirnregionen zu erkennen ist. Die Messenger-RNA für Fox P1 ist hier im Mesopallium, Striatum und dorsalem Thalamus angereichert. Das Röntgenfilm-Bild zeigt einen Schnitt desselben Zebrafinken-Songvogels, der mit der 90-Cent-RIBA-Sonde für Cuper hybridisiert wurde.

TF two Co.TF two ist angereichert im Bereich des Palam alium und des weiter ventralen Thalamus. Die folgenden Bilder zeigen Beispiele für Autoradiographien der *in situ*-Hybridisierung von Emulsionspräparaten. Dieses Dunkelfeldbild, aufgenommen unter einem Stereomikroskop, zeigt einen sagittalen Ganzkopfschnitt eines Zebrafinken am sechsten Tag nach dem Schlupf, der mit einer Antisense-RIBA-Sonde für Fox P one hybridisiert wurde.

Die weißen sichtbaren Silberkörner in der Emulsion über dem Gewebe zeigen die Expression von Boten-RNA. Die rote Färbung stellt die Kreuzfarbstainierung dar. Die Maßstabsleiste entspricht einem Millimeter.

Hier zeigt das Bild einen Ausschnitt aus demselben Singsperling der Zebrafinkenart, der mit einem Antisense-Ribosondensondens für Coop-TF-2 hybridisiert wurde. Die folgenden Bilder vergleichen die Antisense- und Sense-Färbung, die unterschiedliche Muster in der Autoradiographie auf Röntgenfilmen von Schnitten des Gehirns von Zebrafinken am embryonalen Tag 12 zeigen. Die gestrichelte Linie markiert die Kontur des gesamten Gehirns, und der Buchstabe C kennzeichnet das Kleinhirn.

Es ist ersichtlich, dass die Antisense-Sequenz von PAC sechs im Gehirn exprimiert wird, insbesondere in der ventrikulären Zone. Der angrenzende Schnitt, der mit der Sense-Sequenz von PAC sechs hybridisiert wurde, zeigt keine Hintergrundexpression im gesamten embryonalen Kopf, jedoch eine deutliche Expression in der Pigmentschicht der Netzhaut, wie bereits bei der Antisense-Sequenz beobachtet. Die folgenden Bilder zeigen in C zwei Signale der Genexpression sowie mit Emulsion bedeckte Objektträger, die aus dem Gehirn von Zebrafinken in späten embryonalen Stadien stammen und im Hellfeld- sowie Dunkelfeldblick aufgenommen wurden.

Dieses Hellfeldbild zeigt die Expression von D one B am embryonalen Tag 10. Bei normaler Belichtung auf die Emulsion ist die als schwarz erscheinende Markierung bei dieser Vergrößerung kaum sichtbar. Dieses Bild zeigt denselben Schnitt und dieselbe Vergrößerung wie im vorherigen Bild, jedoch im Dunkelfeld, wobei die Markierung im Striatum und Thalamus in Weiß erscheint.

Dieses Hellfeldbild zeigt die Expression von Slit drei am zwölften embryonalen Tag. Nach einer Überbelichtung der Emulsion ist die schwarze Markierung leicht zu erkennen. SC markiert die Position des Rückenmarks und CB markiert die Position des Kleinhirns.

Rostal ist nach links orientiert. Das hier gezeigte Bild stellt denselben Schnitt dar, lediglich die Betrachtungsweise wurde auf Dunkelfeld umgestellt, wodurch die Markierung im Rückenmark in Weiß erscheint, was der Hellfeldaufnahme entspricht. Die folgenden Bilder zeigen die Silberkorn-Auflösung auf zellulärer Ebene.

Hier ist Fox P1-Messenger-RNA, markiert mit Silberkörnern, die als schwarze Punkte über Zellen erscheinen, die mit Cresylviolett gefärbt sind, im Vorderhirn des Zebrafinken dargestellt. Dieses Bild zeigt einen hohen Expressionsgrad über einzelnen Zellen im mesoalen Bereich des erwachsenen Zebrafinken. Dieses Bild zeigt einen geringen Expressionsgrad über einzelnen Zellen im benachbarten Areal desselben Schnitts hier.

Hallo Fox. P-ein-Messenger. Die RNA-Expression über Zellen ist am embryonalen Tag 12 im Mesodarm zu sehen.

Die hier sichtbaren embryonalen Zellen sind kleiner und dichter gepackt im Vergleich zu den adulten Zellen in den beiden vorherigen Abbildungen. Schließlich zeigt dieses Bild eine schwache Expression über Zellen im benachbarten Alium desselben Schnitts. Nach Durchführung dieses Verfahrens kann eine andere Methode wie die Immunchemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, in welchem Zelltyp das Zielgen exprimiert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die In-situ-Hybridisierung durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Reagenzien äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets Sicherheitsvorkehrungen wie den Einsatz persönlicher Schutzausrüstung während dieses Verfahrens.