Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wirkung von Pseudomonas syringae PV Tomato auf redoxregulierte Proteine in Tomatenpflanzen zu beobachten. Inokulieren Sie zunächst Tomatenpflanzen mit Pseudomonas syringae PV Tomato, um eine Pathogeninfektion und die darauf folgende Proteinantwort auszulösen. Färben Sie anschließend mit DAB (DIAM-Benzidin), um Veränderungen der reaktiven Sauerstoffspezies sichtbar zu machen.

Dann führen Sie die Cystein-TMT-Markierung durch, um redoxregulierte Cysteine in Proteinen zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse können Veränderungen zwischen behandelten und Kontrollproben messen. Hallo, ich bin Chen aus der Abteilung Biologie und der Proteomik-Einrichtung hier an der University of Florida.

Der Vorteil unseres CTMT-Taggings gegenüber bestehenden Methoden wie dem mit Isotopen beschichteten Flossenmarkierer, auch bekannt als ASCA, liegt in der Möglichkeit der Multiplexanalyse redoxreaktiver Proteine im großen Maßstab. Während diese Demonstration Einblicke in rotregulierte Proteine der Tomate im Zusammenhang mit Pathogeninfektionen ermöglicht, kann das Experiment auch auf andere Systeme wie joof, Mäuse cu sowie andere Pflanzen und die Kontrolle unter Stressbedingungen angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand, nachdem wir erhebliche Unterschiede zwischen ICAD-Experimenten beobachtet hatten, da lediglich zwei Markierungen verfügbar sind.

Die VIS-Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Markierungs- und Anreicherungsschritte schwer zu erlernen sind. Experimentelle Variationen zwischen markierten Proben müssen minimiert und Entfernungsbereiche reduziert werden, um eine effiziente Markierung sicherzustellen. Beginnen wir. Züchten Sie zwei transplantierte Tomatensämlinge ähnlicher Größe in Töpfen mit vier Zoll Durchmesser für die Inokulumkultur.

Ein Rasen von Pseudomonas singe auf einer KBM-Platte. Die Bakterien in 20 Milliliter Wasser abkratzen und einen Bakterieninokulum mit etwa 10^6 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter herstellen. Vier Wochen alte Pflanzen für 30 Sekunden in ein Liter Inokulationspuffer in die bakterielle Inokulationslösung eintauchen.

Dann sofort mit durchsichtigen Plastiktüten abdecken. Nach der gewünschten Inkubationszeit das vollständig entfaltete Blatt entnehmen, die Epidermis nach oben platzieren und mit einer Milligramm pro Milliliter DAB-Anfärbung unter Vakuum für 15 Minuten infiltrieren. Anschließend die Blätter über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Nun die gefärbten Blätter 10 Minuten lang in 95 % Ethanol kochen und in 75 % Ethanol aufbewahren, wobei mit einem Mörser die geernteten Blätter in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen werden. Anschließend die Phenolextraktionen wie im begleitenden Text beschrieben durchführen.

Als Nächstes präzipitieren Sie die phenolextrahierten Proteine mit dem Fünffachen des Volumens kaltem 0,1-molarer Ammoniumacetatlösung in 100 % Methanol. Gewinnen Sie die Proteine durch Zentrifugation und führen Sie Pelletwäschen durch. Suspendieren Sie die Proben anschließend erneut in 1,5 Milliliter kaltem 70 %igem Ethanol und überführen Sie sie in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Nach der Zentrifugation das Ethanol-Überstand verwerfen und das Pellet kurz im Speed-Vak trocknen. Die Proben in einem denaturierenden Puffer zur Proteinaufreinigung auflösen, erneut zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden, den Überstand sammeln, den Überstand messen und die Proteinkonzentration gemäß Herstelleranleitung bestimmen. Für jeden der sechs Massentags beginnen Sie mit 100 Mikrogramm Proteinstichprobe und geben ein gleiches Volumen frisch zubereiteten alkylierenden Puffers mit 200 Millimolar IO-Acetamid zu, um die freien Thiolgruppen zu blockieren; 1 Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Proteine durch Zugabe von einem Milliliter kaltem, 80-prozentigem Aceton ausfällen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Pelletieren Sie das Protein durch Zentrifugation und waschen Sie es dreimal mit 80 % Aceton. Nach dem Lufttrocknen der Proben auf Eis resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Lysepuffer. Um die Disulfidbindungen zu reduzieren, geben Sie 0,5 Mikroliter 100 Millimolar TCEP hinzu und inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur.

Lösen Sie die Tags auf, indem Sie 20 Mikroliter Acetonitril zu den Reagenzröhren hinzufügen. Vortexen und kurz zentrifugieren, um überschüssiges TCEP zu entfernen. Geben Sie 50 Mikroliter Probe auf eine MicroCon-3-kD-Säule. Fügen Sie 50 Mikroliter Lysepuffer hinzu und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 10.000 × g und 4 °C.

Um die Probe zu sammeln, entfernen Sie die Säule, drehen sie auf einen sauberen Probengefäß um und zentrifugieren Sie. Überprüfen Sie gegebenenfalls den pH-Wert der Probe. Stellen Sie den pH-Wert zwischen sieben und acht mit einmolarer Salzsäure ein.

Fügen Sie fünf Mikroliter des cysteinspezifischen TMT-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die Proben, geben Sie ein gleiches Volumen an Laemmli-Puffer zu, erhitzen Sie fünf Minuten zum Sieden und trennen Sie die Probe auf einem vorgefertigten 12 %igen Polyacrylamidgel. Spülen Sie das Gel dreimal mit filtriertem Wasser, färben Sie es eine Stunde mit Coomassie-Blau und entfärben Sie es über Nacht in Wasser, basierend auf der Proteinkonzentration der Banden. Teilen Sie jede Gelelektrophorese-Spur in 12 Fraktionen auf. Schneiden Sie jede Fraktion in etwa ein Millimeter große Stücke und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Die Gelstücke vollständig mit 0,1 molarer Ammoniumbicarbonatlösung in 50 % Acetonitril ansäuern. Danach die Stücke mit 100 % Acetonitril für 15 Minuten bedecken. Die Flüssigkeit entfernen und die Stücke mit einem Speedvac trocknen.

Fügen Sie anschließend ein gleiches Volumen an Trypsin-Lösung hinzu und stellen Sie zum Rehydratisieren auf Eis. Inkubieren Sie dann 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius zur tryptischen Verdauung. Entfernen Sie danach den flüssigen Proteinextrakt aus den inkubierten Proben.

Stoppen Sie die Reaktion und entfernen Sie eventuell verbleibenden Proteinverdau, indem Sie die Gelstücke mit 5 % Ameisensäure, 50 % Acetonitril bedecken. Schütteln Sie die Gelstücke dann 20 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie das Überstand nach zwei weiteren Extraktionen in die Röhrchen mit den extrahierten Proteinen.

Trocknen Sie die Proben unter einem Speed-Vakuum in 0,5-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie eine 50%ige Suspension des Anti-TMT-Harzes in TBS mit einer Konzentration vor, die proportional zur Intensität des jeweiligen Proteinbands ist. Waschen Sie das Harz dreimal mit einem Säulenvolumen 1× TBS und geben Sie anschließend 200 Mikroliter TBS zu jeder Probe hinzu.

Anschließend auf Anti-TMT-Harz übertragen und zwei Stunden bei Raumtemperatur schütteln, gefolgt von einer Übernacht-Rotation bei vier Grad Celsius. Jede Probe auf eine Säule laden. Säulenspülungen mit jeweils 200 Mikrolitern durchführen.

Anschließend jede Probe dreimal mit 200 Mikrolitern 50 % Elutionspuffer eluieren und im Vakuum trocknen. Resuspendieren Sie die Proben in 12 Mikrolitern 3 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure und injizieren Sie 5 Mikroliter direkt auf eine HPLC-Säule. Eluieren Sie die Peptide mithilfe eines steigenden Acetonitril-Gradienten, wie im begleitenden Text beschrieben.

Verwenden Sie die Massenspektrometrie, um Peptide in einem Top-two-by-three-Workflow nachzuweisen. Beginnen Sie mit einer einstufigen MS. Erheben Sie anschließend drei MS/MS-Spektren mit Fragmentierung durch C-trapped Dissociation mit höherer Energie, gefolgt von drei weiteren.

Ms.MS mit kollisionsinduzierter Dissoziation zur Proteinidentifizierung. Analysieren Sie die Massenspektrometriedaten mithilfe eines verzweigten Workflows. Setzen Sie einen Reporter-Ionen-Quantifizierer ein, um das Verhältnis zu bestimmen.

Verarbeiten Sie außerdem das MSM-MS-Spektrum über die Knoten Spektrum-Selektor, Spektrum-Normalisierer und Spektrum-Gruppierer und führen Sie eine Datenabfrage über die Suchmaschine Seaquest durch. Diese Abbildung zeigt Beispiele eines kontrollierten Tomatenpflanzenblatts auf der linken Seite und eines mit Pseudomonas inoculierten Blatts auf der rechten Seite, nachdem die Blätter mit DAB angefärbt wurden. Das DES-Färbeprotokoll ermöglicht es, mithilfe der histochemischen Färbung Anzeichen reaktiver Sauerstoffspezies im Blattgewebe sichtbar zu machen.

Wie erwartet zeigt die Kontrolle keine signifikante Färbung, während die mit Pseudomonas behandelten Blätter positiv auf die Produktion von Wasserstoffperoxid gefärbt sind. Dieses Beispiel zeigt die Proteom-Entdeckungs-Datenausgabe eines differenziell redoxregulierten Protein-Peakbereichs für jede Probe, die eine absolute Quantifizierung ermöglicht. Der Peakbereich zwischen Kontroll- und inoculierten Proben zeigt relative Mengen an.

Hier ist die Redoxregulation eines Proteins zwischen einer Kontroll- und einer inoculierten Probe ähnlich. Spitzen ähnlicher Intensität deuten auf das Vorhandensein von Disulfidbrücken hin, die durch eine Änderung der Behandlung nicht reguliert werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Woche korrekt durchgeführt werden.

Denken Sie daran, die Proben kühl zu lagern und die Beschriftungen geordnet zu halten. Verwenden Sie außerdem Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Phenol, wie zum Beispiel Einweghandschuhe und Arbeiten im Abzug, gemäß diesem Verfahren. Weitere Maßnahmen wie spezifische Massenspektrometrie-Analysen posttranslationaler Modifikationen können durchgeführt werden, um andere Systemmodifikationen wie Onsäure und Glutenstimulation zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die DIB-Stand-CTMD-Aktivierung und die Redox-16-Qualifizierung durchführt.