Name: In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Lernen Sie die In-ovo-Elektroporation in der embryonalen Hühnchenretina zur Untersuchung von Genexpression und morphologischen Veränderungen während der Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung einzelner retinaler Zelltypen.

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Wir danken Herrn Maaz Enver für die Nutzung seiner HD-Kamera (Cannon VIXIA HFS100) zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von NIH (EY018738), New Jersey Kommission über die Spinal Cord Research (08 bis 3074-SCR-E-0 und 10-3091-SCR-E-0), und Busch Biomedical Research Award unterstützt.

Da einige Teile des Protokolls durchgeführt werden als zuvor in anderen JoVE Videos 2 und 3 Papiere mit geringen Modifikationen beschrieben werden wir nicht zu diskutieren, die hier im Detail. 1. Egg Handhabung und Zubereitung Needle <ol><li> Eier können in einem Wein gelagert-Kühler werden bei etwa 13 ° C für bis zu 1 Gespräch. Wenn die Temperatur zu hoch ist, werden Embryonen anfangen, abnormal entwickeln, während niedrigere Temperatur bewirkt eine hohe Mortalität. Sobald Sie bereit sind zu bebrüten nehmen Sie die Eier aus dem Weinkühler und legen die Eier senkrecht mit dem größeren Ende auf. Halten Sie die Eier in der Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden, bevor sie sie in der 37,5 ° C Inkubator. </li><li> Bebrüten die Eier für 96 bis 100 Stunden, die über embryonalen Tag 4 ist zu Embryonen, die in der Hamburger und Hamilton Stufe 22 sind 5.4 zu erhalten. </li><li> Bereiten Mikropipette Nadeln aus gezogen Glaskapillarrohre und brechen Sie die Spitze unter einem Präpariermikroskop MikroUmfang mit einer Pinzette, um eine Spitze Eröffnung etwa 0,1 &amp;mgr; m im Durchmesser und 20 mm Aufnahme zu bekommen. Nadeln mit größeren Schwierigkeiten haben, Tipps Durchstechen der Dotterhaut, während kleinere Spitzen Schwierigkeiten haben, das Be-und Bereitstellung der DNA-Lösung. </li><li> Befestigen Sie die Nadel auf eine 0,1 ml Hamilton gasdichten Spritze auf einem Mikromanipulator montiert. Verwenden Sie ein kleines Stück Masterplex Silikonschlauch zur Befestigung der Nadel auf die Spritze. Da die Verbindungen dicht sind nicht nötig, Mineralöl hinzufügen, um diese Bindung zu versiegeln. </li><li> Mischen Sie 2 ul-Reporter-Plasmid-DNA-Lösung mit einer Konzentration im Bereich 3-6 ug / ul und 0,2 ul schnell grün (0,025%) auf einem Stück Parafilm. Schnelle grünen Farbstoff wird helfen, die Injektion zu visualisieren. Langsam, laden Sie die Nadel mit der Mischung. </li><li> Um die Dotterhaut von der inneren Membran frei drehen Sie das Ei vorsichtig um 180 ° und warten Sie einige Minuten und drehen Sie ihn zurück in die ursprüngliche Position und stellen Sie ihn für die Elektroporation. </li><li> Wischen Sie die FORCeps und Eierschale mit 70% Ethanol auf eine Infektion des Embryos zu vermeiden. </li><li> Machen Sie ein kleines Loch auf dem Ei unmittelbar über dem Luft-Zelle mit einem Paar der Größe AA Pinzette. Achten Sie darauf, die Eischale zu knacken. Entfernen Sie kleine Stücke ein zu einer Zeit um ein kleines Fenster zu machen. Entfernen Sie vorsichtig die innere Membran mit Hilfe der Pinzette ohne Berührung der Dotterhaut. </li></ol> 2. Injektion und Elektroporation <ol><li> Um eine Beschädigung des Gehirns oder des Herzens, die Position der Nadel kontralateralen der wichtigsten Bündel von Blutgefäßen in das Auge eintritt und weisenden Schnabel zu verhindern. </li><li> Pierce durch die Dotterhaut, Lederhaut, Netzhaut und des Glaskörpers durch einen plötzlichen milden Druck auf die Nadel. Wenn die Nadel sticht durch das andere Ende des Auges sollte es in Ordnung sein, wenn es keine größeren Vene Blut schädigt. </li><li> Langsam nach hinten ziehen Sie die Nadel an der Kante der Öffnung und legen Sie es fast Tangente an der Außenwand des Augapfels. </li><li> Insert die Nadel in den Sub retinalen Raum zwischen der Lederhaut und Netzhaut. </li><li> Spritzen Sie die DNA, bis Sie die grüne Lösung Füllen der Seite des Augapfels und Schieben der Netzhaut nach innen durch die Schaffung einer Ausbuchtung visualisieren können. </li><li> Wenn Ihre Nadel Platzierung nicht korrekt ist dann wirst du sehen die DNA-Lösung Ausbreitung im Inneren des Glaskörpers Auffüllen der Mitte des Augapfels. Auch, wenn Sie die Netzhaut beschädigen zu viel dann werden Sie sehen die DNA-Lösung kommt aus dem Augapfel. </li><li> Langsam entfernen Sie die Nadel und sofort platzieren die Elektroden parallel im Ei nach dem Einweichen in PBS. Drücken Sie die Elektroden zu versenken in das Fruchtwasser in einer Weise, so dass das Auge injiziert zwischen den Elektroden befindet. Berühren Sie keine größeren Blutgefäße oder das Herz mit den Elektroden beim Platzieren sie. Die negative Elektrode sollte an der Injektionsstelle Seite zu sein so dass die DNA von sub retinalen Raum in der Netzhaut in Richtung positive Elektrode transportiert werden kann. ElectroCorporate die Netzhaut mit 5 Impulsen von 15V für 50 ms mit 950 ms Intervallen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und dichten die Fenster des Eies mit Stücken von klaren Tesafilm. </li><li> Label-und datieren Sie das Ei injiziert, bevor es wieder in den Inkubator. Normalerweise dauert es etwa 3 bis 5 Minuten bis die ganze Elektroporation Vorgang abzuschließen. </li><li> GFP-Expression kann so früh wie 8 Stunden nach der Elektroporation gesehen werden. Allerdings können Sie warten, bis der Embryo auf die gewünschte Stufe vor der Ernte. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse In unserer Studie verwenden wir verschiedene Plasmid-Konstrukte, um die Regulation der Genexpression, dass retinalen Zell-Entwicklung beteiligt zu studieren. In diesem Video pCAG-GFP (Transfektion Kontrolle) wurde verwendet, um eine erfolgreiche Injektion und Elektroporation folgen. Es kann jedoch jedes Plasmid Konstrukt mit Reportergen (GFP, RFP usw.) verwendet werden. Auch wenn GFP-Expression kann so früh wie 8 Stunden nach der Ele gesehen werdenctroporation wir in der Regel beginnen die Ernte das Ei am Tag 6 (E6) und weiter. Elektroporiertem Netzhäute wurden aus dem Embryo seziert und analysiert unter fluoreszierendem Dissektionsmikroskop vor Einbetten und Schneiden. Typischerweise kann die Expression des Reportergens zumindest in einem Quartal der Netzhaut nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abb. 1) gesehen werden. Die transfizierten retinalen Gewebe wurden durch weitere Schnitte für eine klare Visualisierung von Zellmorphologien analysiert. Immunhistochemie mit Zelltyp-spezifische Marker (Brn3a, Pax6 etc.) erlaubt die Charakterisierung von Zell-spezifischen GFP-Expression (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/3792/3792fig1.jpg" align="Figure 1" /> Abbildung 1. Erfolgreiche Elektroporation von Reporterplasmid Ergebnisse positiv GFP-Expression. Huhn embryonalen Netzhaut injiziert wurden und an embryonalen Tag 4 elektroporiert und geerntet an embryonalen Tag 6. Mindestens 25% der Netzhaut wurde erfolgreich transfiziert (A = Ansicht von oben, B= Ansicht von unten). Maßstab = 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/3792/3792fig2.jpg" align="Figure 2" /> Abbildung 2. Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellen der Netzhaut mittels Immunhistochemie. GFP exprimierenden Netzhautgewebe bei E7 Bühne waren fester und geschnitten. Diese Schnitte wurden dann mit verschiedenen Zell-spezifische Marker gefärbt. Brn3a wurde verwendet, um Ganglienzellen (A) zu bestimmen, während Pax6 wurde verwendet, um horizontale, Amacrin und Ganglienzellen (B) zu bestimmen. Balken = 50 um.

<ol><li>Doh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+retinal+cell+development+in+chick+embryo+by+immunohistochemistry+and+in+ovo+electroporation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques.</a> BMC. Dev. Biol. 10, (2010).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn.%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stage+series+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The stage series of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).</li>
</ol>

Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Einrichtungen Ausschuss an der Rutgers University zugelassen.

Gezielte Injektion Netzhaut und in ovo Elektroporation in embryonale Retina bei E4 Bühne können gezielt retinalen Vorläuferzellen was in der Fähigkeit, alle sechs großen Netzhaut Zelltypen auf der Ebene einzelner Zellen sichtbar zu machen. In ovo Elektroporation bei HH10 (~ E1.5), deren Zielgruppe die Augenblase ist in der Lage, Zellen, die um das Auge bilden entwickeln transfizieren. Jedoch haben diese Zellen eine sehr hohe Fluktuation in dieser Zeit und dieses Verfahren ist nicht spezifisch für Zelle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Befruchteten pathogen-freien (SPF) White Leghorn Hühnereiern </td><td> Sonnenaufgang Bauernhöfe (Catskill, NY) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hühnerei Inkubator </td><td> DQR Fertigung, Savannah, GA </td><td> Modell-1550 </td><td> Set zu 60% Luftfeuchtigkeit und 37,5 ° C. </td></tr><tr><td> Glaskapillarrohre </td><td> World Precision Instruments Inc. </td><td> TW150F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1-ml-Spritze </td><td> Hamilton Co. Reno, Nevada </td><td> Gasdichte 1710 </td><td> Alternativ 1 ml-Spritze kann ebenso verwendet werden </td></tr><tr><td> Masterflex Silikon (Peroxid) Tubing </td><td> Cole-Parmer </td><td> HV-96400-13 </td&gt; <td> Schneiden Sie ein kleines Stück (1 cm) zum Befestigen das Glas Nadel an der Spritze </td></tr><tr><td> Pinzette </td><td> Dumont </td><td> AA </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulator </td><td> World Precision Instruments Inc. </td><td> M3301-M3 </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid-DNA </td><td></td><td></td><td> pCAG-GFP wurde von Dr. Connie Cepko ausgeliehen </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Verdünnen Sie es zu 0,025% mit PBS </td></tr><tr><td> Impulsgeber </td><td> Harvard Apparatus, MA </td><td> BTX ECM 830 </td><td> Rechteckgenerator </td></tr><tr><td> Elektroden </td><td> Harvard Apparatus, MA </td><td> BTX-Modell 514 </td><td> Unsere Elektroden wurden 3-5 mm voneinander beabstandet </td></tr><tr><td> Monochrome Digitalkamera </td><td> Zeiss, Deutschland </td><td> Einxiocam MRM </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszierende Dissektionsmikroskop </td><td> Leica Microsystems, Deutschland </td><td> Leica MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechtes Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss, Deutschland </td><td> Zeiss Axio Imager A1 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo elektroporation in embryonalen hühnchenretina

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Huhn embryonalen Netzhaut ist ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Entwicklung der Retina bei höheren Wirbeltieren zu studieren. Aufgrund der Größe und externen Entwicklung ist es vergleichsweise sehr einfach, die Küken embryonalen Netzhaut mittels rekombinanter DNA / RNA-Technologie zu manipulieren. Elektroporation von DNA / RNA-Konstrukte in der embryonalen Retina haben einen großen Vorteil, um Genregulation in retinalen Stammzellen / Vorläuferzellen während der Entwicklung der Retina zu untersuchen. Verschiedene Arten von Assays wie Reportergenassay, Gen-Überexpression, Gen niederschlagen (shRNA) etc. kann mit Hilfe der Elektroporation Technik werden. Dieses Video demonstriert gezielte Einspritz-und Retina-in-ovo-Elektroporation in die embryonale Hühnchenretina in der Hamburger und Hamilton Stadium 22-23, die etwa embryonalen Tag 4 (E4) ist. Hier zeigen wir eines schnellen und komfortablen in-ovo-Elektroporation Technik, bei der eine Plasmid-DNA, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) drückt als Marker wird direkt in die gelieferteKükenembryonen subretinalen Raum, gefolgt von elektrischen Impulsen zur DNA-Aufnahme durch Netzhaut-Stammzellen / Vorläuferzellen zu erleichtern. Die neue Methode der retinalen Injektion und Elektroporation auf E4 ermöglicht die Visualisierung der einzelnen retinalen Zelltypen, einschließlich der spätgeborene Neuronen 1, die schwierig gewesen ist mit dem herkömmlichen Verfahren der Injektion und Elektroporation bei E1.5 2.

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen und<em&gt; In-ovo-</em&gt; Elektroporation von DNA / RNA-Konstrukten in das Küken embryonalen Netzhaut an der Hamburger und Hamilton Stadium 22-23, die etwa embryonalen Tag 4 (E4) ist. Diese Technik ist sehr nützlich, um die Genexpression, Genregulation und morphologische Veränderung bei der Entwicklung Hühnchenretina studieren.

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Die Netzhaut von Hühnchenembryonen ist ein hervorragendes Instrument zur Untersuchung der retinalen Entwicklung bei höheren Wirbeltieren. Aufgrund der geringen Größe und der externen Entwicklung ist sie ...

Hallo, ich bin Mohammed Islam. Ich bin Doktorand im Labor von Dr. Lee am Fachbereich Biomedizinische Technik der Rutger University. Heute zeige ich Ihnen, wie man eine gezielte Netzhautinjektion und eine in vivo Elektroporation durchführt.Im Chi-Embryo werden wir das embryonale Hühnerretina im Stadium des vierten Embryotages, also etwa 96 Stunden nach der Entzündung, einpflanzen. Diese Technik gilt als neuartige Methode zur Untersuchung der Netzhautentwicklung. Die Methode zielt gezielt auf retinale Vorläuferzellen ab und ermöglicht es, alle Netzhautzelltypen auf Einzelzellniveau sichtbar zu machen.Es kann auch bei Funktionsgewinn- oder Funktionsverlust-Studien angewendet werden, bei denen ein Gen von Interesse gezielt auf die Untersuchung der normalen Entwicklung oder von Erkrankungen der Netzhaut ausgerichtet werden kann. X kann bis zu einer Woche lang in einer Weinkühlung bei etwa 13 Grad Celsius aufbewahrt werden. Wenn die Temperatur zu hoch ist, beginnen sich die Embryonen abnormally zu entwickeln, während eine niedrigere Temperatur eine hohe Sterblichkeit verursacht.Sobald Sie bereit sind, die Inkubation zu beginnen, nehmen Sie die Eier aus dem Weink&uuml;hlschrank und stellen Sie sie senkrecht mit dem dickeren Ende nach oben. Halten Sie die Eier mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sie in den 37,5 &deg;C warmen Inkubator stellen. Inkubieren Sie die Eier etwa 96 Stunden lang, was etwa dem vierten Embryotag entspricht.Um Embryonen im Hamburger-und-Hamilton-Stadium 22 zu erhalten, ziehen Sie Mikropipettenspitzen aus Glas-Kapillarrohren und brechen Sie die Spitze unter einem Stereomikroskop mit einer Pinzette ab, um eine Öffnung von etwa 0,1 Mikrometer Durchmesser und eine zweimillimeterlange Abschrägung zu erhalten. Nadeln mit größeren Spitzen haben Schwierigkeiten, die Vitellinmembran zu durchdringen. Kleinere Spitzen hingegen erschweren das Befüllen und die Abgabe der DNA-Lösung. Befestigen Sie die Nadel an einer Hamilton-Spritzenspritze, die auf einem Mikromanipulator montiert ist.Verwenden Sie ein kleines Stück Master-Plex-Silikonrohr, um die Nadel an die Spritze anzuschließen. Da die Verbindungen verknotet sind, ist kein Zusatz von Mineralöl erforderlich. Um diese Verbindung abzudichten, mischen Sie zwei Mikroliter Reporter-Plasmid-DNA-Lösung mit einer Konzentration von drei bis sechs Mikrogramm pro Mikroliter und 0,2 Mikroliter Fast Green auf einem Stück Peripherie. Die Fast-Green-Färbung hilft dabei, die Injektion zu visualisieren. Laden Sie die Nadel langsam mit der Mischung, um die Vitellinmembran von der Innenmembran zu lösen. Drehen Sie das Ei vorsichtig um etwa 180 Grad und warten Sie einige Minuten.Drehen Sie es dann in die ursprüngliche Position zurück und bereiten Sie es für die Elektroporation vor. Wischen Sie die Pinzette und die Eierschale mit 70 %igem Ethanol ab, um eine Infektion des Embryos zu vermeiden. Stellen Sie mit einer Pinzette ein kleines Loch in das Ei direkt über der Luftkammer her. Passen Sie auf, dass Sie die Eierschale nicht anreißen. Entfernen Sie kleine Stücke einzeln, um ein kleines Fenster zu erzeugen. Entfernen Sie vorsichtig die innere Membran mit der Pinzette, ohne die vitale Membran zu berühren, um Schäden am Gehirn oder am Herzen zu vermeiden.Positionieren Sie die Nadel kontralateral zum Hauptgefäßbündel, das in das Auge eintritt, wie durch den Pfeil angezeigt, und richten Sie sie in Richtung des Schnabels aus. Durchstoßen Sie die vitale Membran, die Sklera-Retina und das Glaskörperhumor. Durch einen plötzlichen, kräftigen Stoß mit der Nadel sollte es in Ordnung sein, wenn die Nadel das andere Ende des Auges durchdringt, solange keine größeren Blutgefäße beschädigt werden.Ziehen Sie die Nadel langsam am Rand der Öffnung zurück und platzieren Sie sie nahezu tangential zur äußeren Wand des Augapfels. Führen Sie die Nadel in den subretinalen Raum zwischen Sklera und Retina ein. Injizieren Sie die DNA, bis Sie die grüne Lösung sichtbar werden sehen, die die Seite des Augapfels füllt und die Retina nach innen drückt, wodurch eine Ausbuchtung entsteht.Hier ist ein weiteres gutes Beispiel für eine erfolgreiche Injektion mit Bildung einer Blase, wie in diesem Diagramm veranschaulicht. Falls die Platzierung Ihrer Nadel nicht korrekt war, werden Sie sehen, dass sich die DNA-Lösung im Glaskörper ausbreitet und den mittleren Bereich des Augapfels ausfüllt. Außerdem werden Sie beobachten, dass die DNA-Lösung aus dem Augapfel austritt, falls Sie die Netzhaut zu stark beschädigen.Entfernen Sie die Nadel langsam und platzieren Sie die Elektroden unmittelbar parallel innerhalb des Eis. Nach dem Einweichen in PBS drücken Sie die Elektroden nach unten, sodass sie in die Amnionflüssigkeit eintauchen, und positionieren Sie sie so, dass das injizierte Auge zwischen den Elektroden liegt. Vermeiden Sie es, während des Platzierens größere Blutgefäße oder das Herz mit den Elektroden zu berühren.Die negativen Elektroden sollten sich an der Injektionsstelle befinden, damit die DNA vom subretinalen Raum in die Netzhaut in Richtung der positiven Elektrode transportiert werden kann. Elektrolyse der Netzhaut mit fünf Impulsen à 15 Volt für 50 Millisekunden mit 950 Millisekunden langen Intervallen. Entfernen Sie die Elektroden vorsichtig und verschließen Sie das Fenster des Eis mit durchsichtigen Klebestreifen, beschriften und datieren Sie das injizierte Ei, bevor Sie es zurück in den Inkubator stellen.In der Regel dauert der gesamte Elektroporationsvorgang etwa drei bis fünf Minuten. Die GFP-Expression kann bereits acht Stunden nach der Elektroporation sichtbar werden. Sie können jedoch warten, bis das Embryo den gewünschten Zustand erreicht hat, bevor Sie das Ei gewinnen.Ich hoffe, dieses Video war hilfreich für Ihr eigenes Experiment. Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Forschung

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Biologie

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