Name: Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Lernen Sie die DNA-Familie-Shuffling-Methode zur Entwicklung synthetischer AAV-Vektoren für die Gentherapie. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung hochdiverser Kapsid-Bibliotheken mit über einer Million Varianten.

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Die Autoren danken für herausragende Unterstützung ihrer Labor-, Team-Mitglieder und Arbeit des Exzellenzclusters CellNetworks an der Universität Heidelberg sowie von der Chica und Heinz Schaller (CHS) Fundament. Wir schätzen, dass die molekulare Evolution über AAV DNA shuffling Familie hat sich ein sehr aktives Gebiet seit unserer ersten Veröffentlichung vor drei Jahren und so allen Autoren einschlägiger Publikationen, deren Arbeit nicht hier aus Platzgründen zitiert werden entschuldigen.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie nichts zu offenbaren haben.

Hier haben wir wesentliche experimentelle Schritte und Richtlinien für die AAV-Kapsid Engineering über DNA-Shuffling und Familie für die Evolution in Zellen oder Tiere dargestellt. Im Wesentlichen sind diese Protokolle standardisierte Versionen der Verfahren, die wir zunächst innerhalb der AAV-Bereich berichtet in 2008 3. Während eine Flut von Follow-up-Studien von anderen zahlreichen Modifikationen zB 10-13 berichtet haben, stellen unsere gegenwärtigen Versionen grundlegende Strategien Na...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polyethylenimin (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td></tr><tr><td> Restriktionsenzyme </td><td> NEB </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gelextraktionskit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Phusion Polymerase II Kit </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar Hifi-Polymerase-Kit </td><td> Qiagen </td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (Teil-Kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (Teil-Kit) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4855,2 </td></tr><tr><td> Ampicilin Natriumsalz </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTPs (10 mM, 100 ul) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanol (Optiprep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td> Merck </td><td> 107241 </td></tr><tr><td> Plasmid Mega Prep Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12181 </td></tr><tr><td> Ultrazentrifugation </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Quick-Seal Zentrifugenröhrchen </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342414 </td></tr><tr><td> Die Elektroporation Einheit </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Thermocycler </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACS-Analyser </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MEGAX DH10B T1R Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101695 </td></tr><tr><td> Adenovirus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBluescript II KS (+)-Plasmid </td><td> Stratagene </td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac I-Stelle in gelb, CAP5-spezifische Sequenzen in Fettdruck): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Benutzerdefinierte Primer </td></tr><tr><td> cap5R (Asc I-Stelle in Grün, CAP5-spezifische Sequenzen in Fettdruck): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Benutzerdefinierte Primer </td></tr></tbody></table>

engineering and evolution of synthetic adeno-assoziierte virus (aav) vektoren für die gentherapie über dna-familie shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren repräsentieren einige der stärksten und viel versprechende therapeutische Fahrzeuge für die menschliche Gen-Transfer aufgrund einer einzigartigen Kombination von positiven Eigenschaften ein. Dazu gehören die Apathogenität der zugrunde liegenden Wildtyp Viren und hochentwickelte Methoden zur Herstellung von hohem Titer, hoher Reinheit und klinisch-Klasse rekombinanten Vektoren 2. Ein weiterer besonderer Vorteil des AAV-Systems gegenüber anderen Viren ist die Verfügbarkeit von einer Vielzahl von natürlich vorkommenden Serotypen, die in wesentlichen Eigenschaften unterscheiden sich noch, lassen sich bequem als Vektoren mit Hilfe eines gemeinsamen Protokolls 1,2 konstruiert werden. Darüber hinaus wurden eine Reihe von Gruppen, einschließlich unserer eigenen kürzlich Strategien, um diese natürlichen Viren als Vorlagen für die Erstellung von synthetischen Vektoren, die entweder vereinen die Vorzüge von mehreren Input-Serotypen, oder durch die der Eigenschaften eines einzelnen isolieren verwenden ausgedacht. Die entsprechenden Technologien, um diese Ziele zu erreichen are Familie entweder DNA shuffling 3, dh Fragmentierung der verschiedenen AAV-Kapsid Gene durch ihre erneute Montage auf partielle Homologien (typischerweise&gt; 80% für die meisten AAV-Serotypen) oder Peptid-Display 4,5, dh Einfügen von in der Regel sieben Aminosäuren in der Basis gefolgt eine freiliegende Schleife des viralen Kapsids wobei das Peptid im Idealfall vermittelt wieder Ausrichtung auf einen gewünschten Zelltyp. Für maximalen Erfolg, sind beide Methoden in einem High-Throughput-Mode, wobei die Protokolle werden hochskaliert, um Bibliotheken von rund einer Million verschiedene Varianten ergeben Kapsid angewendet. Jeder Klon wird dann aus einer einzigartigen Kombination von zahlreichen elterliche Viren (DNA-Shuffling-Ansatz) umfasst oder enthält einen unverwechselbaren Peptids innerhalb der gleichen viralen Rückgrat (Peptid-Display-Ansatz). In der abschließenden Schritt ist iterativen Auswahl einer solchen Bibliothek auf Zielzellen, um für einzelne Kapside erfüllen die meisten oder am besten alle Anforderungen des Auswahlverfahrens zu bereichern. Die letztere vorzugsweise Kammines Überdruck, wie Wachstum auf einem bestimmten Zelltyp von Interesse, mit negativer Selektion, zum Beispiel Beseitigung aller Kapside Umsetzung mit Anti-AAV Antikörper. Diese Kombination erhöht die Chancen, dass synthetische Kapside überlebenden die Auswahl die Bedürfnisse der jeweiligen Anwendung, in einer Weise, die wahrscheinlich nicht in jeder beliebigen natürlich vorkommenden AAV isolieren gefunden übereinstimmen. Hier konzentrieren wir uns auf die DNA-Familie schlurfenden Methode als theoretisch und experimentell schwierigere der beiden Technologien. Wir beschreiben und zeigen alle wesentlichen Schritte für die Erzeugung und Auswahl von neu gemischt AAV-Bibliotheken (Abb. 1), und dann besprechen die Fallstricke und kritische Aspekte der Protokolle, die man braucht, um sich bewusst sein, um mit molekularen Evolution AAV erfolgreich zu sein.

Wir zeigen die grundlegende Technik zur molekularen konstruieren und zu entwickeln synthetischen Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren für die Gentherapie durch DNA-Shuffling Familie. Darüber hinaus bieten wir allgemeine Richtlinien und repräsentative Beispiele für die Auswahl und Analyse der einzelnen chimären Kapside mit verbesserten Eigenschaften auf Ziel-Zellen in Kultur oder in der Maus.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

Adeno-assoziierte virale (AAV)-Vektoren stellen aufgrund einer einzigartigen ... einige der potentesten und vielversprechendsten Vehikel für den therapeutischen Gentransfer beim Menschen dar.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine hochdiverse Bibliothek synthetischer adenoassoziierter viraler Kapside zu erzeugen, aus der Partikel mit einer gewünschten Eigenschaft ausgewählt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst fragmentierte, klonierte und ausgewählte a a v-Kapsidgene durch eine kontrollierte DNA-Einschnittverdauung präpariert werden, um ihre anschließende Wiederassemblierung in chimäre Sequenzen mittels zweier PCR-Reaktionen zu ermöglichen. Im zweiten Schritt wird das resultierende PCR-Produkt zurück in einen replikationskompetenten a a v-Vektor kloniert, um eine Plasmidbibliothek zu erzeugen, die mindestens eine Million verschiedene a a v-Kapsidgene umfasst.Anschließend wird diese Plasmidbibliothek zusammen mit einem adenoviralen Hilfsplasmid in 293T-Zellen transfiziert, um eine chimäre Virusbibliothek herzustellen, die anschließend an Zielzellen oder in Tieren selektiert werden kann. Die Ergebnisse zeigen das erfolgreiche molekulare Engineering und die Evolution neuartiger synthetischer AAV-Vektoren, die auf einer verbesserten oder spezifischeren Reporter-Genexpression in Kulturzellen oder erwachsenen Mäusen basieren. Der Hau

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Generierung von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken und anschließende Validierung durch Barcoding von Kandidaten mit neuartigen Eigenschaften für die Erstellung von AAVs der nächsten Generation.

Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.

Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) wird häufig für die klinische und präklinische Genverabreichung eingesetzt. Eine unterschätzte Anwendung für rAAVs ist die robuste Transduktion von kultivierten Zellen, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Für Forscher, die neu in der rAAV sind, stellen wir ein Protokoll für das Klonen von Transgenkassetten, die Produktion von Rohvektoren und die Transduktion von Zellkulturen zur Verfügung.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10bis 12 Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.

Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Die genaue Quantifizierung von Vektorgenomkopien des Adeno-assoziierten Virus (AAV) ist von entscheidender Bedeutung, aber ein standardisiertes Protokoll muss noch etabliert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine validierte Methode zur Aufbereitung gereinigter AAV-Proben und zur Durchführung einer digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd_PCR), um den viralen Genomtiter zuverlässig zu quantifizieren.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Herstellung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten extrazellulären Vesikelbiomimetika für die Gentherapie einzuführen. Das Nanovesikel ist mit MSC-abgeleiteten Lipid-Doppelschichten eingeschlossen und kapselt rekombinante AAVs, die das relevante Gen im Lumen tragen. Dieses Nanovesikel bietet einen verbesserten Vektor für die Genlieferung in vivo .

Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Lernen Sie die DNA-Familie-Shuffling-Methode zur Entwicklung synthetischer AAV-Vektoren für die Gentherapie. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung hochdiverser Kapsid-Bibliotheken mit über einer Million Varianten.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

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