Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine hochdiverse Bibliothek synthetischer adenoassoziiierter viraler Kapside zu erstellen, aus der Partikel mit einer gewünschten Eigenschaft ausgewählt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst die aav-Kapsidgene durch kontrollierte DNA-Einschneidung fragmentiert, kloniert und ausgewählt werden, um ihre anschließende Neuanordnung in chimären Sequenzen mittels zweier PCR-Reaktionen zu ermöglichen. Im zweiten Schritt wird das resultierende PCR-Produkt zurück in einen replikationsfähigen aav-Vektor kloniert, um eine Plasmidbibliothek zu erzeugen, die mindestens eine Million verschiedene aav-Kapsidgene umfasst.

Anschließend wird diese Plasmidbibliothek zusammen mit einem adenoviralen Helferplasmid in 293T-Zellen transfiziert, um eine chimäre Virusbibliothek herzustellen, die anschließend an Zielzellen oder in Tieren selektioniert werden kann. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche molekulare Konstruktion und Evolution neuartiger synthetischer AAV-Vektoren, die auf einer verbesserten oder spezifischeren Reporter-Genexpression in Kulturzellen oder erwachsenen Mäusen basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Peptid-Display liegt darin, dass das DNA-Family-Shuffling das Potenzial besitzt, mehrere Eigenschaften der AAV-Kapside gleichzeitig zu verändern und zu verbessern – von der Zellbindung und intrazellulären Transportwegen bis hin zur Entkapselung und Genexpression im Zellkern.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in den Bereichen Gentherapie und Virologie beantworten, beispielsweise wie man einen idealen Vektor für eine bestimmte therapeutische Anwendung erhält oder wie man die Domänen einer viralen Kapsidstruktur identifiziert, die für eine bestimmte Eigenschaft verantwortlich sind. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie zahlreicher menschlicher Erkrankungen, einschließlich Infektionen mit viralen Pathogenen, da unsere Methode die molekulare Evolution von A V-Vektoren ermöglicht, die gezielt und effizient virale Zielzellen infizieren, wie etwa T-Zellen bei HIV oder Hepatozyten bei Hepatitisviren. Obwohl diese Methode Einblicke in die A V-Biologie ermöglicht und zur Verbesserung von AV-Vektoren für die Gentherapie genutzt werden kann.

Sie kann leicht auch auf andere Genfamilien von grundlegender oder angewandter Relevanz angewendet werden, wie beispielsweise dosisencodefluoreszierende Gene, drei Reportergene, zelluläre Enzyme oder Proteine, die an der RNA-Interferenz beteiligt sind. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir versuchten, einen geeigneten Vektor zu finden, um Gewebestücke erwachsener Mäuse mit therapeutischen Genen zu transfizieren, und erkannten, dass alle natürlich vorkommenden AV-Serotypen Nachteile aufwiesen, wie eine hohe Prävalenz in der menschlichen Population und dementsprechend eine hohe Inzidenz bestehender Immunität oder eine schlechte Leistungsfähigkeit in vivo, trotz effizienter Transduktion in der Kultur. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die DNA-basierte Fragmentierung des AV-Caps-Gens und einige Schritte der Virusbibliotheksherstellung aufgrund ihres Erfahrungsbedarfs und der Notwendigkeit, kritische Phasen zu erkennen, schwer zu erlernen sind, um die routinemäßige Herstellung ausreichender Mengen der verschiedenen adenoassoziierten viralen Capsid-Gene zu erleichtern.

Für das DNA-Shuffling werden diese Gene zunächst in einen gemeinsamen Plasmid-Backbone subkloniert. Um dies zu erreichen, werden die gewünschten cap-Gene mittels PCR aus gängigen AAV-Plasmiden mit den Primern cap F und cap R amplifiziert. Anschließend werden die cap-Gene in ein Plasmid geklont, das spezifische Primer-Bindungsstellen sowie Restriktionsstellen enthält. In diesem Beispiel werden die cap-Gene in die PAC1- und SC1-Stellen geklont, die sowohl in den für die cap-Amplifikation verwendeten Primern als auch im Empfängerplasmid vorhanden sind, jedoch in den meisten AAVs fehlen. Nach Erstellung der Plasmidsätze, die die AAV-Kapsidgene codieren, beginnt das Verfahren zum cap-Shuffling mittels PCR, bei dem die gewählten cap-Gene mit den T3- und T7-Primern amplifiziert werden.

Richten Sie eine 50-Mikroliter-PCR-Reaktion ein, die 200 Nanogramm Kap-Plasmid, jeweils zwei Mikromolar Endkonzentration der Primer, 10 Mikroliter 5x High-Five-Puffer und ein Mikroliter High-Five-Polymerase enthält. Diese Reaktion liefert etwa drei Mikrogramm PCR-Produkt, was für bis zu sechs Shufflingsreaktionen ausreicht, abhängig von der Anzahl der Kap-Gene, die in die Bibliothek aufgenommen werden sollen. Beginnen Sie mit fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und führen Sie anschließend 40 Zyklen mit jeweils 15 Sekunden bei 94 Grad Celsius, 30 Sekunden bei 57 Grad Celsius und drei Minuten bei 68 Grad Celsius durch, gefolgt von einem abschließenden Schritt von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius.

Nach der Reinigung der PCR-Produkte wird ein gezielter DNA-Verdau verwendet, um Cap-Gen-Fragmente für die Neuanordnung in Kyra zu erzeugen. Einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens besteht darin, einen bestimmten nützlichen Bereich an verdauten DNA-Cap-Fragmenten für die Neuanordnung in Kyra zu erhalten. Zu diesem Zweck bereiten wir zunächst PLE-Mengen an gereinigten Cap-Genen vor und führen anschließend mehrere parallele Reaktionen unter variierenden Bedingungen durch. Um den Verdau einheitlich vorzubereiten, mischen Sie die verschiedenen Cap-PCR-Produkte zu einer Gesamtmenge von vier Mikrogramm in 54 Mikroliter Wasser und geben Sie anschließend sechs Mikroliter DS-Reaktionspuffer und 0,5 Mikroliter DNase I vorsichtig in die Reaktion. Vortexen Sie das Gefäß dreimal kurz und stellen Sie es unverzüglich auf einen 25 °C warmen Heizblock.

Inkubieren Sie diese erste Reaktion eine Minute lang. Bereiten Sie anschließend eine zweite Verdauungsreaktion vor und inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius für eine Minute und 15 Sekunden. Richten Sie auf diese Weise mehrere parallele Reaktionen mit Inkubationszeiten zwischen einer und zwei Minuten ein, wobei die Inkubationszeit in Schritten von 15 Sekunden variiert wird.

Stoppen Sie jede Reaktion durch Zugabe von sechs Mikrolitern 25 Millimolar EDTA. Vortexen Sie das Gefäß kurz und inkubieren Sie es 10 Minuten bei 75 Grad Celsius. Die mehrfachen parallelen Reaktionen führen zu fünf Kap-Proben, die mit DNA digeriert wurden, eine für unterschiedliche Inkubationszeiten; reinigen Sie die Kap-Fragmente an einem standardmäßigen 1 % AROS-Gel.

Im Idealfall sollte eine Bande zwischen 100 und 500 Basenpaaren sichtbar sein, wie in diesem Beispiel mit Inkubationszeiten von einer Minute, 45 Sekunden oder zwei Minuten zu Beginn gezeigt. Bei der DNA-Family-Shuffling werden die Kap-Fragmente zunächst über eine PCR, bei der sie sich aufgrund teilweiser Homologien selbst anspringen, zu vollständigen Sequenzen reassembliert. Richten Sie eine 50-Mikroliter-Reaktion mit 500 Nanogramm gereinigten Fragmenten, 10 Mikrolitern 10x Fusion-Puffer, einem Mikroliter 10-Millimolar-dNTPs, 1,5 Mikrolitern DMSO und 0,5 Mikrolitern Fusion ein.

Zwei Polymerasen inkubieren 30 Sekunden bei 98 Grad Celsius und führen anschließend 40 Zyklen mit jeweils 10 Sekunden bei 98 Grad Celsius, 30 Sekunden bei 42 Grad Celsius und 45 Sekunden bei 72 Grad Celsius durch, gefolgt von einem abschließenden Schritt von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius. Amplifizieren Sie als Nächstes die reassemblierten cap-Gene für die nachfolgende Klonierung mittels einer zweiten PCR unter Verwendung von Primern, die an die konservierten flankierenden Sequenzen binden. Zum Beispiel richten SAF und SAR oder CUF und CUR eine 50-Mikroliter-Reaktion ein, die zwei Mikroliter der ersten PCR, jeweils einen Primer in einer Endkonzentration von zwei Mikromolar, 0,5 Mikroliter Magnesiumchlorid, 10 Mikroliter 5x High-FI-Puffer und ein Mikroliter High-FI-Polymerase enthält.

Es werden 16 bis 24 PCR-Reaktionen empfohlen, um ausreichend hohe Ausbeuten für die nachfolgende Klonierung sicherzustellen. Nach dem Zusammenführen der PCR-Produkte und der Reinigung des vollständigen Cap-Bandes folgt als nächster Schritt die Verdauung des gereinigten Cap-Gen-Pools mit PacI und AscI zur Klonierung in ein replikationskompetentes AAV-Plasmid. Das Empfängerplasmid enthält AAV-invertierte terminale Wiederholungssequenzen, die das AAV2-rep-Gen flankieren, das unter Kontrolle des AAV-P5-Promotors steht, sowie PacI- und AscI-Schnittstellen.

Restriktionsstellen stromabwärts von rep ermöglichen das klonen des umgeschüttelten cap-Genpools im richtigen Leseraster. Die durch Pfeile angezeigten LSE-Primer-Bindungsstellen sind nützlich für die Sequenzierung des cap-Gens, vermischt die cap-Fragmente und den entsprechend geschnittenen Empfänger-Plasmid-Rückgrat im molaren Verhältnis drei zu eins. Bereiten Sie eine 40 Mikroliter Gesamtvolumen umfassende Master-Mix-Lösung vor, die für 20 Transformationen ausreicht und eine endgültige DNA-Konzentration von 15 Nanogramm pro Mikroliter aufweist.

Inkubieren Sie über Nacht bei 16 Grad Celsius am folgenden Tag und transformieren Sie die Ligationsreaktion in e coli. Mischen Sie zwei Mikroliter Ligationsreaktion mit 30 Mikrolitern elektrokompotenten e coli und überführen Sie die Mischung in vorab gekühlte Elektroporationsküvetten auf Eis. Führen Sie die Elektroporation bei 1,8 Kilovolt, 200 Ohm und 25 Mikrofarad durch. Die Zeitkonstante sollte nahe bei fünf Millisekunden liegen. Geben Sie danach sofort ein Milliliter vorgewärmtes SOC-Medium hinzu und überführen Sie die Probe in einen 250-Milliliter-Kolben.

20 solche Elektroporationen liefern eine Bibliothek mit einer Diversität von etwa 1 × 10⁶ verschiedenen Klonen. Ein Volumen vorgewärmtes SOC-Medium zur gepoolten Transformation hinzufügen und 1 Stunde bei 37 °C und 180 rpm schütteln. Anschließend 40 Milliliter der gepoolten Transformationen zu 800 Milliliter LB-Medium mit Ampicillin geben und weitere 16 Stunden unter denselben Bedingungen inkubieren. Die Plasmid-DNA der Bibliothek wird anschließend mit einem kommerziell erhältlichen Kit gereinigt.

Die Herstellung der viralen Bibliothek beginnt mit der Transfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen mit der a a v-Bibliothek. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie 10 bis 15 quadratische 10-Zentimeter-Schalen mit HEC 2 9 3 T-Zellen besiedeln und diese 48 Stunden bei 37 Grad Celsius kultivieren. Bereiten Sie für jede Transfektion die folgenden beiden Reagenzgemische in zwei separaten Reagenzgläsern vor. Die folgenden Mengenangaben beziehen sich auf je 10 Platten im ersten Reagenzglas.

Mischen Sie 7,9 Milliliter Natriumchlorid und DNA und geben Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15,8 Milliliter zu erreichen. In das zweite Reagenzglas geben Sie 3,52 Milliliter Polyethylenamin, 7,9 Milliliter Natriumchlorid und 4,38 Milliliter Wasser. Vereinigen Sie die Mischungen, wirbeln Sie sie kurz im Vortex und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Verteilen Sie die Lösung gleichmäßig auf jede Petrischale mit den 293T-Zellen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.

Nach 48 Stunden kann die virale Bibliothek gewonnen werden. Die Zellen in das Medium abkratzen, die Zellen aus allen Schalen in einem einzigen Gefäß sammeln und 15 Minuten bei 1200 U/min zentrifugieren. Den Zellpellet in sechs Millilitern Lysepuffer resuspendieren und anschließend fünf Freeze-Thaw-Zyklen unterziehen; nach den fünf Freeze-Thaw-Zyklen eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit Benase inkubieren.

Als Nächstes pelletieren Sie die Zelltrümmer bei 3.750 U/min für 20 Minuten. Bereiten Sie ein Dichtegradient für eine Virusreinigung vor, indem Sie mit einer Pasteurpipette fünf Milliliter Virus-Suspension in ein Beckman-Quick-Seal-Zentrifugenröhrchen geben, gefolgt von jeweils 1,5 Milliliter 15 %, 25 % und 40 %iger Saccharoselösung. Füllen Sie den Gradienten mit Lysepuffer auf und zentrifugieren Sie ihn zwei Stunden bei 50.000 × g und vier Grad Celsius.

Nach Abschluss der Ultrazentrifugation nehmen Sie die Röhre aus dem Rotor und reinigen Sie die Außenseite der Röhre mit 70 % Ethanol. Stechen Sie eine Nadel in die Oberseite der Röhre, um eine Belüftung zu ermöglichen, und verwenden Sie eine weitere Nadel, um 1,2 Milliliter der 40 % IOL-Fraktion abzuziehen. Achten Sie darauf, die 25 % Fraktion nicht anzusaugen, da diese leer ist.

A a v-Kapside. Einzelne Klone aus der ursprünglichen Plasmidbibliothek werden hinsichtlich ihrer Funktionalität und Vielfalt analysiert, indem sie zur Herstellung rekombinanter A a v-Vektoren verwendet werden, die ein Reportergen exprimieren. Kultivierte Zellen oder Tiere werden anschließend mit verschiedenen Mengen des gereinigten Virus infiziert, und die Transduktionseffizienz wird bestimmt.

Hier gezeigte Fluoreszenzmikroskopieergebnisse von drei menschlichen Zelllinien, die mit fünf verschiedenen rekombinanten YFP-exprimierenden aav-Vektoren infiziert wurden, die mit permutierten cap-Genen hergestellt wurden. Eine alternative Methode zur Analyse der Transduktionseffizienz ist die faktorbasierte Messung der Expression des fluoreszierenden Reportergens. Diese Abbildung zeigt ein typisches Ergebnis für vier Zelltypen, menschliche Niere, menschliche Zervix, murine Fibroblasten und menschliche T-Zellen, die mit 18 verschiedenen rekombinanten, YFP-exprimierenden aav-Vektoren infiziert wurden, die zufällig aus einer ursprünglichen Bibliothek ausgewählt wurden und permutierte cap-Gene enthalten.

Die YFP-Expression wurde zur einfacheren Visualisierung farbkodiert. Dargestellt sind die Prozentsätze transduzierter Zellen, wobei Schwarz 0 % und Weiß die höchste in jedem Zelltyp gemessene Zahl angibt. Rot beispielhaft für Klon B zeigt einen Klon mit geringer Gesamtwirksamkeit, wie sie bei nicht ausgewählten Kapsiden erwartet werden kann. Die virale Bibliothek kann anschließend auf einzelne Partikel hin untersucht werden, die die meisten oder alle gewünschten Eigenschaften in einer bestimmten Zelllinie oder in Tieren aufweisen, für die Selektion.

In kultivierten Zellen werden die Zellen zunächst mit verschiedenen Aliquots der Bibliothek und ENO-Virus fünf infiziert, um ein a a v-Wachstum zu unterstützen; danach werden die Zellen geerntet, das amplifizierte a a v isoliert und zur Reinfektion neuer Zellen verwendet. Die Bestimmung optimaler a a v-Adenovirus-Verhältnisse für die Ko-Infektion von Zellen ist wichtig, und ein guter Indikator für eine wirksame Arius-Infektion ist das Auftreten zytopathischer Effekte drei Tage nach Virusinokulation, erkennbar an Zellrundung und -ablösung. In dieser Abbildung zeigt das Feld oben links nicht infizierte Zellen, während die anderen Felder Zellen zeigen, die mit den angegebenen Mengen an Adenoviruspartikeln pro Zelle infiziert wurden. Eine weitere nützliche Nachweismethode für die a a v-Infektion und -Amplifikation ist der Nachweis von Kapsidproteinen mittels Western Blot unter Verwendung des B-eins-Antikörpers, der ein hochkonserviertes a a v-Kapsid-Epitop erkennt.

Die linke Blot-Aufnahme zeigt Zellen, die mit verschiedenen Volumina in Mikrolitern einer a a V-Bibliothek und Hilfs-ENO-Viren koinfiziert wurden. Die ersten beiden Gelen sind gute Beispiele für Bedingungen, die eine kaum nachweisbare Expression des a a v-Proteins ergeben, was auf eine ausreichende, aber nicht übermäßige a a v-Infektion und -Amplifikation sowie somit auf eine gewünschte enge Kopplung von Genotyp und Phänotyp hinweist. Daher wurden 0,11 bzw. 10 Mikroliter dieser Überstände zur Reinfektion frischer Zellen verwendet.

Die Ergebnisse des Western Blots sind in den rechten Zellen dargestellt. In LA c wurden mit einem a v allein als negativer Kontrolle infiziert. Es ist außerdem entscheidend, die Bibliotheksvielfalt während wiederholter Infektionsrunden durch DNA-Sequenzierung zu überwachen.

Dieses Diagramm zeigt den Vergleich der Proteinsequenzen von AAV-Klonen aus einer Bibliothek basierend auf AAV zwei, acht und neun vor und nach der Selektion. Die Sequenzen oberhalb der roten Linie zeigen die elterlichen AAVs. Violette Pfeile weisen auf homologe Rekombinationsereignisse hin. Der rote Pfeil markiert einen Crossover zwischen AAV zwei und AAV neun, der in allen selektierten Klonen beobachtet wurde. Für die Selektion in Lebewesen wird die a a V-Bibliothek in die Tiere infundiert, aus den Zielzellen oder dem Gewebe mittels PCR zurückgewonnen, anschließend erneut geklont und verpackt, um eine neue Infektionsrunde durchzuführen.

Hier ist ein Beispiel für eine Rettung erfolgreich infizierter a a v-Klone aus Mauslebern eine Woche nach peripherer Bibliotheksinjektion dargestellt. In Lane eins ist das erwartete 2,2 Kilobasen große Band zu sehen, während Lane zwei eine nichtvorlagekontrollierte Probe zeigt. Die Größen der DNA-Markerbänder in Lane M sind in Kilobasen angegeben. Unabhängig vom Selektionsverfahren müssen die angereicherten Kapsidvarianten letztendlich in geeigneten Systemen validiert werden.

Ein Beispiel für die überlegene Leistung eines angereicherten a a V-Kymeras in kultivierten Zellen wird hier gezeigt. Dunklere Farben deuten auf eine höhere Infektiosität pro Partikelanzahl und somit pro Klon hin. A-A-V-D-J übertrifft eine Sammlung von acht natürlichen a a v-Wildtypen in einer breiten Palette von Zelllinien.

Schließlich wird eine Analyse eines ausgewählten a a V KYMERA in der Mausleber gezeigt, Klon. Ein A A V DN wurde aufgrund seiner Spiegelung in Hepatomzellen ausgewählt und anschließend zur Herstellung lichtemittierender, rekombinanter Vektoren verwendet, die in unseren repräsentativen Mäusen – drei pro Gruppe – eine Woche nach peripherer Infusion gleicher Dosen dieses Vektors oder eines Kontrollvektors auf Basis des Wildtyp-AAV8, einem der potentesten bekannten natürlichen Isolate in der Mausleber, zum Einsatz kamen. Beachten Sie, dass der A VDN-Klon zwar eine leicht geringere Gesamtexpression in der Leber bewirkt, dafür aber spezifischer für dieses Organ ist, da er deutlich weniger Off-Target-Effekte in nicht-hepatischen Geweben zeigt, sobald die Leberexpression über die Bildgebungssoftware angepasst wurde.

Diese Technik kann innerhalb einer Woche durchgeführt werden, beginnend mit der Amplifikation der a a V-Kapsidgene und endend mit der viralen Bibliothek, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass der hier beschriebene Protokollablauf aus unseren Erfahrungen bei der Selektion natürlicher AV-Serotypen hervorgegangen ist und es gut möglich ist, dass einige Bedingungen angepasst und feinabgestimmt werden müssen, wenn andere Anwender ihre eigenen maßgeschneiderten Bibliotheken erstellen. Neben diesem Verfahren können auch andere Methoden wie die gezielte Peptiddarstellung mittels AGENESIS oder die PCR-basierte Zufallsveränderung durchgeführt werden, um ebenfalls hochdiverse Bibliotheken zu erzeugen oder um die Eigenschaften von Kapsiden, die nach der Entwicklung mittels DNA-Family-Shuffling erzeugt und angereichert wurden, weiter zu verbessern.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der viralen Gentransferstrategien, therapeutische Ansätze für Krankheiten und zugehörige Zielzellen zu erforschen, bei denen konventionelle A VC-Typen unbefriedigende Ergebnisse zeigten, wie beispielsweise bei HIV-Infektionen und T-Zellen, sowie den vektorbasierten Gentransfer in humane Stammzellen und andere Herzzellen zur Infektion von Zellen in Kultur. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochdiverse Bibliotheken synthetischer adenoassoziiierter viraler Vektoren durch eine Kombination aus Genfragmentierung und Reassemblierung konstruiert und weiterentwickelt, sowie wie man diese Bibliotheken grundsätzlich in kultivierten Zellen oder in Tieren selektiert, um einzelne Kapside mit gewünschten spezifischen Eigenschaften für den Einsatz als Gentransfervektoren anzureichern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Adenoviren gefährlich sein kann und viele Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.