Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, zu demonstrieren, wie ein primäres neuronales Zellkultursystem zur Untersuchung der Latenz und Reaktivierung des Herpes-simplex-Virus verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst Neuronen aus den oberen Halsganglien von RA-Embryonen isoliert und anschließend die aus dissoziierten Ganglien gewonnenen Neuronen kultiviert werden, nachdem nicht-neuronale Zellen entfernt wurden. Eine latente HSV-Infektion wird unter Verwendung eines EGFP-Virus etabliert, um die Neuronen in Gegenwart eines Inhibitors der lytischen Replikation zu infizieren.

Der nächste Schritt besteht darin, die Reaktivierung der latent infizierten Kulturen auszulösen. Schließlich wird die Effizienz der Reaktivierung durch die Überwachung der EGFP-Expression über die Zeit bewertet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie unterschiedliche neuronale Signalwege die Latenz und Reaktivierung des Herpes-simplex-Virus durch den Einsatz chemischer Inhibitoren, der RNA-Interferenz und der Genübertragung regulieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie detaillierte Untersuchungen der Wechselwirkungen ermöglicht, die die Latenz von Herpes simplex forest im Wirtneuron auf molekularer Ebene regulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herpes-simplex-forest-Latenz zu beantworten, beispielsweise welche Signale die latente Genome stilllegen und wie die Reaktivierung auf molekularer Ebene ausgelöst wird. In Neuronen kann diese Methode Einblicke in die Latenz von HSV-1 liefern.

Es kann auch auf andere neurotrope Alpha-Herpesviren angewendet werden. Den Ablauf werden Marigo, Kochi und Julian Kim demonstrieren, beide Doktoranden in unseren Laboren. Für dieses Protokoll werden die oberen zervikalen Ganglien oder SCG-Neuronen aus Rattenwelpen im Stadium E 21 isoliert, die aus dem Uterus einer trächtigen weiblichen Ratte entnommen wurden. Arbeitet man in einer Abzugshaube, tötet man jedes Tierchen, indem man die Schere an der Halsbasis direkt oberhalb der Schultern ansetzt und den Kopf vom Rumpf abtrennt. Um die Ganglien freizulegen, verwendet man 23-Gauge-Nadeln, um den Kopf mit der Halsseite nach oben an drei Stellen festzustecken.

Befestigen Sie zuerst das Rückenmark. Ziehen Sie danach die vordere Haut über die Nase und fixieren Sie sie mit einer Nadel, und befestigen Sie drittens die Speiseröhre und Luftröhre, indem Sie sie von der Halsrückseite wegzurren. Suchen Sie das SCG, indem Sie die Bifurkation der Arteria carotis lokalisieren.

Die Arteria carotis ist eine paarige Struktur. Es gibt zwei Bifurkationen auf jeder Seite des Halses und somit zwei s CGS pro Pop. Das SCG befindet sich direkt unterhalb des Abzweigs.

Trennen Sie das SCG von den Arterien, indem Sie die Bifurkation an den beiden Enden auseinanderziehen. Das SCG ist durchscheinend und farblos im Vergleich zu dem opaken, gelblichen Fettgewebe, das die Bifurkation umgibt. Geben Sie die Ganglien in 12 Milliliter L 15.

Medium, das mit Glukose ergänzt wurde, in einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen auf Eis. Nachdem alle sSCGs aus den Embryonen gewonnen und vorsichtig abzentrifugiert wurden, zentrifugieren Sie die Ganglien eine Minute lang. Bei 600 U/min entfernen Sie das überschüssige Medium Reese.

Suspendieren Sie die Ganglien in einem Milliliter L-15-Medium, das Trypsin und Kollagenase enthält. Inkubieren Sie 24 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Rühren Sie alle acht Minuten um. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Seemedium zu, um die Trypsin-Zentrifugation für eine Minute zu inaktivieren. Entfernen Sie bei 600 U/min so viel wie möglich vom Trypsin-Kollagenase-Medium und waschen Sie die Ganglien mit 10 Milliliter C-Medium, zentrifugieren Sie dafür eine Minute bei 600 U/min.

Wiederholen Sie diese Waschung einmal. Entfernen Sie das Waschmedium und resuspendieren Sie die Ganglien in einem Milliliter C-Medium, um sie durch Pipettieren mit einer 21-Gauge-Nadel, die an eine Fünf-Milliliter-Spritze angebracht ist, maximal 15 Mal auf und ab zu dissoziieren. Schließen Sie die Dissoziation mit einer 23-Gauge-Nadel ab, bis der Großteil der Zellklumpen dissoziiert ist.

Entfernen Sie verbliebene Zellklumpen, indem Sie die dissoziierten Neuronen durch einen 70-Mikron-Nylonfilter in ein 50-Milliliter-Konischglas filtrieren. Entnehmen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot der filtrierten Zellsuspension und mischen Sie Tripanblau, um die Anzahl der lebenden Zellen zu bestimmen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Farbstoff aktiv ausschließen, mithilfe eines Hämozytometers.

Als Nächstes pipettieren Sie 5.000 bis 6.000 lebende Zellen in 100 Mikroliter C-Medium in jede Vertiefung einer 96-Loch-Gewebekulturplatte, die zuvor mit Kollagen und Laminin beschichtet wurde; geben Sie außerdem 50 Nanogramm pro Milliliter Nervenwachstumsfaktor zum C-Medium hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag, Tag eins in vitro oder DIV eins, überprüfen Sie die ordnungsgemäße Anheftung der Neuronen und das Wachstum einiger axonaler Fortsätze.

Ersetzen Sie das C-Medium in den Vertiefungen durch 50 Mikroliter Neurobasal-Medium oder NBM, das NGF Acho und fünf Fluoro-2-Doxy-Uridin enthält. Ersetzen Sie das Medium eine Reihe nach der anderen, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius für fünf Tage.

Überwachen Sie die Kultur täglich, um den Tod der nicht-neuronalen Zellen und das Wachstum der Neuronen zu bestätigen. Um diesen Teil des Verfahrens am sechsten Tag in vitro zu beginnen, überprüfen Sie, ob der Großteil der nicht-neuronalen Stützzellen eliminiert wurde. Es ist äußerst wichtig, physische Manipulationen der Neuronen jederzeit auf ein Minimum zu beschränken.

Das Entfernen und Ersetzen des Mediums muss sehr schonend und langsam erfolgen, da mechanische Belastungen andernfalls die Lebensfähigkeit der Neuronen beeinträchtigen können. Fügen Sie Aciclovir oder einen CV dem vorhandenen Medium in jedem Well in einer Endkonzentration von 100 Mikromolar hinzu. Geben Sie einen CV langsam und vorsichtig hinzu, um sicherzustellen, dass mechanische Kräfte die Zellen am folgenden Tag nicht negativ beeinflussen.

Zum DIV sieben infizieren Sie die SCG-Kulturen mit einem rekombinanten HSV Typ eins, der einen EGF-Reporter exprimiert, der an das virale lytische Protein US 11 fusioniert ist, bei einer Multiplizität der Infektion zwischen eins und zwei. Geben Sie das verdünnte Virus direkt in das vorhandene Medium im Wells hinzu. Führen Sie eine mock-infizierte Kontrolle sowie eine lytische Infektion durch.

Positivkontrolle in Medium ohne CV. Die Infektion zwei bis drei Stunden bei 37 Grad Celsius fortschreiten lassen. Danach das Infektionsmedium durch frisches NBM mit NGF und einem CV ersetzen. Beim Wechseln des Infektionsmediums ist äußerste Vorsicht geboten. Die Platte zu sich neigen und das Medium langsam vom Boden der Vertiefung abpipettieren.

Richten Sie die Pipettenspitze dann an die Wand des Wells statt auf den Boden des Wells und lassen Sie das Medium sanft auf die Zellen gleiten. Ersetzen Sie jeweils eine Reihe des Mediums, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen. Stellen Sie die Kulturen zurück in den Inkubator und behandeln Sie sie dabei so schonend wie möglich, um ihre Fähigkeit, die Latenz von HSV-1 zu unterstützen, nicht zu beeinträchtigen.

Züchten Sie die Kulturen sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius, wobei das Virus in dieser Zeit eine Latenzphase etabliert. Überwachen Sie während dieses Zeitraums die Expression von us11-EGFP mittels Fluoreszenzmikroskopie als Indikator für die lytische Replikation.

Wie erwartet sollte im mock-infizierten Kontrollansatz keine GFP-Expression nachweisbar sein. S 11 EGFP sollte nur bei der Infektion detektiert werden. Positive Kontrollgefäße ohne CV-Behandlung zeigen eine erfolgreiche Primärinfektion und produktive lytische Replikation an.

Um die Reaktivierung am 14. Tag im Kulturmedium (DIV) zu beurteilen, ersetzen Sie das enthaltene Kulturmedium vorsichtig durch frisches Medium ohne Kulturvirus (CV) wie zuvor beschrieben. Richten Sie die Pipettenspitze an die Wand der Vertiefung statt auf den Boden und lassen Sie das Medium gegebenenfalls sanft an der Wand herunterlaufen, um die Zellen nicht zu beschädigen. Fügen Sie pharmakologische oder biologische Variablen wie LY 2 9 0 0 4 in einer Konzentration von 20 Mikromolar hinzu.

Es sollte keine GFP-Expression in den mit A-CV behandelten latent infizierten Kulturen nachgewiesen werden. Die Zellen für einen Zeitraum von fünf bis sechs Tagen auf 37 Grad Celsius zurückbringen. Die lebenden Kulturen mittels eines Fluoreszenzmikroskops überwachen, um Neuronen zu detektieren, die eine Reaktivierung durchlaufen.

Die Reaktivierungshäufigkeit wird berechnet, indem die Anzahl der Wells mit EGFP-positiven Neuronen gezählt und als Anteil der Gesamtanzahl der Proben-Wells ausgedrückt wird. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel, bei dem Triggerstatin, ein bekannter Induktor der Reaktivierung, auf spät infizierte SCG-Kulturen angewendet wird. Die Reaktivierung wurde täglich nach der Behandlung mit dem Wirkstoff über einen Zeitraum von fünf Tagen mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht und bewertet.

Bei Verwendung von TSA erreicht die Reaktivierung innerhalb von zwei Tagen 50 % des Maximums; innerhalb von fünf Tagen erreicht die Reaktivierung 60 % der Ausgangswerte oder der spontanen Reaktivierung, dargestellt durch DMSO. Die behandelten Kontrollkulturen liegen in diesem Experiment bei etwa 10 % und bewegen sich typischerweise in einem Bereich von fünf bis 20 % bei Verwendung dieses In-vitro-Systems. Spät infizierte SCG-Kulturen wurden außerdem mit LY 2 9 0 0 4 behandelt.

Eine bekannte Induktion von Reaktivierungskulturen mit durch LY induzierter Reaktivierung wurde mit solchen verglichen, die mit dem viralen DNA-Syntheseinhibitor Phosphonoessigsäure und den beiden Verbindungen zusammen behandelt wurden, wie hier veranschaulicht. Die Expression von US11-EGFP wird durch PAA in Kulturen, bei denen mit LY294002 die Reaktivierung induziert wurde, beeinträchtigt, was darauf hinweist, dass die Expression von US11-EGFP von der viralen DNA-Replikation abhängt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig auf sterile Technik zu achten und die CG-Kultur so schonend wie möglich zu behandeln, um eine erhöhte spontane Reaktivierung durch Stress oder mechanische Bewegungen zu vermeiden. Nach Durchführung dieses Verfahrens zur Herstellung latenter HSV-1-Infektionen in kultivierten Neuronen können weitere Methoden wie shRNA-Knockdown und die ektopische Expression von Wildtyp- und Mutantengenen durchgeführt werden, um neuronale Funktionen zu charakterisieren, die die Latenz und Reaktivierung von HSV-1 regulieren.

Vergessen Sie nicht, dass HSV Typ 1 ein humanes Pathogen ist, das Sicherheitsvorkehrungen der Schutzstufe 2 erfordert. Sie sollten mit der Arbeit unter Schutzstufe-2-Bedingungen vertraut sein, bevor Sie dieses Verfahren durchführen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man SCG-Kulturen etabliert, um latente HSV-1-Infektionen anzulegen und eine effektive Reaktivierung in den Neuronen auszulösen.