Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Analyse der neuronalen Differenzierung von menschlichen neuralen Vorläuferzellen, die in einer dreidimensionalen Umgebung kultiviert wurden, zu beschleunigen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst in der selbstorganisierenden peptidbasierten Hydrogel-Reinmatrix kultiviert werden. Als nächstes werden die Zellen aus den dreidimensionalen Gerüsten befreit.

Im dritten Schritt erfolgt die immunphytochemische Färbung der Zellen. Die Zellen werden durch durchflusszytometrische Analyse gezählt. Letztendlich kann die Rate der neuronalen Differenzierung bzw. die Rate der Apoptose durch die durchflusszytometrische Analyse auf neuronale bzw. apoptotische Marker bestimmt werden.

Mit dieser Technik ist die Quantifizierung der neuronalen Differenzierung viel schneller und die Optane-Daten werden in einer breiteren Basis und Mikrofotografietechniken nach oben gebracht. Für die Einbettung von Zellen in die reine Matrix wird zunächst eine sterilisierte Glasabdeckung mit einem Durchmesser von 13 Millimetern in jede der beiden Vertiefungen einer Zellkulturplatte mit vier Vertiefungen geschoben. Bewahren Sie die Platte dann für den späteren Gebrauch auf einer sauberen Bank auf. Als nächstes lösen Sie die menschlichen neuralen Vorläuferzellen oder H-NPCs ab, indem Sie 2,5 Milliliter frisch zubereitetes Trypsin hinzufügen.

Benzon, eine Lösung, in die Kulturschale geben und die Zellsuspension bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Stoppen Sie nach fünf Minuten die Reaktion mit dem Trypsin-Inhibitor Benzon a Lösung. Nachdem die abgelösten Zellen fünf Minuten lang bei 3000 mal G bei Raumtemperatur heruntergeschleudert wurden, wird das resultierende Pellet mit fünf Millilitern einer 10%igen Saccharoselösung erneut suspendiert und dann die Zellsuspension unter denselben Zentrifugenbedingungen gewaschen.

Nach dem Verwerfen des Snat-Resus wird das Pellet in der Saccharoselösung auf eine endgültige Zellkonzentration von eins mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter suspendiert. Mischen Sie nun so schnell wie möglich 60 Mikroliter Zellsuspension mit Lösung eins, übertragen Sie 120 Mikroliter dieser Suspension in das konische Röhrchen mit Lösung zwei und mischen Sie vorsichtig und schichten Sie dann sofort 100 Mikroliter der Mischung auf jedes der Deckgläser in der Vier-Well-Platte. Zum Schluss geben Sie langsam 200 Mikroliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung

Geben Sie nach zwei bis drei Minuten weitere 200 Mikroliter Zellkulturmedium in die Vertiefungen, um die Selbstorganisation der Matrix einzuleiten. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf dem beheizten Bereich Ihrer Reinbank. Um die Zellkulturplatte nach dem Zusammenbau der Matrizen nicht so weit wie möglich zu bewegen, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die meisten, aber nicht alle Medien zu entfernen, um ein Austrocknen der Matrizen zu vermeiden.

Waschen Sie dann die Matrizen mit 500 Mikrolitern frischem Medium für 10 Minuten. Entfernen Sie abschließend das Waschmedium. Fügen Sie weitere 500 Mikroliter Medium hinzu und stellen Sie die Kulturplatte in einen Inkubator.

tunlichst. Lagern Sie die Matrizen in einem eigenen Inkubator, um ein versehentliches Schütteln der Strukturen am ersten Tag des Färbeexperiments zu vermeiden. Entfernen Sie das Medium mit einer 1000-Mikroliter-Pipette aus den Matrizen und waschen Sie die Gerüste dann einmal fünf Minuten lang mit PBS.

Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie 400 Mikroliter Paraldehyd in jede Vertiefung, um die Matrizen zu fixieren und sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nachdem die Gerüste befestigt wurden, waschen Sie sie fünf Minuten lang mit 500 Mikrolitern PBS. Inkubieren Sie dann die Strukturen und den Blockierungspuffer für sechs bis neun Stunden, wechseln Sie den Puffer einmal alle zwei bis drei Stunden mit einer abschließenden Inkubation über Nacht in frischem Blockierungspuffer bei vier Grad Celsius am nächsten Tag, entfernen Sie den Blockierungspuffer.

Geben Sie die Antikörperlösung in die Vertiefungen und inkubieren Sie die Matrices erneut bei vier Grad Celsius über Nacht. Entfernen Sie nun die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Gerüste acht Stunden lang in 500 Mikrolitern PBS, wechseln Sie das PBS alle zwei Stunden und anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius mit frischem PBS. Entfernen Sie nach der Nachtwäsche das PBS und inkubieren Sie die Gerüste mit der Sekundärantikörperlösung vier Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Dann waschen Sie die Proben vier- bis sechsmal jeweils eine Stunde lang mit PBS und inkubieren Sie die Strukturen dann über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius mit frischem PBS. Geben Sie nun 50 Mikroliter MOE all dab co auf die Objektträger, um sie für die Montage der Matrizen vorzubereiten. Montieren Sie dann vorsichtig ein Deckglas auf jede Folie.

Verwenden Sie schließlich ein Fluoreszenzmikroskop, um einzelne mikroskopische Aufnahmen und Zacks zu erhalten, die den H-NPCs ähneln, die grün gefärbt sind, um die Expression des hier gezeigten neuronalen Markers Beta-3-Tubulin zu erhalten. Nachdem Sie die Gerüste eine Minute lang mit 500 Mikrolitern HBSS gewaschen haben, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Gerüste in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Als nächstes wird die Zelllösung mehrmals mit einer 1000-Mikroliter-Pipette resuspendiert, um die Matrices mechanisch aufzubrechen, und anschließend die Gerüstlösung bei 3000-fachem G bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert, den Überstand mit einer Pipette entfernt und dann das Pellet in 500 Mikrolitern Trypsinbenzinlösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert.

Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die Reaktion nach fünf Minuten mit einem Milliliter Trypsin-Hemmer. Benza-Nasenlösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren nach dem Schleudern der Zellsuspension unter denselben Zentrifugenbedingungen.

Entfernen Sie alle Matrixreste, indem Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern HBSS-Puffer waschen. Entfernen Sie schließlich die Aggregate, indem Sie die Zellsuspensionslösung unter den gleichen Bedingungen durch eine 70-Mikron-Zellsiebzentrifuge leiten und die Zellen in Zellkulturmedium sammeln. Beginnen Sie damit, die disaggregierten Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler in 1%-Paraform-Paraldehyd zu fixieren.

Nachdem Sie die Zellen reus heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet in Waschpuffer. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 350 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, suspendieren Sie das resultierende Pellet in 25 Mikrolitern der Antikörperlösung. Die Zellsuspension wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.

Geben Sie dann 300 Mikroliter Pon-Puffer direkt zu den Proben und waschen Sie die Zellsuspensionen zweimal unter denselben Zentrifugenbedingungen. Nach der zweiten Wäsche fügen Sie 25 Mikroliter des Sekundärantikörpers hinzu und inkubieren die Zellen dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem die Zellen zwei weitere Male mit Saponinpuffer gewaschen wurden, werden das Pellet und 500 Mikroliter Waschpuffer für die durchflusszytometrische Analyse mit einer Reanimationssuspension suspendiert.

In dieser Abbildung sind H-NPCs mit verkapselter und reiner Matrix dargestellt: Die Zellen wachsen in kugelförmigen, dicht gepackten Strukturen, bei denen der Durchmesser der Kugeln bis zu mehreren hundert Mikrometern zwischen den Kugeln betragen kann. Bündel von Prozessen, die von den Zellen aufgebaut werden, können beobachtet werden, wie die weißen Pfeile anzeigen. Obwohl einzelne Zellen kaum zu erkennen sind, wachsen Zellen, die in einer mit Laminin ergänzten reinen Matrix verkapselt sind, in weniger dichten Strukturen und sind homogener verteilt, wie in dieser Abbildung zu sehen ist, können einzelne Zellen sogar in weniger dichten Bereichen erkannt werden, wie durch die schwarzen Pfeile angedeutet wird. Hier differenzierten sich H-NPCs vier Tage lang in laminiertem, ergänztem pur Matrixx, das grün färbte, für die Expression des neuronalen Markers.

Es wird gezeigt, dass Beta-3-Tubulin den Prozentsatz positiver Zellen bewertet. Die Gesamtzellzahl kann bestimmt werden, indem die hier blau mit Dappy angefärbten Zellkerne aufgezählt werden. Diese Mikrofotografie stellt die Vollprojektion eines Z-Stapels von Bildern dar, die mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden.

Aus der Matrix gelöste Zellen können wieder platziert werden, z. B. auf Deckgläsern, wie in dieser Abbildung gezeigt, für weitere funktionelle Studien. Diese Mikrofotografie zeigt Zellen, die in 3D kultiviert wurden, nachdem sie dem bereits erwähnten Freisetzungsverfahren unterzogen und drei Tage lang kultiviert wurden. Die Färbung für Beta-3-Tubulin in Rot zeigt eine vergleichbare Morphologie wie die Zellen, die im 3D-Gerüst untergebracht sind, wobei ungefärbte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden.

Die GA, die hier als schwarzer Rahmen dargestellt ist, wurde für die anschließende Analyse von Beta-drei Tubulin-positiven Zellen in diesem Punktdiagramm gesetzt, positive Zellen erscheinen innerhalb des schwarzen Rahmens im rechten Teil der x-Achse und die Zwischenpopulation im gestrichelten Rahmen und höchstwahrscheinlich auch Zelltrümmer darstellend. Ein Vergleich der manuellen Zellzählung und der Zählung mittels Durchflusszytometrie ist in dieser letzten Abbildung dargestellt. Ein viel höherer Anteil positiver Zellen kann durch durchflusszytometrische Analyse nachgewiesen werden, wie durch die offenen schwarzen Quadrate angezeigt, und kann dann typischerweise durch manuelle Zählung aufgezählt werden, wie durch die durchgezogenen schwarzen Dreiecke angezeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man schlechte Metriken für die Kultivierung von Kanten-MPCs in einem 3D-Gerüst verwendet und wie man die Zellen aus dem Gerüst für Durchfluss-Zytometrik-Analysatoren freigibt.