Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Analyse der neuronalen Differenzierung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen, die in einer dreidimensionalen Umgebung kultiviert werden, zu beschleunigen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst in der reinen Matrix aus selbstassemblierendem Peptid-basiertem Hydrogel kultiviert werden. Anschließend werden die Zellen aus den dreidimensionalen Gerüsten freigesetzt.

Im dritten Schritt erfolgt die immunphytochemische Färbung der Zellen im letzten Schritt. Die Zellen werden mittels Durchflusszytometrie gezählt. Letztendlich kann die Rate der neuronalen Differenzierung oder die Rate der Apoptose durch die Durchflusszytometrie für neuronale bzw. apoptotische Marker bestimmt werden.

Mithilfe dieser Technik erfolgt die Quantifizierung der neuronalen Differenzierung deutlich schneller, und die Optane-Daten westen in einer breiteren Basis auf, sowie Mikrofotografietechniken für die Einbettung von Zellen in die reine Matrix. Platziere zunächst einen sterilisierten Glasdeckel mit 13 Millimeter Durchmesser in jeweils zwei Vertiefungen einer vierfachen Zellkulturplatte. Danach lagere die Platte auf einer sauberen Arbeitsfläche für die spätere Verwendung. Als Nächstes löse die humanen neuronalen Vorläuferzellen oder H NPCs durch Zugabe von 2,5 Millilitern frisch zubereitetem Trypsin ab.

Geben Sie Benzon einer Lösung in die Kulturschale und inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Stoppen Sie die Reaktion nach fünf Minuten mit Trypsin-Inhibitor Benzon einer Lösung. Zentrifugieren Sie die abgelösten Zellen anschließend bei Raumtemperatur mit 3000 ×g für fünf Minuten, resuspendieren Sie das resultierende Pellet mit fünf Millilitern einer 10 %igen Saccharoselösung und waschen Sie die Zellsuspension unter denselben Zentrifugierbedingungen.

Nachdem der Überstand Resus verworfen wurde, resuspendieren Sie das Pellet in der Saccharoselösung, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erreichen. Mischen Sie nun so schnell wie möglich 60 Mikroliter der Zellsuspension mit Lösung eins, überführen Sie 120 Mikroliter dieser Suspension in das kegelförmige Reaktionsgefäß mit Lösung zwei und mischen Sie vorsichtig. Anschließend schichten Sie unverzüglich jeweils 100 Mikroliter der Mischung auf jede der Deckgläser in der Viermuldenplatte. Abschließend geben Sie langsam 200 Mikroliter Zellkulturmedium in jede Mulde.

Nach zwei bis drei Minuten weitere 200 Mikroliter Zellkulturmedium in die Vertiefungen geben, um die Selbstassemblierung der Matrix einzuleiten. Die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf dem beheizten Bereich Ihrer sterilen Arbeitsbank inkubieren. Nach der Assemblierung der Matrizen die Zellkulturplatte so wenig wie möglich bewegen und mit einer 1000-Mikroliter-Pipette den größten Teil – aber nicht die gesamte Menge – des Mediums entfernen, um ein Austrocknen der Matrizen zu vermeiden.

Anschließend die Matrizen mit 500 µL frischem Medium 10 Minuten lang waschen. Abschließend das Waschmedium entfernen. Weitere 500 µL Medium hinzufügen und die Kulturplatte in einen Inkubator stellen.

Falls möglich, lagern Sie die Matrizen in einem separaten Inkubator, um versehentliches Schütteln der Strukturen am ersten Tag des Färbeexperiments zu vermeiden. Entfernen Sie das Medium aus den Matrizen mit einer 1000 µL-Pipette und waschen Sie die Gerüste anschließend einmal für fünf Minuten mit PBS.

Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie 400 Mikroliter Paraldehyd in jede Vertiefung, um die Matrizen zu fixieren, und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung der Gerüste waschen Sie diese mit 500 Mikrolitern PBS für fünf Minuten. Inkubieren Sie anschließend die Strukturen mit Blockierpuffer für sechs bis neun Stunden, wobei der Puffer alle zwei bis drei Stunden gewechselt wird, und führen Sie am nächsten Tag eine abschließende Übernachtsinkubation in frischem Blockierpuffer bei vier Grad Celsius durch, bevor Sie den Blockierpuffer entfernen.

Fügen Sie die Antikörperlösung zu den Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie die Matrizen erneut über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nun die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Gerüste in 500 Mikrolitern PBS für acht Stunden, wobei Sie den PBS alle zwei Stunden wechseln und anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius mit frischem PBS. Nach dem Über-Nacht-Waschschritt entfernen Sie den PBS und inkubieren die Gerüste vier Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit der sekundären Antikörperlösung.

Anschließend die Proben vier bis sechs Mal mit PBS waschen, jedes Mal eine Stunde lang, und die Strukturen anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln mit frischem PBS inkubieren. Nun 50 Mikroliter MOE all dab co auf die Objektträger geben, um sie für das Aufbringen der Matrizen vorzubereiten. Danach vorsichtig einen Deckglaser auf jeden Objektträger aufsetzen.

Verwenden Sie abschließend ein Fluoreszenzmikroskop, um einzelne Mikroaufnahmen und Zacks ähnlich der hier gezeigten grünen Färbung der H-NPCs für den neuronalen Marker Beta-Tubulin Typ III anzufertigen. Nach dem Waschen der Scaffolds mit 500 µL HBSS für eine Minute überführen Sie die Scaffolds mit einer 1000-µL-Pipette in ein 15-mL-Konischgefäß. Resuspendieren Sie anschließend die Zellsuspension mehrmals mit einer 1000-µL-Pipette, um die Matrizes mechanisch zu disruptieren, und zentrifugieren Sie die Scaffold-Suspension bei 3000 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 500 µL Trypsin-Benzin-Lösung.

Anschließend die Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Reaktion nach fünf Minuten mit einem Milliliter Trypsininhibitor stoppen. Benzase-Lösung mehrmals auf- und abpipettieren, nachdem die Zellsuspension unter denselben Zentrifugierbedingungen abzentrifugiert wurde.

Entfernen Sie Matrixrückstände, indem Sie die Zellen zwei Mal mit je zwei Milliliter HBSS-Puffer waschen. Entfernen Sie abschließend Aggregate, indem Sie die Zellsuspension unter denselben Bedingungen durch ein 70-Mikron-Zellsieb zentrifugieren und die Zellen in Zellkulturmedium sammeln. Beginnen Sie mit der Fixierung der disaggregierten Zellen in 1 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.

Danach, nachdem die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt wurden, das Pellet in Waschpuffer resuspendieren. Nun, nach einer Zentrifugation der Zellen für 10 Minuten bei 350 × g und 4 °C, das resultierende Pellet in 25 µL der Antikörperlösung resuspendieren. Die Zellsuspension zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren.

Anschließend 300 µL Pon-Puffer direkt zu den Proben hinzufügen und die Zellsuspensionen anschließend zweimal unter denselben Zentrifugierbedingungen waschen. Nach dem zweiten Waschschritt 25 µL der sekundären Antikörperlösung hinzufügen und die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei weiteren Waschschritten mit Saponin-Puffer das Pellet in 500 µL Waschpuffer resuspendieren und für die Durchflusszytometrie analysieren.

In dieser Abbildung sind H-NPCs in umhüllter reiner Matrix dargestellt, wobei die Zellen in sphärischen, dicht gepackten Strukturen wachsen, deren Durchmesser bis zu mehrere hundert Mikrometer betragen kann, zwischen den Sphären. Bündel von Fortsätzen, die von den Zellen gebildet werden, sind sichtbar, wie durch die weißen Pfeile angezeigt. Obwohl einzelne Zellen kaum erkennbar sind, wachsen in reiner Matrix ergänzt mit Laminin eingeschlossene Zellen in weniger dichten Strukturen und sind homogener verteilt, wie in dieser Abbildung zu sehen ist; einzelne Zellen können sogar in weniger dichten Bereichen erkannt werden, wie durch die schwarzen Pfeile angezeigt. Hier differenzierten H-NPCs vier Tage lang in lamininergänzter reiner Matrix, Färbung grün für die Expression des neuronalen Markers.

Es werden Beta-drei-Tubulin dargestellt, um den Prozentsatz positiver Zellen zu bewerten. Die Gesamtzahl der Zellen kann durch Zählen der hier blau angefärbten Zellkerne mit DAPI bestimmt werden. Diese Mikroaufnahme zeigt die Gesamtprojektion eines Z-Stapels von Bildern, die mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden.

Zellen, die aus der Matrix freigesetzt wurden, können beispielsweise erneut auf Deckgläsern angesiedelt werden, wie in dieser Abbildung für weitere funktionelle Untersuchungen gezeigt. Diese Mikroaufnahme zeigt Zellen, die nach dem zuvor genannten Freisetzungsverfahren in 3D kultiviert und anschließend drei Tage lang weitergezüchtet wurden. Die Färbung für Beta-Tubulin-3 in Rot zeigt eine vergleichbare Morphologie gegenüber den Zellen, die im 3D-Gerüst gehalten wurden, wobei ungefärbte Zellen als negativer Kontrollansatz dienten.

Die hier als schwarzer Rahmen dargestellte GA wurde für die anschließende Analyse von Beta-Three-Tubulin-positiven Zellen festgelegt; in diesem Dotplot erscheinen die positiven Zellen innerhalb des schwarzen Rahmens im rechten Bereich der X-Achse, während eine intermediäre Population im gestrichelten Rahmen sichtbar ist, die höchstwahrscheinlich Zelltrümmer darstellt und ebenso beobachtet werden kann. Ein Vergleich der manuellen Zellzählung mit der Zählung mittels Durchflusszytometrie ist in dieser letzten Abbildung dargestellt. Ein wesentlich höherer Anteil positiver Zellen kann mittels Durchflusszytometrie erfasst werden, wie durch die offenen schwarzen Quadrate angegeben, im Vergleich zu der Anzahl, die typischerweise durch manuelle Zählung bestimmt wird, wie durch die gefüllten schwarzen Dreiecke angegeben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man arme Metriken für die Kultivierung von Rand-MPCs im 3D-Gerüst verwendet und wie man die Zellen aus dem Gerüst für Durchflusszytometrie-Analysatoren freisetzt.