Die Züchtung und Anwendungen von Rotating Wand Schiff Bioreaktor Abgeleitet 3D Epithelzellen Models

Dieses unkonventionelle Protokoll stellt ein einfaches und robustes System für die Kultivierung dar. Menschliche Epithelzellen in organotypische 3D-Modelle, die das menschliche in vivo Gewebe rekapitulieren. Zuerst werden Epithelzellen zu einer konfluenten Monoschicht in einem entnommenen Gewebekulturkolben kultiviert und dann mit Mikroträgerkügelchen im STLV-Bioreaktor kombiniert, wobei die STLV auf der Plattform gedreht wird, um eine konstante Freifallumgebung mit geringer Flüssigkeitsscherung zu schaffen, die es den Zellen ermöglicht, sich an die Kügelchen anzuheften und zu wachsen und nach 96 Stunden und danach etwa jeden Tag zelluläre Aggregate zu bilden.

Füllen Sie das Medium im SDLV auf, um den Zellstoffwechsel bei der Aggregatbildung aufzunehmen, Bildproben wöchentlich durch Lichtmikroskopie, um den Entwicklungsfortschritt zu überwachen, sobald die vollständige Aggregatbildung und die zelluläre Differenzierung stattgefunden haben. Aussaat der Aggregate für nachgelagerte experimentelle Analysen und Assays. Letztendlich kann dieses System in vivo ähnliche organotypische Modellsysteme für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Untersuchungen generieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie konventionellen Zellkulturen besteht darin, dass sich die Epithelzellen differenzieren und zu gewebeartigen Aggregaten polarisieren und sich daher morphologisch und funktionell ähnlich wie das authentische menschliche Gewebe verhalten. Dieses 3D-Modellsystem bietet weitere Einblicke in die Biologie von Epithelzellen, die Interaktionen zwischen Wirtserregern und das komplexe Zusammenspiel zwischen Zelltypen, die in das System eingeführt werden können. Dr. Andrea Radkey.

Ein Postdoc in meinem Labor, wird nun dieses Verfahren zur Entgiftung des langsam drehenden lateralen Gefäß-Bioreaktors demonstrieren. Decken Sie offene Ports mit Köderkappen ab. Füllen Sie das STLV mit 95 % Ethanol und äquilibrieren Sie es 24 Stunden lang.

Entfernen Sie das Ethanol, füllen Sie es mit sterilisiertem destilliertem Wasser und inkubieren Sie es 24 Stunden lang mit den vom Verkäufer bereitgestellten Werkzeugen, lösen Sie alle Schrauben und entfernen Sie den mittleren Stopfen aus dem STLV. Legen Sie sie in einen Sterilisationsbeutel und autoklavieren Sie sie 20 Minuten lang bei 110 Grad Celsius. Bauen Sie das STLV wieder zusammen und wiederholen Sie die Entgiftung, um die Sterilität zu gewährleisten.

Ziehen Sie anschließend die Schrauben der STLV fest. Befestigen Sie den vorsterilisierten Einweghahn an jedem Anschluss. Entfernen Sie nun die Kolben von einer 10-Milliliter- und einer Fünf-Milliliter-Köderverschlussspritze und legen Sie die Kolben in die Wrapper.

Um die Sterilität zu erhalten, schrauben Sie die Spritzen auf den Absperrhahn. Fahren Sie fort, DPBS in die 10-Milliliter-Spritze zu geben, bis die STLV voll ist und die Fünf-Milliliter-Spritze zu füllen beginnt. Setzen Sie dann die sterilen Kolben in jede Spritze ein und entfernen Sie alle Restblasen im Bioreaktor, indem Sie abwechselnd die Kolben der Spritzen eintreiben.

Schließen Sie die Absperrhähne und befestigen Sie den STLV an der drehbaren vertikalen Plattform. Drehen Sie mindestens 24 Stunden lang, um ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Undichtigkeiten zu überwachen. 15 Milliliter DPBS zu 250 Milligramm Cytodex-Mikrokaro-Kügelchen geben und nach dem Abkühlen autoklavieren.

Entfernen Sie die DPBS-Waschung dreimal mit Nährmedien für die Epithelzellen. Schwenken Sie das Rohr, um die Perlen wieder aufzuhängen. Anschließend werden die Kügelchen in 15 Millilitern Nährmedien resuspendiert.

Erste Kultur mal 10 bis siebente, Epithelzellen als Monolagen in Gewebekultur. Fläschchen ernten die Zellen und zählen und bestimmen die zelluläre Lebensfähigkeit durch Trian-Blau-Ausschluss. Färben, fügen Sie die Zellen zu den vorbereiteten Kügelchen hinzu.

Spülen Sie das konische Rohr, um sicherzustellen, dass alle Zellen übertragen werden. Entfernen Sie anschließend DPBS und Spritzen aus der STLV. Entfernen Sie außerdem den Stecker mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette aus dem mittleren Anschluss.

Laden Sie die Suspension der Epithelzellperlen in die STLV. Spülen Sie das konische Rohr einmal aus, um alle Zellen und Kügelchen zu übertragen. Bringen Sie dann den Stecker des mittleren Anschlusses wieder an.

Entfernen Sie dann die Kolben von einer Fünf-Milliliter- und einer 10-Milliliter-Spritze und lösen Sie die Kolben in die Verpackungen. Um die Sterilität zu erhalten, schrauben Sie die Zollöffnungen der Spritze mit offenen Absperrhähnen fest. Füllen Sie die STLV mit Medien.

Setzen Sie die Kolben wieder ein und schließen Sie den Anschlag. Steuermann. Äquilibrieren Sie nun die neu ausgesäte STLV-Kultur in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator für 30 Minuten ohne Umdrehung. Nachdem Sie den STLV aus dem Inkubator genommen haben, öffnen Sie den Absperrhahn.

Entfernen Sie alle Blasen mit den Kolben und schließen Sie den Absperrhahn. Stellen Sie dann den STLV im Inkubator auf kontinuierliche Rotation bei 20 U/min ein. Wechseln Sie nach 96 bis 120 Stunden das Medium, indem Sie die Spritzen entfernen und beide Absperrhähne öffnen und die STLV bearbeiten, damit sich die Kügelchen und Zellen absetzen können.

Nach dem Absetzen gießen Sie etwa 75 % des Mediums aus dem seitlichen Anschluss mit den Spritzen, um das Fütterungsprotokoll durchzuführen. Auch hier gilt: Füllen Sie das Medium nach Bedarf basierend auf dem Zellstoffwechsel weiter auf. Überwachen Sie auch das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Zuschlagstoffen alle fünf bis sieben Tage.

Um eine Scherung der Aggregate zu vermeiden, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze, die etwa zwei Zentimeter von der Spitze entfernt abgeschnitten und sterilisiert wurde. Entfernen Sie vorsichtig 200 Mikroliter Aggregate aus der Mittelöffnung und aliquotieren Sie sie in zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie ein Aliquot zur Überwachung der zellulären Lebensfähigkeit. Nachdem Sie die Zellen von den Kügelchen abgenommen haben, bewerten Sie die Lebensfähigkeit durch Trianblau-Ausschluss.

Färbung für die Abbildung zellulärer Aggregate. Geben Sie 0,5 bis einen Milliliter Medium zu dem zweiten 1,5 Milliliter Aggregataliquot und geben Sie es unter Verwendung eines Cutoffs in eine kleine Petrischale. 1000 Mikroliter Pipettenspitze Bildaggregate.

Bei einigen Epithelzellmodellen ist es notwendig, die Aggregate mit einem inversen Lichtmikroskop in eine Einweghälfte zu überführen, um die Belüftung der Kultur etwa eine Woche vor der Entnahme der Aggregate zu erhöhen. Nehmen Sie zur Analyse die Spritzen aus dem STLV und gießen Sie etwa 50 % des Mediums aus dem seitlichen Anschluss ab. Entfernen Sie den Mittelstopfen und gießen Sie den gesamten Inhalt vorsichtig in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen aus der Mittelöffnung.

Spülen Sie den STLV zweimal mit fünf Millilitern Medium und kombinieren Sie Spülungen mit geernteten Zuschlagstoffen. Übertragen Sie anschließend die Zuschlagstoffe aus dem konischen 50-Milliliter-Rohr in den Harv. Nach einer Woche wurden sorgfältig Granulate für potenzielle Assay-Formate, Assays und Analysen gezüchtet. Im STLV-Bioreaktorsystem wurden differenzierte humane Epithelaggregate gezüchtet.

Die REM- und TEM-Bilder werden von menschlichen Vaginalzellen gesammelt, die 39 Tage lang in der STLV gezüchtet wurden. Beachten Sie, dass die 3D-Aggregate ultrastrukturelle Merkmale aufweisen, die denen von Geweben ähneln, die Mikrokämme, Einstülpungen, intrazellulären sekretorischen Vesikel und Mikrovilli auf der apikalen Oberfläche. Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopiebilder von 3D-Vaginalzellen weisen auf die Expression von Muzin und Markern hin, die spezifisch für Epithelzellen und die terminale Differenzierung sind. Physiologisch relevante Phänotypen dienen auch als hervorragende Plattform für die Bewertung der Toxizität von Verbindungen.

Der MTT-Assay, ein häufig verwendeter Assay zur Messung der Lebensfähigkeit, des Stoffwechsels oder der Proliferation von Zellen, kann verwendet werden, um die Toxizität gegenüber verschiedenen Chemikalien und Verbindungen zu messen. Alternativ ist die Toxizität nach Behandlung mit Prüfsubstanzen durch Trianblau-Ausschluss zu messen. In diesem Beispiel zeigten die vaginalen Aggregate nach der Behandlung mit dem NONOXINOL nine eine Toxizitätsreaktion, die der der zervikalen X-Explan-Modelle ähnelte, jedoch ein anderes Profil im Vergleich zu Monoschichten.

Die 3D-Aggregate reagieren funktionell auf Stimulation, zum Beispiel auf Stimulation mit Molekülen, die von Mikroben stammen und von den Toll-like-Rezeptoren erkannt werden. Die Aggregate reagieren und sezernieren proinflammatorische Zytokine, einschließlich des IL-6-Proteins und der Transkriptexpression des Progesteronrezeptors. Ein Rezeptor, der auf Hormonstimulation reagiert, kann auch in den Vaginalzellen beobachtet werden.

Die 3D-Aggregate haben nicht nur die Fähigkeit, auf Krankheitserreger- und Hormonmoleküle zu reagieren, sondern sind auch in der Lage, eine Herpes-simplex-Virus-Typ-2-Infektion funktionell zu unterstützen. Eine konfokale Mikroskopieaufnahme von HSV zwei infizierten 3D-Vaginalaggregaten zeigt eine Infektion. Die physikalischen und funktionellen Eigenschaften einzelner Zellen innerhalb der Aggregate können auch durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden, z. B. durch Durchflusszytometrie-Assays zur Messung der Oberflächenexpression von Muck auf einzelnen Vaginalzellen.

Die 3D-Vaginalaggregate exprimierten einen geringeren Prozentsatz an Schmutz auf ihrer Oberfläche im Vergleich zu Monolayern nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ermöglichte es Forschern aus den Bereichen Gewebebiologie und Infektionskrankheiten, die Struktur und physiologische Reaktionen auf Reize zu untersuchen. Mit diesen organotypischen Modellen können wir die menschliche Biologie umso besser kapitulieren.