Die Züchtung und Anwendungen von Rotating Wand Schiff Bioreaktor Abgeleitet 3D Epithelzellen Models

Dieses nicht konventionelle Protokoll stellt ein einfaches und robustes System zur Kultivierung menschlicher epithelialer Zellen in organotypischen 3D-Modellen vor, die das menschliche in-vivo-Gewebe nachbilden. Zunächst werden epitheliale Zellen in einem Gewebekulturkolben zu einer konfluenten Monoschicht kultiviert, geerntet und anschließend mit Mikroträgerkugeln im STLV-Bioreaktor kombiniert. Der STLV wird auf der Plattform rotiert, um ein kontinuierliches Freifallmilieu mit geringer Flüssigkeitschubspannung zu erzeugen, wodurch die Zellen an den Kugeln anhaften und wachsen können und nach 96 Stunden sowie danach etwa täglich zelluläre Aggregate bilden.

Ersetzen Sie das Medium im SDLV wöchentlich, um den zellulären Stoffwechsel nach der Bildung von Aggregaten zu berücksichtigen; nehmen Sie Bildproben mittels Lichtmikroskopie vor, um den Entwicklungsfortschritt zu überwachen, sobald die vollständige Aggregatbildung und zelluläre Differenzierung erfolgt ist. Säen Sie die Aggregate für nachgeschaltete experimentelle Analysen und Assays aus. Letztendlich kann dieses System in vivo-ähnliche organotypische Modellsysteme für eine Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen generieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Zellkultur besteht darin, dass sich die epithelialen Zellen differenzieren und in gewebeähnliche Aggregate polarisieren, wodurch sie morphologisch und funktionell ähnlich wie authentisches menschliches Gewebe verhalten. Dieses 3D-Modellsystem ermöglicht weitere Einblicke in die Biologie epithelialer Zellen, in Wirt-Pathogen-Interaktionen sowie in das komplexe Zusammenspiel zwischen den in das System eingeführten Zelltypen. Dr. Andrea Radkey.

Ein Postdoktorand in meinem Labor wird nun dieses Verfahren zur Entgiftung des langsam rotierenden Seitengefäß-Bioreaktors demonstrieren. Bedecken Sie offene Anschlüsse mit Verschlusskappen. Füllen Sie den STLV mit 95 % Ethanol und lassen Sie ihn 24 Stunden lang äquilibrieren.

Entfernen Sie das Ethanol, füllen Sie dann mit sterilisiertem destilliertem Wasser auf und inkubieren Sie 24 Stunden unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten Werkzeuge. Lösen Sie alle Schrauben und nehmen Sie den Mittelstopfen aus dem STLV heraus. Legen Sie die Teile in eine Sterilisationshülle und autoklavieren Sie sie bei 110 Grad Celsius für 20 Minuten. Bauen Sie den STLV wieder zusammen und wiederholen Sie die Entgiftung, um die Sterilität sicherzustellen.

Danach ziehen Sie die Schrauben des STLV fest. Bringen Sie den vorsterilisierten Einweg-Ventilhahn an jedem Anschluss an. Entfernen Sie nun die Kolben einer 10-Milliliter- und einer 5-Milliliter-Luer-Lock-Spritze und lassen Sie die Kolben in den Verpackungen.

Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, schrauben Sie die Spritzen auf den Stop-Hahn. Füllen Sie anschließend DPBS in die 10-Milliliter-Spritze, bis der STLV vollständig gefüllt ist und die 5-Milliliter-Spritze beginnt sich zu füllen. Danach setzen Sie die sterilen Kolben in jede Spritze ein und entfernen restliche Blasen im Bioreaktor, indem Sie abwechselnd die Kolben der Spritzen betätigen.

Schließen Sie die Hähne und befestigen Sie den STLV an der rotierenden vertikalen Plattform. Drehen Sie mindestens 24 Stunden lang, um Leckagen in einem 50-Milliliter-Konischgefäß zu überwachen. Geben Sie 15 Milliliter DPBS zu 250 Milligramm CytoDex-Mikrokügelchen hinzu und autoklavieren Sie nach dem Abkühlen.

Entfernen Sie das DPBS durch dreimaliges Waschen mit Kulturmedium für die epithelialen Zellen. Wirbeln Sie das Gefäß, um die Kügelchen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend resuspendieren Sie die Kügelchen in 15 Milliliter Kulturmedium.

Kultivieren Sie zunächst eine mal zehn hoch sieben Epithelzellen als Monolayer in Zellkulturgefäßen. Ernten Sie die Zellen und bestimmen Sie die Zellzahl sowie die Zellviabilität durch Ausschlussfärbung mit Trypanblau. Färben Sie die Zellen und geben Sie sie zu den vorbereiteten Kügelchen.

Spülen Sie das kegelförmige Reagenzglas, um sicherzustellen, dass alle Zellen übertragen werden. Entfernen Sie anschließend DPBS und Spritzen vom STLV. Entfernen Sie außerdem den Verschluss aus dem mittleren Anschluss mithilfe einer 10-Milliliter-serologischen Pipette.

Laden Sie die Aufschlämmung der epithelialen Zellen mit Perlen in das STLV auf. Spülen Sie das kegelförmige Reagenzglas einmal, um alle Zellen und Perlen zu überführen. Danach ersetzen Sie den Verschluss des mittleren Anschlusses.

Entfernen Sie anschließend die Kolben aus einer Fünf-Milliliter- und einer 10-Milliliter-Spritze und lassen Sie die Kolben in den Verpackungen. Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, verschrauben Sie die Zollanschlüsse der Spritzen mit offenen Hähnen. Füllen Sie das STLV mit Medium.

Setzen Sie die Kolben wieder ein und schließen Sie den Hahn. Äquilibrieren Sie nun die neu beimpfte STLV-Kultur 30 Minuten lang in einem 37 °C warmen Inkubator ohne Rotation. Nach dem Entnehmen der STLV aus dem Inkubator öffnen Sie den Hahn.

Entfernen Sie etwaige Blasen mit Hilfe der Kolben und schließen Sie den Hahn. Stellen Sie dann den STLV im Inkubator auf kontinuierliche Drehung bei 20 U/min. Nach 96 bis 120 Stunden wechseln Sie das Medium, indem Sie die Spritzen entfernen und beide Hähne öffnen, wobei der STLV leicht gekippt wird, um das Absinken der Kügelchen und Zellen zu ermöglichen.

Wenn sich die Zellen abgesetzt haben, entfernen Sie mithilfe der Spritzen etwa 75 % des Kulturmediums über den Seitenanschluss, um das Fütterungsprotokoll durchzuführen. Ergänzen Sie das Medium erneut nach Bedarf entsprechend dem zellulären Stoffwechsel. Überwachen Sie außerdem alle fünf bis sieben Tage das Wachstum und die Vitalität der Aggregate.

Um eine Scherung der Aggregate zu vermeiden, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze, deren Spitze etwa zwei Zentimeter vom Ende abgeschnitten und sterilisiert wurde. Entnehmen Sie vorsichtig 200 Mikroliter Aggregate aus dem mittleren Port und portionieren Sie sie auf zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie eine Portion zur Überwachung der Zellviabilität. Nachdem die Zellen von den Kügelchen abgelöst wurden, bewerten Sie die Viabilität mittels Trypanblau-Ausschluss.

Färbung zur bildgebenden Darstellung zellulärer Aggregate. Geben Sie 0,5 bis einen Milliliter Medium zu dem zweiten 1,5-Milliliter-Anteil der Aggregate und überführen Sie die Probe mit einer abgeschnittenen 1000-Mikroliter-Pipettenspitze in eine kleine Petrischale. Bilden Sie Aggregate ab.

Bei Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops für bestimmte epitheliale Zellmodelle ist es notwendig, die Aggregate etwa eine Woche vor der Ernte in eine Einweg-Halbschale zu überführen, um die Belüftung der Kultur zu verbessern. Zum Analysieren entfernen Sie die Spritzen vom STLV und gießen etwa 50 % des Mediums über den Seitenhahn ab. Entfernen Sie den mittleren Verschluss und gießen Sie vorsichtig den gesamten Inhalt über den zentralen Anschluss in ein 50-Milliliter-Konischglas.

Spülen Sie den STLV zweimal mit je fünf Millilitern Medium und vereinigen Sie die Spülflüssigkeiten mit den geernteten Aggregaten. Überführen Sie anschließend die Aggregate aus dem 50-Milliliter-Konischkolben in den Harv. Nach einer Woche ernten Sie die Aggregate vorsichtig für potenzielle Assay-Formate; es wurden Assays durchgeführt und differenzierte humane epitheliale Aggregate, die im STLV-Bioreaktorsystem gezüchtet wurden, analysiert.

Die REM- und TEM-Aufnahmen stammen von menschlichen Vaginalzellen, die 39 Tage lang im STLV kultiviert wurden. Beachten Sie, dass die 3D-Aggregate ultrastrukturelle Merkmale aufweisen, die Geweben ähneln, wie Mikrorillen, Einbuchtungen, intrazelluläre Sekretvesikel und Mikrovilli auf der apikalen Oberfläche. Konfokale immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der 3D-Vaginalzellen zeigen die Expression von Mucin sowie von Markern, die spezifisch für Epithelzellen und terminale Differenzierung sind. Physiologisch relevante Phänotypen eignen sich zudem hervorragend als Plattform zur Bewertung der Toxizität von Substanzen.

Der MTT-Test, ein häufig verwendeter Test zur Messung der Zellviabilität, des Stoffwechsels oder der Proliferation, kann zur Bestimmung der Toxizität gegenüber verschiedenen Chemikalien und Verbindungen eingesetzt werden. Alternativ kann die Toxizität nach Behandlung mit Testsubstanzen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmt werden. In diesem Beispiel zeigten die vaginalen Aggregate nach Behandlung mit Nonoxinol-9 eine Toxizitätsantwort, die derjenigen von zervikalen X-Explantmodellen glich, jedoch ein anderes Profil im Vergleich zu Monolagen aufwies.

Die 3D-Aggregate sind funktionell reaktionsfähig, beispielsweise nach Stimulation mit von Mikroben stammenden Molekülen, die von den Toll-ähnlichen Rezeptoren erkannt werden. Die Aggregate reagieren und sezernieren proinflammatorische Zytokine, einschließlich IL-sechs-Protein sowie Transkriptexpression des Progesteronrezeptors. Ein Rezeptor, der auf hormonelle Stimulation reagiert, kann ebenfalls in den Vaginalzellen beobachtet werden.

Die 3D-Aggregate besitzen nicht nur die Fähigkeit, auf Pathogen- und Hormonmoleküle zu reagieren, sondern können auch funktionell eine Infektion mit Herpes-simplex-Virus Typ zwei unterstützen. Ein konfokales Mikroskopiebild von HSV-2-infizierten 3D-vaginalen Aggregaten zeigt die Infektion. Die physikalischen und funktionellen Eigenschaften einzelner Zellen innerhalb der Aggregate können zudem mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden, beispielsweise ein Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der Oberflächenexpression von MUC1 auf einzelnen Vaginalzellen.

Die 3D-vaginalen Aggregate wiesen nach ihrer Entwicklung einen geringeren Prozentsatz von Muck One auf ihrer Oberfläche auf als Mono-Schichten. Diese Technik ermöglichte es Forschern auf den Gebieten der Gewebebiologie und Infektionskrankheiten, Struktur und physiologische Reaktionen auf Reize zu untersuchen. Mithilfe dieser organotypischen Modelle können wir die menschliche Biologie besser nachbilden.