Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung einer Technologie auf Basis eines mesoporösen Siliziumdioxid-Dünnfilms zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus humanem Serum. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesoporösen Siliziumdioxid-Dünnschichtchips hergestellt und mit Sauerstoffplasma vorbehandelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine einfache Vorbehandlung des Serums durchzuführen und dann die niedermolekularen Proteine und Peptide aus dem Serum durch On-Chip-Fraktionierung anzureichern.

Nach der Aufklärung der niedermolekularen Proteine und Peptide aus dem Chip werden die Moleküle mit Hilfe der matrixgestützten Laserdesorptionsionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie profiliert. Der letzte Schritt besteht darin, eine professionelle Software zur Datenanalyse zu verwenden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse der Massenspektren und der statistischen Analyse die Spezifität und Wirksamkeit der Proteomernte mit niedrigem Molekulargewicht.

Zu den Hauptvorteilen dieser Techniken oder bestehender Technologien wie 2D-Seiten für westliches Blut gehören eine leistungsstarke Kapazität zur Anreicherung der gering reichlich vorhandenen Proteine und Peptide mit niedrigem Molekulargewicht im Serum, der hohe Durchsatz und die Zeiteffizienz, die Reduzierung des Serumprobenbedarfs und die niedrigen Kosten. Einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens ist die Kontrolle der Morphologie eines Nanoporennetzes, wie z. B. die Größenverteilung der PO, das PO-Schiff und die schlechte Interkonnektivität. Denn dieses Merkmal bestimmt die Sensitivität und die Spezifität einer Zielblutsignatur für die Profilerstellung.

Um Bewegung zu gewährleisten, versuchen wir, das Modellverhältnis des Ausgangsmaterials sorgfältig zu kontrollieren und die Anweisungen genau zu befolgen, um die Beschichtungslösung für den Chip zu erstellen. Beginnen Sie mit der Herstellung der hydrolysierten Silikat-Vorläuferlösung. Mischen Sie 14 Milliliter Tees mit 17 Millilitern 200 Proof Ethanol, 6,5 Millilitern entionisiertem Wasser und 0,5 Millilitern sechs molare Salzsäure unter starkem Rühren.

Fahren Sie mit dem starken Rühren fort und erhitzen Sie die resultierende Lösung zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes die Tri-Block-Copolymer-Lösung vor, indem Sie die gewählte Polymerlösung unter kräftigem Rühren zu 10 Millilitern Ethanol bei Raumtemperatur hinzufügen. In dieser Demonstration wird onic F1 27 verwendet.

Vervollständigen Sie die Mischung, indem Sie die Silikatlösung in dieses Tri-Block-Copolymer geben, gefolgt von zwei Stunden starkem Rühren bei Raumtemperatur. Tragen Sie einen Milliliter der resultierenden Beschichtungslösung auf einen vier Zoll großen Siliziumwafer auf, indem Sie 20 Sekunden lang mit einer Geschwindigkeit von 1.500 U/min schleudern. Als nächstes erhitzen Sie den Wafer 12 Stunden lang bei 80 Grad Celsius.

Dann die Temperatur um ein Grad Celsius pro Minute erhöhen, bis 425 Grad Celsius erreicht sind und bei dieser Temperatur fünf Stunden backen. Als nächstes wird die resultierende mesoporöse Siliziumdioxid- oder MPS-Chipoberfläche mit Sauerstoffplasma-Veraschung vorbehandelt. Messen Sie dann die Schichtdicke und Porosität mit einem Oxometer.

In der Zwischenzeit fügen Sie zu jeder Serumprobe Trifluorsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % und Acetylnitril bis zu einer Endkonzentration von 5 % hinzu. Schütteln Sie diese Proben dann auf einem Tischwirbelschüttler bei Raumtemperatur für 30 Minuten, nachdem Sie die Chips über Nacht in einem Ofen bei 160 Grad Celsius vorgebacken haben. Verwenden Sie Druckluft, um alle Partikel zu entstauben, die sich auf der Oberfläche des Chips befinden könnten. Reinigen Sie den Deckglas mit 100 % Ethanol und legen Sie ihn auf die NPS-Chipoberfläche, um die Probenvertiefungen zu erstellen.

Drücken Sie den Deckel mit einer Pinzette nach unten, um eine vollständige Abdichtung mit dem Chip zu gewährleisten. Pipettieren Sie anschließend jeweils 10 Mikroliter Serumprobe hinein. 30 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur gut inkubieren, damit die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht nach der Inkubation in die Poren gelangen können, Serum aus den Vertiefungen aspirieren und entsorgen.

Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter deionisiertes Wasser in jede Vertiefung, um größere Proteine wegzuspülen. Wiederholen Sie diese Wäsche viermal und arbeiten Sie jeweils mit nur ein bis zwei Vertiefungen. Um eine Verdunstung zu verhindern, fügen Sie jeder Probe schnell fünf Mikroliter Elutionspuffer hinzu.

Pipettieren Sie 30 Mal auf und ab, während Sie die Pipettenspitze zum Mischen in der Vertiefung bewegen. Nach dem Mischen den gesamten elucianischen Puffer aspirieren und in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben, bis es bereit ist, eine matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Ionisationsanalyse durchzuführen, um 0,5 Mikroliter der Probe auf die MALDI-Zielplatte zu bringen und trocknen zu lassen, dann 0,5 Mikroliter Matrix in 50 % Acetonitril mit 0,1 % TFA zu spoten und den nächsten Spot mitkristallisieren zu lassen. 0,5 Mikroliter Kalibrierlösung auf den Kalibrierfleck geben. Sobald sie trocken ist, setzen Sie die Zielplatte in das Maloff-Massenspektrometer ein.

Das Gerät sollte in den positiven Reflektormodus mit einer Laserintensität von 4.203.000 Schüssen pro Probe versetzt werden. Führen Sie zunächst die Analyse mit einem ausgewählten Massenbereich von 800 bis 5.000 Dalton mit einer Zielmasse von 2000 Dalton durch. Führen Sie dann die gleiche MALDI-Toff-Analyse im linearen Modus durch, ändern Sie jedoch den Massenbereich auf 900 bis 10.000 Dalton oder 3000 bis 70.000 Dalton mit einer Zielmasse von 5.000 Dalton.

Nach der Multi-Top-Analyse verarbeiten Sie die Rohspektren mit der Peaklistenkonvertierungssoftware und exportieren Sie sie dann in die Spezale. Align-Software für die Vorverarbeitung: Richten Sie alle Spektren mit der Peak-Ausrichtung durch schnelle Fourier-Transformation oder P-A-F-F-T-Korrelationsmethode aus und normalisieren Sie die Intensitäten auf den Gesamtionenstrom. Führen Sie die Peak-Erkennung mit einem Höhenverhältnis von zwei und 0,3 % des Massenfensters durch.

Korrigieren Sie den Basisplan, und entfernen Sie die negativen Werte vor der Analyse. Das Importieren von T 2D-Dateien in die Markeransicht ist der erste Schritt für die überwachte Verarbeitung von maldi-Daten verschiedener Gruppen. Öffnen Sie zunächst die Markierungsansichtssoftware und importieren Sie dann die T 2D-Dateien.

Wählen Sie den Ordner aus, der die T 2D-Dateien enthält, und richten Sie die Parameter für die Spektrenverarbeitung ein. Öffnen Sie als Nächstes die Beispieltabelle. Markieren Sie Beispiele aus derselben Gruppe, und entwerfen Sie eine Gruppenbeschriftung.

Normalisieren Sie die Stichproben anhand von Gesamtflächensummen. Öffnen Sie dann das Optionsfenster. Richten Sie für jede Gruppe eine eindeutige Farbe und ein eindeutiges Symbol ein.

Führen Sie dann die Hauptkomponentenanalyse und den T-Test für die aktiven Daten durch, die Proben werden in verschiedene Gruppen unterteilt, wobei die Ergebnisse von PC eins und PC zwei verwendet werden. Die Biomarker-Kandidaten werden entsprechend den PC-Ladeplots gefunden, die die Zusammenfassung des Intensitätsprofils des ausgewählten Biomarkers anzeigen, indem Sie auf die Diagrammprofile für ausgewählte Peaks klicken. Die Punkte mit den größeren Werten konnten verschiedene Gruppen unterscheiden.

Nach dem Vergleich von Gruppen mit einem T-Test sortieren Sie die Tabelle nach aufsteigenden P-Werten, um die Peaks zu bestimmen, die verschiedene Gruppen unterscheiden können, hier sind die MS-Spektren der Serumprobe für Peptide im Bereich von 900 bis 10.000 Dalton und für Proteine im Bereich von 3000 bis 70.000 Dalton. Die Spektren der unbearbeiteten Proben verdeutlichen die Signalunterdrückung im niedermolekularen Bereich aufgrund des Vorhandenseins von gut ionisierten, sehr häufig vorkommenden hochmolekularen Proteinen wie Albumin Nach der Fraktionierung durch die MPS-Dünnschichten wurde der Großteil der großen Moleküle abgereichert, was zu einer signifikanten Anreicherung der niedermolekularen Komponenten führte. Als Kontrolle wurde die gleiche Serumprobe auf eine nicht poröse Oberfläche aus reinem Siliziumdioxid aufgetragen.

Um die Spezifität von MPS-Dünnfilmen für die Wiederherstellung von Proteomen mit niedrigem Molekulargewicht zu bewerten, gab es keine signifikante Ernte von Peptiden oder Proteinen aus dem nicht-porösen Siliziumdioxid. Daraus kann geschlossen werden, dass es die mesoporöse Architektur und nicht die Oberflächenaffinität der Kieselsäure war, die den vorherrschenden Faktor bei der Anreicherung von LMWP darstellte. Präzise kontrollierte Variationen der Porengröße können durch den Einsatz von Copolymeren mit unterschiedlichen hydrophoben Blocklängen erreicht werden.

Der Einfluss der Porengröße auf das LMW-Peptid und die Wirksamkeit der Proteinrückgewinnung wurde anhand von MPS-Dünnfilmen untersucht, die aus vier onischen Tensiden mit unterschiedlichen Volumenverhältnissen der hydrophoben und hydrophilen Komponenten hergestellt wurden. Hier ist eine vergrößerte Ansicht der Maldi-Spektren zu sehen, die den charakteristischen molekularen Cutoff jedes MPS-Chips zeigt, der mit der Porengröße korreliert. Der Bereich der Porengrößen führte zur Rückgewinnung eines unterschiedlichen Repertoires an Peptiden und Proteinen aus derselben Serumprobe durch Größen- und Formausschluss.

Dies lässt sich auch an der bidirektionalen hierarchischen Clusterung der Peptidmix-Merkmale zwischen den verschiedenen Chips beobachten. Die Intensität der roten oder gelben Farbe gibt die relative Peptidkonzentration an. Größere Poren verbesserten die Ernte größerer Peptide, während die kleinen Peptide bevorzugt aus den Chips mit kleineren Poren zurückgewonnen wurden.

Verschiedene MPS-Dünnschicht-periodische Nanostrukturen, die unter Verwendung von Tri-Block-Copolymeren mit hohem Molekulargewicht gebildet werden, wie z. B. onic F1 27 mit ähnlichen Porgrößenverteilungen, können durch Abstimmung der Polymerkonstruktion in der Vorläuferlösung erhalten werden. Die kubischen und sechseckigen 3D-Waben-Nanostrukturen weisen eine wünschenswertere Nanoporen-Interkonnektivität und eine leichter zugängliche Nanoporenmorphologie auf. Infolgedessen zeigen sie eine überlegene Leistung bei der selektiven Anreicherung von LMW-Peptiden und dann der hexagonalen 2D-Struktur.

Dies ist der Fall, obwohl sie eine ähnliche Porengrößenverteilung und den gleichen molekularen Grenzwert für die Serumfraktionierung aufweisen. Die Konjugation der Organy-Spur auf MPS-Chips wurde durch die Einführung von Sauerstoffplasma-Veraschung zur Vorbehandlung der Chipoberfläche optimiert. Diese Abbildung zeigt die ladungsspezifische Rückgewinnung für die Chips mit unterschiedlichen Oberflächenfunktionen anhand eines Balkendiagramms der MS-Detektionsintensität von selektiv eingefangenen Peptiden auf den funktionalisierten Chips.

Entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt sind die Peptide bei pH 7,0 positiv oder negativ geladen, neben der Verarmung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht. Die Ergebnisse zeigen, dass das strukturelle Design und die chemische Funktionalisierung des NPS die Spezifität der Peptidanreicherung weiter erhöhten. Mit dieser Entwicklung.

Wir erwarten, dass diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Proteomik den Weg ebnen wird, um neuartige Biomarker für die Frühdiagnose oder therapeutische Bewertung in der Flöte des Körpers aus dem menschlichen und tierischen Modell zu erforschen. Folglich verbesserte das Raster die personalisierte Behandlung schwerer Krankheiten.