Name: Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Lernen Sie die Anreicherung niedermolekularer Proteine aus menschlichem Serum mittels mesoporöser Siliciumdioxid-Dünnschichten. Diese Methode ermöglicht effiziente Proteom-Profiling für Biomarker-Discovery.

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Diese Arbeit wurde von der Allianz NanoHealth Pre-Center Award (W81XWH-11-2-0168) und Texas Center for Cancer Nanomedizin (1U54CA151668-01) finanziert.

1. Chipfertigungstechnologie <ol><li> Erstellen der Beschichtungslösung für den Chip, indem man mit dem hydrolysierten Silikat Vorläuferlösung. Mischen 14 ml Tetraethylorthosilicat (TEOS) mit 17 ml Ethanol, 6,5 ml deionisiertes Wasser und 0,5 ml 6 M HCl unter starkem Rühren (1200 Umdrehungen pro Minute) unter Verwendung einer Heizplatte gerührt. Erhitzen dieser Lösung bei 80 ° C für 2 Stunden, Halten der Rühren konstant. </li><li> Planen Polymerlösungen mit indem die gewünschte Triblock-coploymer (Pluronic F127, L121 und P123) zu 10 ml Ethanol bei Raumtemperatur unter starkem Rühren. Führen der Mischung durch Zugabe von 7,5 ml der Silikatlösung (aus Schritt 1.1) in den Tri-Block-Copolymer-Lösung für 2 Stunden starkem Rühren bei Raumtemperatur. Dies ist der letzte Beschichtungslösung. </li><li> Es wird 1 ml der Beschichtungslösung auf ein 4 Zoll-Siliciumwafer durch Schleuderbeschichten bei einer Geschwindigkeit von 1500 UpM für 20 Sekunden. Dann wird Wärme bei 80 ° C für 12 Stunden. </li><li> Erhitzen Sie die Filme auf organische su entfernenrfactant durch Erhöhen der Temperatur 1 ° C pro Minute auf 425 ° C und dann 5 Stunden gebacken. </li><li> Vorbehandeln die mesoporösen Siliciumdioxid (MPS) Chip-Oberfläche mit Sauerstoff-Plasma-Veraschung (Plasma Asher - March Plasma Systems). (O 2 Durchfluss: 80 sccm, Leistung: 300 W, Zeit: 10 Minuten). </li><li> Optional Oberfläche chemische Modifikation: silanisiert Chips in 3% Organosilan in einer Methanol: DI-Wasser (19:1)-Lösung für 72 Stunden bei Raumtemperatur unter N 2-Handschuhfach. Spülen Sie nacheinander mit Methanol und DI-Wasser. Cure-Chips bei 110 ° C für 15 Minuten in einem Gebläse-betriebenen Ofen. </li></ol> 2. Probenvorbehandlung <ol><li> In TFA und ACN zu den Serumproben, so dass die Endkonzentration 0,01% TFA und 5% ACN sind. Vortex mischen. </li><li> Schütteln diese Proben auf einem Tisch Vortex-Schüttler bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li></ol> 3. Serum-Fraktionierung <ol><li> Pre-Bake-Chips über Nacht in einem Ofen bei 160 ° C Alternativ store die Chips in einem Exsikkator bis zur Verwendung um die Befeuchtung der Oberfläche durch das umgebende Wasser in der Luft zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie Druckluft zu entstauben, dass Partikel, die auf der Oberfläche des Chips sein kann. </li><li> Schneiden Sie vorgefertigte, gekauft CultureWell chambered Deckglas, um die gewünschte Anzahl von Brunnen gehören. Sauberes Deckglas mit 100% Ethanol und dann am MPS Chipoberfläche. Drücken Sie nach unten Deckglas mit einer Pinzette, um eine vollständige Abdichtung mit Chip zu gewährleisten. </li><li> Je 10 ul Serum Probe in jedem gut 3 mm. Inkubieren für 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette bis Serum aus Brunnen und entsorgen. Je 10 ul entionisiertem Wasser in jede Vertiefung weg zu waschen größeren Proteinen. 4 Mal wiederholen. </li><li> Je 5 ul Elutionspuffer (0,1% TFA + 50% ACN) zu jeder Probe gut. Und Abpipettieren 30-mal, während Sie die Pipettenspitze herum in den Brunnen, um den Elutionspuffer zu mischen. (Nur Anwendung Elutionspuffer auf 1-2 Proben zu einem Zeitpunkt zu verhindern Elutionspufferverdunstet so schnell). </li><li> Nach dem Mischen pipettieren alle Elutionspuffer und Ort in einem Mikrozentrifugenröhrchen erst unmittelbar vor der MALDI-TOF-Analyse durchzuführen. </li><li> Um die Komplexität einer biologischen Probe zu emulieren und um die Bereicherung Effekt bei der Ernte niedermolekulare Spezies mit unserem On-Chip-Fraktionierung System evaluieren, haben wir uns zusammengesetzt und eine Standard-Mischung von Proteinen und Peptiden zählen 26 verschiedene Arten mit einem breiten Bereich der Molekulargewichte (900 bis 66 500 Da) und PiS (4,0-10,2) und Konzentrationen (0,5-8 pmol / ul) (siehe Liste Protein in Tabelle 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF Analyse von Peptiden <ol><li> Spot 0,5 ul Probe auf MALDI-Target Platte und trocknen lassen. </li><li> Landschaftliches 0,5 ul Matrix (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), 5 g / L) oder gesättigten Lösung von trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (SA) in 50% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA und erlauben, Co-Kristallisation. &lt;/ Li&gt; <li> Spot 0,5 ul Kalibrierlösung jeder Kalibrierung vor Ort und trocknen lassen. </li><li> Legen Sie die Zielscheibe in MALDI-TOF-Massenspektrometer. Die Maschine sollte zu positiven Reflektor-Modus mit einer Laserintensität von 4200 und 3000 Aufnahmen pro Probe eingestellt werden. Die ausgewählten Massenbereich sollte 800 bis 5000 Da mit einer Ziel-Masse von 2000 Da sein. </li><li> Führen Sie dieselben MALDI-TOF-Analyse im linearen Modus ändern, aber die Masse Bereich auf 900 bis 10.000 Da oder 3000 auf 70.000 Da und einem Ziel-Masse von 5000 Da. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Die Roh-Spektren wurden mit dem ConvertPeakList Software verarbeitet und die Daten exportiert wurde, um Software für die Vorverarbeitung SpecAlign. Alle Spektren wurden ausgerichtet mit dem PAFFT Korrelation Verfahren und Intensitäten wurden auf insgesamt Ionenstrom (TIC) in jedem entsprechenden Spektrum normalisiert. Alle Spektren wurden geglättet und mit Faktor 4 und 0,5 entrauschte bzw. Die Peaks wurden mit einem Ausgangswert von 0,5, Massen-Fenster von 21 und Höhe erfasstVerhältnis 1,5, wurden negative Werte vor der Analyse entfernt. </li><li> Hierarchical Clustering wurde unter Verwendung von Cluster 3.0 und visualisiert mit Mapletree Software. MALDI-MS-Daten (m / z Peakintensitäten) war log-transformiert, normalisiert, und die mediane zentriert. Pearson-Korrelation wurde verwendet, um den Abstand zwischen den Proben zu berechnen, und vollständige Bindung Clustering durchgeführt. </li><li> Eine unabhängige Student t-Test wurde zum Vergleich zwischen den Gruppen (n = 2-Gruppen) für jeden erkannten MS-Peak vor unüberwachten hierarchischen Cluster-Analyse verwendet. Ein P-Wert von 0,02 oder niedriger wurde als signifikant differentiell geerntet Peptiden und Proteinen unter den verschiedenen mesoporösen Proteom-Chips (Große Poren verglichen mit kleinen Poren) zu wählen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wie in 1 gezeigt, in dieser Studie haben wir eine Reihe von mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschichten mit einer Vielzahl von nanotextures hergestellt und umfassend untersucht dieir Verwendung bei der selektiven Aufnahme und Anreicherung LMW Peptide und Proteine ​​aus menschlichem Serum. 2a und b zeigen die MS-Spektren des unbearbeiteten Serumprobe für Peptide im Bereich von 900 bis 10.000 Da und für Proteine ​​im Bereich von 3.000 ~ 70.000 Da jeweils . Diese Spektren veranschaulichen die Signalunterdrückung in der LMW Bereich aufgrund der Gegenwart von gut ionisiert, zahlreicheren mit hohem Molekulargewicht (HMW) Proteine, wie Albumin. 2c und d zeigen die MS-Spektren der Serumprobe nach Fraktionierung durch das MPS-L121 (Porengröße, 6 nm). Die meisten der großen Moleküle aufgebraucht wurde, was zu einer signifikanten Anreicherung der LMW-Komponenten. Als Kontrolle wurde die gleiche Serumprobe auf einem unporösen reinem Siliciumdioxid aufgetragen um die Spezifität der MPS Dünnschichten für LMWP Verwertung zu bewerten. Wie in 2e und f ersichtlich ist, gab es keinen signifikanten Gewinnung von PeptidenGezeiten oder Proteinen aus der nicht porösen Siliziumdioxid. So kann der Schluss gezogen, dass es die mesoporösen Architektur und nicht die Silica-Oberfläche, die die Affinität überwiegen Faktor stellt in der Anreicherung von LMWP war. Genau kontrollierte Variationen in der Porengröße kann durch die Verwendung von Copolymeren mit unterschiedlichen hydrophoben Block gewährleistet werden konnte. Durch die Verwendung der Proteine ​​und Peptide ausgebildet Mischung wurde die Wirkung der Porengröße auf der LMW-Peptid und Proteingewinnung Wirksamkeit untersucht unter Verwendung MPS dünnen Filmen aus vier Pluronic-Tenside (F127, P123, L121, L121 und zzgl. Quellmittel) mit unterschiedlichen Volumenverhältnissen hergestellt der hydrophilen und hydrophoben Komponenten Porengrößen von 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm und 9,0 nm bzw. bilden. Dieser Bereich von Porengrößen führte zur Gewinnung von einer anderen Repertoire von Peptiden und Proteinen aus der gleichen Serumprobe über Größe und Form Ausschluss (Abbildung 3). Das Protein-Spektren bei hohem Molekulargewicht demonstrate die molekularen Cut-off von jeder Art von Chip. Zusätzlich zu den größenabhängigen Erschöpfung der HMW-Proteine, zeigt der On-Chip-Fraktionierung des Standards Lösung eine Differenzial und selektiven Anreicherung von LMW Spezies mit den Porengrößen zugeordnet. Die Zwei-Wege-hierarchisches Clustering in Abbildung 3b, zeigt die LMW-Standards Bereicherung Muster mit den verschiedenen MSC erhalten. Selbst wenn alle Peptide unterhalb der molekularen Cut-off der Chips sind, gibt es eine positive Korrelation zwischen der Porengrößen und das Molekulargewicht der eingefangenen Spezies. Die MSC mit großen Poren, bis zu 9 nm, vorzugsweise ernten größere Peptide, während kleinere Peptide effizienter von den Chips mit kleineren Poren gewonnen werden. Die strukturelle Umwandlung des mesoporösen Anordnung wurde durch das Einstellen der Konzentration des Matrix-Polymer durchgeführt. Eine Erhöhung der Konzentration des Matrix-Polymer zu einer verringerten Grenzflächenkrümmung zwischen den Phasendes Wassers, des Copolymers und des Silicats, damit die Einleitung des miteinander Übergang von einer sphärischen, um eine zylindrische Struktur. Pluronic F127, mit hohem Molekulargewicht, besitzt diese hohe strukturelle Periodizität. Durch Erhöhung der Konzentration von F127 in Ausgangslösung, können verschiedene MPS Dünnfilm periodischen Nanostrukturen aus 3D Nanostruktur 2D Nanostruktur erhalten werden. Die 3D-kubischen und hexagonalen Waben-Nanostrukturen, die über mehr wünschenswert Nanopore Interkonnektivität und leichter zugänglich Nanopore Morphologie, weisen eine überlegene Leistung in selektiven Anreicherung von LMW-Peptide als die 2D-hexagonalen Struktur, auch wenn sie ähnlich Porengrößenverteilungen und den gleichen molekularen Cut-off für Serum teilen Fraktionierung (Abbildung 4). Wir hat außerdem die Konjugation von Organo-Silan auf MPS-Chips durch Einleiten von Sauerstoff Plasmaveraschen, um den Chip Oberfläche vorzubehandeln. Um qualitativ studieren die elektrostatische Wirkung auf ausgewähltenIVE-on-Chip-Anreicherung, nutzen wir die Mischung von Proteinen und Peptiden. MS-Analyse des Proteom-Standards Lösung fraktioniert MPS-Chips mit L121 hergestellt und konjugiert mit der chemischen funktionellen Gruppen ist in 5 dargestellt. Die positiv geladenen und negativ geladenen die Peptide und LMW Proteine ​​wurden auf der anionischen und kationischen Chips erfasst sind. Der quantitative Vergleich von mehreren MPS-Chips bei der Wiederherstellung der Peptide mit positiver Nettoladung ist in Abbildung 5a dargestellt. Die Chips mit negativer Ladung und die Chips ohne Modifikation (mit einer leichten negativen Ladung ursprünglich) eine deutlich höhere Anreicherung für diese Peptide als die Chips mit APTES (-NH 2) modifiziert. Umgekehrt besitzen die positiv geladenen MPS-Chips außergewöhnliche Fähigkeit, diese Peptide mit negativer Nettoladung zu erholen, wie in 5b gezeigt. Während α-Endorphin zeigt keine signifikante Änderung due ihre PI etwa 6. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzip der MPS-Chips Fraktionierung und LMW Bereicherung. Nach Probenauftragsspitze auf der Oberfläche, sind LMW Proteinen und Peptiden in die Poren eingeschlossen, während die größeren Arten blieben außerhalb der Poren und werden während der Waschschritte entfernt. Die angereicherten Fraktionen werden dann eluiert und durch MALDI. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Abbildung 2. Peptid-Anreicherung mit Hilfe der mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnfilm-Chips. MALDI-MS-Profile sowohl die geringe Masse (900 bis 10 000 Da) und der hohen Masse Bereich (3000 bis 70 000 Da) vor (a, b) und nach (c, d) Serum-Verarbeitung auf der mesoporösen Siliciumdioxid-Schichten ( L121, 6 nm). Die molekulare Erholung wird deutlich reduziert, wenn Sie leere porösen Silica-Oberflächen (e, f). <img alt="Abbildung 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Molekulare Cut-off-und größenabhängige Bereicherung des MPS-Chips. (A) Vergrößerte Ansicht des MALDI-Spektren zeigen die charakteristischen molekularen Cut-off von je MPS-Chips in Korrelation zu der Porengröße. (B) Zwei-Wege-hierarchisches Clustern der Peptidgemisch Funktionen zwischen den verschiedenen Chips. Die Intensität der roten oder gelben Farbe zeigt die relative Peptidkonzentration. Größere Poren erhöht die Ernte von größeren Peptiden (3600 bis 8500 Da), während die kleinen Peptiden (900 bis 3500 Da) wurden vorzugsweise von den Chips mit kleineren Poren gewonnen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Abbildung 4. Physikalische Charakterisierung von dünnen Filmen und MPS selektive Gewinnung mit verschiedenen Nanostrukturen. XRD-Muster (a, b, c), TEM (Einschub a, b, c), Pluronic F127 bei verschiedenen Konzentrationen in der Vorläuferlösung: 4,0 ×10 -3 M (a), 6,0 × 10 -3 M (b) und 8,0 × 10 -2 M (c). (D) Balkenanzeige für die Intensität der Erkennung, welche die selektive Peptide Erholung auf 3D kubischen und hexagonalen 3D-F127 Proteom-Chips (Cub und Hex, jeweils). Die unterschiedlichen strukturellen Modifikationen stellen eine selektive Anreicherung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Abbildung 5. Charge-spezifische Erholung für die Chips mit unterschiedlichen Oberflächen-Funktionen. Balkendiagramm der MS Intensität Nachweis von selektiv erfasst Peptide auf den funktionalisierten Chips. Nach ihren isoelektrischen Punkt sind die Peptide positiv oder negativ bei pH 7,0 berechnet. (A) Positive Peptide ((1) des-Arg1-Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) Substanz P-amid, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) sind speziell auf dem negativ geladenen sur angereichertGesichter. (B) Negativ Peptide ((7) Glu1-Fibrinopeptid B, (8) α-Endorphin, (9) ACTH (18-39), (10) Insulin, (11) EGF (12) Insulin-like FGII) sind speziell auf den positiv geladenen Oberflächen angereichert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Abbildung 6. On-Chip Stabilisierung der fraktionierten Serum. (A) Repräsentative MALDI Profile von LMW-Peptide und Proteine ​​eluiert unmittelbar nach der Serum-Fraktionierung (oben) oder nach 3 wk von On-Chip-Lagerung bei Raumtemperatur (unten). (B) Von oben nach unten: lineare Regressionsanalyse der mittleren Intensitäten der detektierten MS-Peaks in jeder Wiederholung im Vergleich zu 1 für frisch fraktionierten Serum und fraktionierte Serum nach 3WK MPS-Chips Lagerung bei Raumtemperatur zu replizieren. Die Gleichung, Lebenslauf und Bestimmtheitsmaß (R 2) sind angegeben.

<ol><li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li>
<li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+early+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li>
<li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li>
<li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+written+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+old%2C+old+fashioned%2C+but+it+still+climbs+up+the+mountains%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li>
<li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Beweise mehren sich, dass die niedermolekularen Bereich des Kreislaufsystems Proteom eine reiche Quelle von diagnostischen Biomarkern für die Früherkennung von Krankheiten ist. Bei dieser Technologie stellten wir eine Reihe von mesoporösen Siliciumdioxid-Chips mit unterschiedlichen Porengrößen, Porenstrukturen und Modifikationen an Peptiden und selektiv zu bereichern Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht. Um die Stabilität von Proteinen zu untersuchen, wurden die MPS-Chips mit humanem Serum, nach dem Waschen getrocknet inkubiert und gelagert 3WK bei Raumtemperatur. Die Protein / Peptid-Muster erhalten wurden, waren vergleichbar mit denen von frisch fraktioniert Serum (6a), wie durch die Ergebnisse der statistischen Analyse zeigte in 6b bestätigt. Die Variabilität der Peak-Signale durch die durchschnittliche CV gemessen wurde bei 12,7% für Rohserum und bei 14,2% für den fraktionierten Proben geschätzt. Die Rn Variationen könnten darauf zurückzuführen sein, interne Variabilität des MALDI Instrument und schlug vor, dass die on-Chip-Vorbehandlung und Lagerung induziert keine signifikante Veränderung der MS Proteinprofile. Das gleiche Experiment wurde auf nicht porösem Silizium durchgeführt. Das getrocknete Serum nach der Lagerung auf Silizium-Oberfläche wiederhergestellt wurde fraktioniert auf den MPS-Chips vor MALDI-Analyse. Der arme MS Profils erhalten die Stabilisierung Vorteil der mesoporösen Oberfläche demonstriert. In Analogie mit zuvor postulierten Mechanismen, stellen wir die Hypothese, dass die LMW-Spezies in den Nanoporen gefangen vor dem Abbau wurden durch den Ausschluss von Proteasen Größe erhalten, oder durch sterische Hemmung ihrer proteolytischen Aktivität in dem engen Raum der Nanoporen. Die MPS-Chip basierende Methode könnte ein mächtiges Werkzeug in der Peptid-und LMW-Protein-Profiling von komplexen biologischen Flüssigkeiten Studie sein. Die MPS-Chips sind kostengünstig herzustellen und skaliert die Produktion ermöglichen die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben zu erreichen, bietet vorteilhafte Merkmale für die Versuchsfischerei Screening und BioMarker Entdeckung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Tetraethoxysilan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Spin Coater </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson März </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Spektralellipsometer </td><td> JA Woollam Co. </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> C8982 </td><td> Matrix für die MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxyZimtsäure </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> 85429 </td><td> Matrix für die MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Rühren Sie heißen Platte </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11 bis 475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell chambered Deckglas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 mm Durchmesser. × 1 mm Tiefe, 3-10 ul, steril </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO-PPO-106-70-PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO-PEO-70 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20 PPO 20 PEO 70 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Physikalisch-chemische Eigenschaften und konzipiert Konzentrationen (Molekulargewicht und Iso-Elektrischen Punkt) der ausgewählten Peptid und Protein-Standards.

niedermolekulare protein enrichment auf mesoporösem siliciumdioxid dünnschichten für biomarker discovery

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Die Identifizierung von zirkulierenden Biomarkern ein großes Potenzial für die nicht invasive Ansätze bei der frühen Diagnose und Prognose sowie zur Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit. 1-3 Das zirkulierende niedrigem Molekulargewicht Proteoms (LMWP) von kleinen Proteinen, die aus Geweben und Zellen abgestoßen oder zusammengesetzt Peptidfragmente aus dem proteolytischen Abbau von größeren Proteinen abgeleitet sind, mit den pathologischen Zustand bei Patienten in Verbindung gebracht worden und wahrscheinlich auf den Zustand der Krankheit. 4,5 Trotz dieser mögliche klinische Anwendungen, die Verwendung von Massenspektrometrie (MS) ein Profil des LMWP aus biologischen Flüssigkeiten hat sich als sehr schwierig aufgrund der großen dynamischen Bereich von Protein-und Peptid-Konzentrationen im Serum. 6 Ohne Probe vor der Behandlung, zu verschleiern einige der höchst vorkommenden Proteine ​​die Erkennung von Low-Fülle Spezies im Serum / Plasma. Übliche Proteom-Ansätze, wie zweidimensionale Polyacrylamid-Gel-electrophoresis (2D-PAGE) und Schrotflinte Proteomik Methoden sind arbeitsintensiv, geringer Durchsatz und bieten nur bedingt geeignet für klinische Anwendungen. 9.7 Daher ist eine wirksamere Strategie erforderlich, um LMWP aus Blut zu isolieren und ermöglichen die Hochdurchsatz-Screening von klinischen Proben . Hier präsentieren wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Multi-System-Fraktionierung auf mesoporösen Siliciumdioxid-Chips basieren, um gezielt und bereichern LMWP. 10,11 mesoporösen Silica (MPS) dünne Filme mit einstellbaren Eigenschaften im Nanobereich hergestellt wurden unter Verwendung des Triblockcopolymer Vorlage Weg . Mit Hilfe verschiedener Vorlagen Polymer-und Polymer-Konzentrationen in der Vorläufer-Lösung wurden verschiedene Porengrößenverteilungen, Porenstrukturen, Konnektivität und Oberflächeneigenschaften bestimmt und bewarb sich um selektive Gewinnung von Proteinen mit geringer Masse. Die selektive Analyse der angereicherten Peptide in verschiedenen Unterklassen nach ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften wird deverknüpft, wird die Wirksamkeit der Gewinnung und Nachweis von geringer Menge Arten. In Kombination mit der Massenspektrometrie und statistische Analyse haben wir gezeigt, die Korrelation zwischen den Nanophasen Eigenschaften der mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschichten und der Spezifität und Wirksamkeit von geringer Masse Proteom Ernte. Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen das Potenzial der Nanotechnologie-basierten Technologie, um eine leistungsstarke Alternative zu herkömmlichen Verfahren zur Ernte von LMWP komplexen biologischen Flüssigkeiten bieten. Aufgrund der Fähigkeit, um die Materialeigenschaften zu stimmen, die Fähigkeit zur Low-Cost-Produktion, die Einfachheit und Schnelligkeit der Probenentnahme sowie den stark reduzierten Anforderungen an die Stichprobe für die Analyse, wird dieses neuartige Nanotechnologie wesentlich Einfluss auf das Gebiet der Proteom-Forschung und klinische Biomarker proteomische Beurteilung.

Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Die Identifizierung zirkulierender Biomarker birgt ein großes Potenzial für nicht-invasive Ansätze in der Frühdiagnostik und Prognose sowie für die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Technologie zur gezielten Anreicherung niedermolekularer Proteine und Peptide aus menschlichem Serum auf der Grundlage dünner mesoporöser Silikaschichten zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Chips aus mesoporöser Silikaschicht hergestellt und einer Vorbehandlung mit Sauerstoff-Plasma-Ashing unterzogen werden. Im zweiten Schritt erfolgt eine einfache Vorbehandlung des Serums, gefolgt von der Anreicherung niedermolekularer Proteine und Peptide aus dem Serum mittels On-Chip-Fraktionierung.Nach der Elution der Proteine und Peptide mit niedrigem Molekulargewicht vom Chip werden die Moleküle mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie mit Flugzeitanalyse charakterisiert. Der letzte Schritt besteht in der Nutzung professioneller Software zur Durchführung der Datenanalyse. Letztendlich zeigen die Massenspektren und die Ergebnisse der statistischen Analyse die Spezifität und Wirksamkeit der Gewinnung des Proteoms mit niedrigem Molekulargewicht auf.Der Hauptvorteil dieser Techniken oder bestehender Technologien wie 2D-Gelelektrophorese oder Western Blot liegt in der hohen Fähigkeit, die selten vorkommenden, niedermolekularen Proteine und Peptide im Serum anzureichern, sowie in der hohen Durchsatzleistung, der Zeitersparnis, der geringeren Menge an benötigter Serumprobe und den niedrigen Kosten. Einer der anspruchsvollsten Aspekte dieses Verfahrens ist die Kontrolle der Morphologie der Nanoporennetze, wie beispielsweise die Porengrößenverteilung, die Porenform und die geringe Vernetzung. Denn diese Merkmale bestimmen die Empfindlichkeit und Spezifität des Profilings der Zielblutsignatur.Um die Übung sicherzustellen, zielen wir darauf ab, das Mengenverhältnis der Ausgangsmaterialien sorgfältig zu kontrollieren und die Anleitung genau zu befolgen, um die Beschichtungslösung für den Chip herzustellen. Beginnen Sie mit der Herstellung der hydrolysierten Silicatvorstufe. Mischen Sie 14 Milliliter TEOS mit 17 Millilitern 200-proof-Ethanol, 6,5 Millilitern deionisiertem Wasser und 0,5 Millilitern sechsmolarer Salzsäure unter starkem Rühren.Setzen Sie die starke Rührtätigkeit fort und erhitzen Sie die resultierende Lösung zwei Stunden lang auf 80 Grad Celsius. Bereiten Sie anschließend die Tri-Block-Copolymer-Lösung vor, indem Sie die gewählte Polymerlösung unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur zu 10 Milliliter Ethanol hinzufügen. In dieser Demonstration wird Pluronic F127 verwendet.Vervollständigen Sie die Mischung, indem Sie die Silikatlösung zu diesem Dreiblockcopolymer hinzufügen und zwei Stunden lang kräftig bei Raumtemperatur rühren. Tragen Sie ein Milliliter der resultierenden Beschichtungslösung auf eine vier Zoll große Siliziumwafer mittels Spin-Beschichtung mit einer Geschwindigkeit von 1.500 U/min für 20 Sekunden auf. Erhitzen Sie anschließend die Wafer 12 Stunden lang auf 80 Grad Celsius.Erhöhen Sie dann die Temperatur um ein Grad Celsius pro Minute, bis 425 Grad Celsius erreicht sind, und backen Sie bei dieser Temperatur fünf Stunden lang. Behandeln Sie anschließend die resultierende mesoporöse Silica- oder MPS-Chip-Oberfläche mit Sauerstoff-Plasma-Ätzen. Messen Sie danach die Schichtdicke und Porosität mithilfe eines Oxometers.Unterdessen zu jeder Serumprobe Trifluoressigsäure auf eine Endkonzentration von 0,01 % und Acetonitril auf eine Endkonzentration von 5 % hinzufügen. Anschließend diese Proben über Nacht bei 160 Grad Celsius im Ofen vorbefeuchten und danach 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Tisch-Vortex-Shaker schütteln. Mit Druckluft eventuelle Partikel von der Oberfläche des Chips entfernen. Den Deckglaser mit 100 % Ethanol reinigen und auf die NPS-Chip-Oberfläche legen, um die Probenmulden zu bilden.Drücken Sie den Deckglaser mit einer Pinzette herunter, um eine vollständige Abdichtung mit dem Chip zu gewährleisten. Danach pipettieren Sie 10 µL Serumprobe in jedes Loch. Inkubieren Sie 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, damit die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht in die Poren eindringen können. Nach der Inkubation saugen Sie das Serum aus den Vertiefungen ab und entsorgen es.Danach pipettieren Sie 10 Mikroliter deionisiertes Wasser in jedes Loch, um größere Proteine wegzuspülen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt viermal, wobei Sie jeweils nur ein bis zwei Löcher bearbeiten. Um Verdunstung zu verhindern, geben Sie schnell 5 Mikroliter Elutionspuffer zu jeder Probe hinzu.Pipettieren Sie 30-mal auf und ab, wobei Sie die Pipettenspitze in der Vertiefung bewegen, um gut zu mischen. Nach dem Mischen saugen Sie den gesamten Elutionspuffer auf und geben ihn in ein Mikrozentrifugenröhrchen, bis Sie bereit sind, eine Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation Zeit-of-Flight-Analyse durchzuführen. Geben Sie 0,5 Mikroliter der Probe auf die MALDI-Zielplatte und lassen Sie sie trocknen. Danach pipettieren Sie 0,5 Mikroliter Matrix in 50 % Acetonitril, das 0,1 % TFA enthält, auf die gleiche Stelle und lassen Sie es mit der Probe co-kristallisieren. Anschließend geben Sie 0,5 Mikroliter Kalibrierlösung auf die Kalibrierstelle. Sobald alles getrocknet ist, setzen Sie die Zielplatte in das MALDI-Massenspektrometer ein.Das Gerät sollte in den positiven Reflektor-Modus mit einer Laserintensität von 4, 203.000 Schüssen pro Probe geschaltet werden. Führen Sie zuerst die Analyse mit einem ausgewählten Massenbereich von 800 bis 5.000 Dalton und einer Zielmasse von 2000 Dalton durch. Führen Sie anschließend dieselbe MALDI-TOF-Analyse im linearen Modus durch, ändern Sie jedoch den Massenbereich auf 900 bis 10.000 Dalton oder 3000 bis 70.000 Dalton bei einer Zielmasse von 5.000 Dalton.Nach dem Multi-Top-Analyseprozess die Rohspektren mit der Software zur Umwandlung der Peakliste bearbeiten und anschließend nach SpecAlign exportieren. Mit der Align-Software zur Vorverarbeitung alle Spektren unter Verwendung der Peak-Alignierung mittels schneller Fourier-Transformation oder P-A-F-F-T-Korrelationsmethode ausrichten und die Intensitäten auf den Gesamtionenstrom normalisieren. Die Peakdetektion mit einem Höhenverhältnis von zwei und einem Massenfenster von 0,3 % durchführen.Korrigieren Sie die Basislinie und entfernen Sie die negativen Werte vor der Analyse. Das Importieren von T 2D-Dateien in die Markeransicht ist der erste Schritt für die überwachte Verarbeitung von MALDI-Daten verschiedener Gruppen. Öffnen Sie zunächst die Markeransicht-Software und importieren Sie anschließend die T 2D-Dateien.Wählen Sie den Ordner mit den T 2D-Dateien aus und richten Sie die Parameter für die Spektrenverarbeitung ein. Öffnen Sie anschließend die Probentabelle. Markieren Sie Proben derselben Gruppe und vergeben Sie eine Gruppenbezeichnung.Normalisieren Sie die Proben mithilfe der Gesamtflächensummen. Öffnen Sie dann das Optionenfenster. Legen Sie eine eindeutige Farbe und ein eindeutiges Symbol für jede Gruppe fest.Danach führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse und einen T-Test durch, wobei die aktiven Datensätze anhand der Werte der ersten und zweiten Hauptkomponente (PC1 und PC2) in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Die Biomarker-Kandidaten werden anhand der Ladungsdiagramme der Hauptkomponenten identifiziert, die durch Klicken auf „Plot Profiles“ für ausgewählte Signale die Intensitätsprofile der ausgewählten Biomarker zusammenfassen. Die Punkte mit den höheren Werten können verschiedene Gruppen voneinander unterscheiden.Nach dem Vergleich der Gruppen mit einem T-Test sortieren Sie die Tabelle nach aufsteigenden P-Werten, um die Peaks zu bestimmen, die verschiedene Gruppen unterscheiden können. Gezeigt sind hier die MS-Spektren der Serumprobe für Peptide im Bereich von 900 bis 10.000 Dalton sowie für Proteine im Bereich von 3000 bis 70.000 Dalton. Die Spektren der unbehandelten Proben veranschaulichen die Signalunterdrückung im Bereich niedriger Molekülmasse aufgrund der Anwesenheit gut ionisierter, hochabundanter Proteine hoher Molekülmasse wie Albumin. Nach der Fraktionierung mittels MPS-Dünnschichten wurden die meisten großen Moleküle angereichert, was zu einer signifikanten Anreicherung der Komponenten niedriger Molekülmasse führt. Als Kontrolle wurde dieselbe Serumprobe auf eine nichtporöse reine Silikaoberfläche aufgebracht.Um die Spezifität von MPS-Dünnschichten für die Gewinnung des Proteoms mit niedrigem Molekulargewicht zu bewerten, wurde kein signifikanter Ertrag an Peptiden oder Proteinen aus der nicht porösen Silica erzielt. Daher kann geschlossen werden, dass es die mesoporöse Architektur und nicht die Affinität der Silica-Oberfläche ist, die den hauptsächlichen Faktor bei der Anreicherung von LMWP darstellt. Präzise kontrollierte Variationen der Porengröße können durch den Einsatz von Copolymeren mit unterschiedlichen hydrophoben Blocklängen erreicht werden.Der Einfluss der Porengröße auf die Rückgewinnungseffizienz niedermolekularer Peptide und Proteine wurde anhand von MPS-Dünnschichten untersucht, die aus vier ionischen Tensiden mit unterschiedlichen Volumenverhältnissen der hydrophoben und hydrophilen Bestandteile hergestellt wurden. Hier ist eine vergrößerte Ansicht der MALDI-Spektren dargestellt, die den charakteristischen molekularen Trennbereich jedes MPS-Chips in Korrelation zur Porengröße zeigt. Die Bandbreite der Porengrößen führte zur Rückgewinnung eines unterschiedlichen Repertoires an Peptiden und Proteinen aus derselben Serumprobe durch Größen- und Formausschluss.Dies lässt sich ebenfalls im zweidimensionalen hierarchischen Clustering der Peptidmischungsmerkmale zwischen den verschiedenen Chips beobachten. Die Intensität der roten oder gelben Farbe zeigt die relative Peptidkonzentration an. Größere Poren verbesserten die Gewinnung größerer Peptide, während die kleinen Peptide bevorzugt von den Chips mit kleineren Poren gewonnen wurden.Unterschiedliche periodische Nanostrukturen von MPS-Dünnschichten, die unter Verwendung von hochmolekularen triblockcopolymeren wie beispielsweise F127 mit ähnlichen Porengrößenverteilungen gebildet werden, können durch Anpassung der Polymerzusammensetzung in der Vorläuferlösung erhalten werden. Die 3D-kubischen und honigwabenförmigen hexagonalen Nanostrukturen weisen eine günstigere Vernetzung der Nanoporen sowie eine besser zugängliche Nanoporen-Morphologie auf. Folglich zeigen sie eine überlegene Leistung bei der selektiven Anreicherung von niedermolekularen Peptiden im Vergleich zur 2D-hexagonalen Struktur.Dies gilt, obwohl sie ähnliche Porengrößenverteilungen und dieselbe molekulare Trenngrenze für die Serumfraktionierung aufweisen. Die Konjugation von Organy lane auf MPS-Chips wurde durch die Einführung einer Sauerstoff-Plasma-Ätzung zur Vorbehandlung der Chipoberfläche vereinfacht. Diese Abbildung zeigt die ladungsspezifische Rückgewinnung für Chips mit unterschiedlichen Oberflächenfunktionen anhand eines Balkendiagramms der MS-Intensität beim Nachweis selektiv gebundener Peptide auf funktionalisierten Chips.Je nach ihrem isoelektrischen Punkt sind die Peptide bei pH 7,0 positiv oder negativ geladen, zusätzlich zur Entfernung von Proteinen mit hohem Molekulargewicht. Die Ergebnisse zeigen, dass die strukturelle Gestaltung und die chemische Funktionalisierung der NPS die Spezifität der Peptidanreicherung weiter erhöht haben. Mit dieser Entwicklung.Wir erwarten, dass diese Technik den Weg dafür ebnen wird, dass Forscher im Bereich der Proteomik neuartige Biomarker für die Frühdiagnose oder therapeutische Bewertung im Körperflüssigkeit von menschlichen und tierischen Modellen erforschen können. Dadurch wird eine gezielte personalisierte Behandlung schwerwiegender Erkrankungen ermöglicht.

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