Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zelluläre viskoelastische Eigenschaften unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zu analysieren. Dies wird erreicht, indem ein Unterdruck über eine mit einem Druckaufnehmer verbundene Mikropipette auf die Zellmembran ausgeübt wird, die aus Glas-Kapillaren mittels eines Mikropipettenzuggeräts hergestellt wurde. Die Pipette wird auf einen feinen Mikromanipulator montiert, der sich auf dem Objekttisch eines umgekehrten Mikroskops befindet, und die Pipettenspitze wird in unmittelbare Nähe einer Zelle gebracht.

Danach wird eine Dichtung zwischen der Pipettenspitze und der Zellmembran hergestellt, und die Membrandeformation in die Pipette hinein wird als Reaktion auf einen angelegten Schritt negativen Drucks gemessen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Wirkung verschiedener Behandlungen auf die zellulären biomechanischen Eigenschaften basierend auf dem Ausmaß der Membrandeformation als Reaktion auf eine genau definierte Kraft zeigen. Der Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe liegt darin, die Auswirkungen einer Dyslipidämie auf die biophysikalischen und biomechanischen Eigenschaften vaskulärer endothelialer Zellen zu untersuchen, und wir werden Ihnen heute eine Methode vorstellen, die als Mikropipettenaspiration bezeichnet wird und mit der wir die Zellsteifigkeit messen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur grundlegenden Erforschung der zellulären Biomechanik in mehreren Mechanismen wie Angiogenese, mechanischer Wahrnehmung und Migration und darüber hinaus. Obwohl diese Methode Einblicke in die zelluläre Biomechanik ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme wie Modellmembranen, intrazelluläre Organellen oder Gewebe angewendet werden. Um die Zellmembran sichtbar zu machen und die Membranausstülpung in die Pipette zu beobachten, werden vaskuläre endotheliale Zellmembranen mit einem lipophilen fluoreszierenden Farbstoff gefärbt.

Um zu beginnen, verdünnen Sie den Stammlösungsfarbstoff mit einer erwärmten PBS-Lösung auf eine Arbeitskonzentration und sonizieren Sie die Mischung fünf Minuten lang, um die D-Aggregate aufzubrechen. Nach einem fünfenminütigen Zentrifugationsschritt im Mikrozentrifugenröhrchen entfernen Sie den Überstand und waschen die vaskulären endothelialen Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter PBS hinzufügen. Nach fünf Minuten saugt man die Lösung ab und führt anschließend noch zwei weitere Waschschritte durch.

Anschießend die Dice-Lösung zu den Zellen geben und 30 Minuten lang im 37 Grad Celsius-Brutschrank inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen erneut wie zuvor mit PBS waschen. Mikropipetten werden hergestellt, indem eine Glaskapillare in der Mitte erhitzt und auseinandergezogen wird.

Wenn das Glas zu schmelzen beginnt, werden die beiden Hälften der Kapillare auseinandergezogen, um zwei Mikropipetten zu erzeugen. Die Spitzen der in diesen Experimenten verwendeten Pipetten liegen typischerweise zwischen zwei und sechs Mikrometern. Abhängig von der Größe der Zelle sollte der Außendurchmesser der Form der Spitze einem zylindrischen Rohr ähneln, um die Glaskapillare in den Pipettenzieher einzuführen.

In dieser Demonstration wird der horizontale Pipettenzieher Suter P 97 mit einem optimierten Programm verwendet. Dieser Zieher bietet mehrere programmierbare Optionen, um die Geschwindigkeit und andere Parameter des Ziehvorgangs zu variieren. Fahren Sie fort, um das Ziehprogramm zu aktivieren.

Nachdem jede Mikropipette gezogen wurde, überprüfen Sie die Form der Spitze unter dem Mikroskop. Nach dem Glühen der Spitze füllen Sie die Mikropipette mit einer physiologischen Salzlösung wie PBS oder einem nicht fluoreszierenden Wachstumsmedium. Wichtig ist, dass die Lösung um 30 % Serum ergänzt wird, damit die Zellmembran reibungslos in die Pipette gleiten kann. In dieser Demonstration wird ein invertiertes fluoreszierendes Mikroskop mit 3D-Entfaltungsfunktion verwendet, das an eine an einen Computer angeschlossene Videokamera, einen Drucksensor, eine vibrationsfreie Station und einen Mikromanipulator angeschlossen ist, um mit der Montage der Zellen in eine Mikroaspirationskammer zu beginnen, indem die Zellen von ihrem Substrat angehoben und in eine flache, longitudinale Kammer überführt werden, die auf dem invertierten fluoreszierenden Mikroskop befestigt ist.

Der Grund für die Verwendung einer flachen longitudinalen Kammer besteht darin, einem Mikropipettierer die Annäherung an die Zellen in einem sehr flachen Winkel, der so nahe wie möglich an horizontal liegt, zu ermöglichen. Dies geschieht, um die in die Mikropipette gezogene Membran in einer einzigen Fokusebene visualisieren zu können. Setzen Sie eine gefüllte Mikropipette in einen Pipettenhalter ein, der über eine flexible Schlauchverbindung mit einem Leistungstransducer verbunden ist, wobei der Durchmesser so angepasst ist, dass er passgenau auf den Anschluss des Pipettenhalters passt.

Zu Beginn jedes Experiments wird der Druck in der Pipette mit dem atmosphärischen Druck ausgeglichen; montieren Sie die Pipette auf einen Mikromanipulator, der eine feine Steuerung der Pipettenbewegungen im Mikrometerbereich ermöglicht. Positionieren Sie die Pipette in einem flachen Winkel zum Boden der Kammer und bringen Sie die Pipettenspitze in die Mitte des Sichtfeldes. Der Schaft der Pipette, also der zylindrische Teil der Pipettenspitze, in den die Membran aspiriert wird, sollte horizontal zur Fokusebene ausgerichtet sein.

Um diese erste Position zu erreichen, halten Sie die Pipette in einem möglichst flachen Winkel und biegen Sie dann den Schaft der Pipette gegen den Boden der Kammer. Da der Schaft sehr dünn ist, besitzt er genügend Flexibilität, um entlang des Kamerabodens zu gleiten, während er sich einer Zelle nähert. Senken Sie die Mikropipette langsam mithilfe des Grobmanipulators an die Seite einer einzelnen Zelle herab, bis sie sich in der Nähe der Fokusebene der Zelle befindet.

Danach mit dem Feinmanipulator die Mikropipette an den Zellrand bewegen, bis die Pipettenspitze sanft die Membran berührt. Ein Bild aufnehmen, um die Position der Pipette zu überprüfen. Gute Versiegelungen entstehen, wenn die gesamte Pipettenspitze vollständig mit der Zelloberfläche in Kontakt steht und der Kontakt stabil ist.

Als Nächstes wird mithilfe des Wandlerelements ein Schritt mit Unterdruck angewendet und so lange aufrechterhalten, bis die Membranausstülpung stabilisiert ist. Die Menge an Druck, die erforderlich ist, um die Membran in die Pipette hinein zu aspirieren, variiert je nach Zelltyp und spezifischen experimentellen Bedingungen. Eine erste Deformation wird typischerweise beobachtet, wenn ein Druck im Bereich von minus zwei bis minus 15 Millimeter Quecksilbersäule angewendet wird.

Wenn der Druck aufgebracht wird, verformt sich die Membran allmählich in die Pipette hinein, bis sie bei einer bestimmten Länge stabilisiert ist. Dieser Vorgang dauert typischerweise zwei bis drei Minuten; in diesem Zeitraum sind alle 30 Sekunden Bilder der Membranverformung erforderlich, um den Fortschritt der in die Pipette gezogenen Membran zu verfolgen. Schließlich erhöhen Sie den Druck in Schritten von zwei bis fünf Millimeter Quecksilbersäule auf das nächste Niveau.

Wiederholen Sie den gesamten Vorgang, bis sich die Membranausstülpung von der Zelle löst und in die Pipette bewegt; zu diesem Zeitpunkt wird das Experiment beendet. Um den Grad der Membranverformung zu quantifizieren, wird die aspirierte Länge von der Spitze der Pipette bis zum Scheitelpunkt des Umfangs der Membranausstülpung gemessen. Eine größere Pipette erzeugt bei gleichem Druckniveau eine größere Kraft auf die Zellmembran, um die Variabilität zwischen den Durchmessern der Pipetten zu berücksichtigen.

Die aspirierte Länge wird auf den für jedes Experiment gemessenen Pipettendurchmesser normiert, um die Anwendung der Mikroaspirationstechnik für an das Substrat angeheftete Zellen zu validieren. Es wurde getestet, dass eine Störung des F-Aktins zu einer Abnahme der Zellsteifigkeit boviner aortaler Endothelzellen führt, wie mit dieser Methode abgeschätzt. Hier ist eine typische Serie fluoreszierender Bilder eines Endothelmembrans dargestellt, das sich schrittweise aufgrund eines durch eine Mikropipette aufgebrachten Unterdrucks verformt, wie erwartet. Die Membran wird allmählich in die Pipette hinein aspi­riert, und die aspirierte Länge nimmt als Funktion des angelegten Drucks zu. Zeitverläufe der Deformation zeigen, dass die Störung von F-Aktin die aspirierten Längen der Ausstülpungen unter allen Druckbedingungen signifikant erhöht.

Mithilfe dieses Ansatzes wurde entdeckt, dass die Zellsteifigkeit zunimmt, wenn zelluläre Membranen von Cholesterin entleert werden, während eine Anreicherung mit Cholesterin keine Wirkung zeigte. Hier sind eine cholesterinangereicherte Zelle, eine Kontrollzelle und eine cholesterinarme Zelle dargestellt, nachdem maximale Aspirationslängen von minus 15 Millimeter Quecksilbersäule erreicht wurden. Die Ausstülpungen entwickelten sich typischerweise bei minus 10 Millimeter Quecksilbersäule, und die zeitlichen Verläufe der Membrandeformation konnten für die negativen Drücke von 10, 15 und 20 Millimeter Quecksilbersäule gemessen werden.

Hier werden die maximalen aspirierten Längen in Abhängigkeit vom applizierten Druck dargestellt. Die maximale normalisierte Länge in depletierten Zellen war bei Drücken von minus 15 Millimeter Quecksilber und minus 20 Millimeter Quecksilber signifikant niedriger als die von Kontrollzellen. Die Applikation negativer Drücke über 25 Millimeter Quecksilber führte zur Ablösung des aspirierten Fortsatzes, wodurch ein separates Sle entstand.

Das Druckniveau, das zur Ablösung der Membran führte, war unter verschiedenen Cholesterinbedingungen ähnlich und eine unerwartete Beobachtung. Wie frühere Studien zeigen, erhöht ein Anstieg des Membrancholesterins die Steifigkeit der membranären Lipiddoppelschicht. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig zu beachten, dass das Experiment an einzelnen Zellen durchgeführt wird.

Daher sollten drei bis fünf Zellen pro Bedingung und Experiment analysiert werden, insgesamt über drei Experimente hinweg.