Name: In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Erfahren Sie, wie ein In-vitro-Assay mit fluoreszenzmarkierten Eierstockkrebs-Sphäroiden und Mesothelzell-Monolagen die frühen Schritte der Metastasierung modelliert. Zeitlupenmikroskopie ermöglicht quantitative Analyse.

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Wir möchten das Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School, speziell Jennifer Waters, Lara und Wendy Petrak Lachs, für die Ausbildung und den Einsatz ihrer Zeitraffer Mikroskope danken. Wir möchten auch an Rosa Ng und Achim Besser für wertvolle Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Grant 5695837 (an M. Iwanicki) und GM064346 zu GKI unterstützt; durch einen Zuschuss von Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (bis GKI).

1. Eierstockkrebszelllinien Spheroid Formation <ol><li> RFP-exprimierenden Eierstockkrebs Zellen werden in 10% Base-Medium (ein benutzerdefiniertes Zellkulturmedium, das ein 50:50-Gemisch von 199 und MCDB105, 10% fötales Rinderserum und 1% Pen-Strep) kultiviert. Um RFP in unmarkierten Eierstockkrebs zu exprimieren, zu transfizieren der Zellen mit einem Plasmid, das RFP und wählen für Zellen RFP. Alternativ können virale Vektoren verwendet werden, um transient exprimieren fluoreszierende Proteine, oder Zellen können vor inkubieren mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff Zelle Tracker-Farbstoff (Invitrogen). </li><li> Vor der Bildung von Eierstockkrebs Sphäroide, ist es notwendig, mit geringer Haftung 96 Well Rundboden Kulturschalen vorbereitet. Um die geringer Haftung Kultur Herstellung von Platten und 30μl Poly-HEMA (6 mg Polyhydroxyethylmethacrylat in 1 ml 95% EtOH)-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well Corning Zellkulturschale zugegeben. Die 96-Well-Platten werden in einem 37 ° C nicht-befeuchteten Inkubator, um das Ethanol, l verdunsten inkubierteaving eine Folie aus Poly-HEMA auf jeder Vertiefung. Diese Poly-HEMA-Film verhindert, dass Zellen Befestigung am Boden der Vertiefung und zwingt die Zellen in Suspension 18 wachsen. [Alternativ kann Ultra-Low Befestigung Kultur-Platten (Corning) anstelle von Poly-HEMA beschichteten Schalen verwendet werden.] </li><li> Nach dem niedrigen Kraftschlußbeiwert Kultur-Platten hergestellt werden, trypsinieren einen Teller mit Eierstockkrebs Zellen, Pellet die Zellen in einer Tischzentrifuge (Heraeus) bei 900 RCF für 3 Minuten, den Überstand aspirieren und in 10% Basismedium erneut zu suspendieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Die Konzentration der Zellen, so dass es 100 Zellen pro 50 ul von 10% Base-Medium. </li><li> In 50 ul der gleichmäßig suspendiert verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well Poly-HEMA beschichteten Kulturschale. </li><li> Inkubieren der Platte mit 96 Vertiefungen bei 37 ° C Zellkulturbrutschrank für 16 Stunden (der Betrag der Zeit zu erhöhen oder abhängig von der Menge an Zeit, die verringert werdeneine bestimmte Zelllinie zu mehrzelligen Sphäroiden oder gewünschten experimentellen Bedingungen) bilden, um die Eierstockkrebszellen zu Cluster zusammen zu ermöglichen, wobei ein einzelner vielzelligen Sphäroid in jede Vertiefung. Einige Tumorzellen Apoptose während dieser Zeit unterziehen, so ist es wichtig, eine Zeit vor der Induktion der Apoptose zu wählen. </li></ol> 2. Mesothelzelle Monoschichtbildung <ol><li> In einer Zellkultur Haube vor die Vertiefungen von einer 6-Well-Glasboden MatTek Schale mit Fibronectin durch Zugabe von 2 ml einer 5μg Fibronectin / ml PBS-Lösung in jede Vertiefung der Schale und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die optische Qualität der Glas-Böden in MatTek Gerichte erlauben hochauflösende mikroskopische Bildgebung. </li><li> GFP-exprimierende Mesothelzellen werden in 10% Base-Medium kultiviert. Trypsinieren eine Platte von Mesothelzellen, Spin-down in einer Tischzentrifuge (Heraeus) bei 900 UPM für 3 Minuten, den Überstand aspirieren, und in 10% Basismedium erneut zu suspendieren. DieMesothelzellen welche hier bereits die GFP exprimieren, wenn sie stammen, aber nicht markiertem Mesothelzellen können durch Transfektion mit einem Plasmid, das GFP-cDNA oder Vorinkubation der Zellen in einem grün fluoreszierenden Zellen-Tracker-Farbstoff (Invitrogen) hergestellt werden. </li><li> Nach dem 30-minütigen Inkubation Fibronektin (in Schritt 2.1), waschen Sie die Vertiefungen der MatTek Schüssel mit 2 ml PBS. </li><li> Absaugen des PBS und Platte 6 x 10 5 Mesothelzelle pro Vertiefung in jede Vertiefung der 6-Well-MatTek Schale. Inkubieren MatTek Schale in einem 37 ° C Zellkultur Inkubator über Nacht, damit die Mesothelzellen auf der Schale an und bilden eine Monoschicht. </li></ol> 3. Mesothelzelle Abstand Assay <ol><li> Verwenden Sie eine Pipette, die Eierstockkrebs Sphäroiden aus dem 96-Loch-Poly-HEMA beschichteten Platte zu sammeln. </li><li> Saugen Sie das Medium aus einem Brunnen der 6 gut MatTek Schale mit Mesothelzellen Zellmonolayer. Waschen Sie einmal mit 2 ml PBS. In all der Sphäroide aus dem 96-Loch-pspät, um eine Vertiefung der MatTek Schale (~ 3x die Anzahl von Kugeln, die er zu machen Sphäroide Landung ist für den Teil der Schale, die nicht abgebildet werden kann abgebildet werden). </li><li> Setzen Sie den MatTek Schüssel auf der Bühne eines umgekehrten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop ausführen kann Zeitraffer-Bildgebung für die Dauer von mindestens 8 Stunden. Verwenden Sie einen motorisierten Tisch zu Bild mehrere Positionen in der Schale, mit mehreren Sphäroid Interkalation Veranstaltungen, in einem einzigen Experiment. Wir verwenden eine Nikon Ti-E umgekehrt Motorisierte Weitfeld-Fluoreszenz Zeitraffer-Mikroskop mit integriertem Perfect Focus System und Low [20x-0.75 numerischen Apertur (NA)] Vergrößerung / NA Differential Interferenz Kontrast (DIC)-Optik, eine Nikon Halogen-Transilluminator mit 0,52 NA großem Arbeitsabstand (LWD) Kondensator, Nikon schnelle (&lt;100-Millisekunden Schaltzeit) Anregungs-und Emissions-Filter (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter schnell übertragen und Epifluoreszenz Lichtweg Smart-Absperrter, eine Nikon linear-kodierte motorisiertem Tisch, ein Hamamatsu ORCA-AG gekühlt Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera, ein custom-built Mikroskop Inkubationskammer mit Temperatur und CO 2-Steuerung, Nikon NIS-Elements AR-Software Version 3, und ein TMC Schwingungsisolation Tisch. </li><li> Die Eierstockkrebszelllinien Sphäroide wird an der Unterseite der Schale absetzen und heften sich an die Mesothelzellen Zellmonolayer. Sammle GFP, RFP und Bilder von Phase 20 + Sphäroid / Monoschicht Interaktionen, alle 10 Minuten, für 8 Stunden. </li><li> Die RFP-exprimierenden Ovarialkarzinomzellen Sphäroide wird in die GFP-exprimierenden Mesothelzelle Monoschicht ein Loch in der Monoschicht einzudringen. Nach 8 Stunden Messung der Größe der Löcher, indem es die schwarzen Löcher in den GFP-Bild mit Elements Software (oder eine andere geeignete Software wie Bild J). Normalisieren der Lochgröße auf die ursprüngliche Größe Sphäroid durch Dividieren der Lochgröße zu 8 Stunden nach der Größe des Sphäroids in der entsprechenden RFP Bild zum Zeitpunkt Null. In diesem ehemaligenreichlich, wurde das Loch Größe nur einmal gemessen, sondern es kann mehrere Male während der 8 Stunden Experiment gemessen werden zum besseren Verständnis der Dynamik der Einlagerung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse In diesem Beispiel, verglichen wir die Fähigkeit von Mesothelzellen Abstand OVCA433 Ovarialkarzinomzellen Sphäroide, die gedämpft Expression von Talin-1 bis OVCA433 Sphäroide zu kontrollieren. OVCA433 Sphäroide aus jeder Gruppe wurden in einen MatTek Schale mit ZT Mesothelzelle Monoschichten zugegeben. Sechs Sphäroide aus jeder Gruppe wurden alle 10 Minuten für 8 Stunden (Abbildung 4, Movie 3, Movie 4) abgebildet. Die Löcher in der Monoschicht durch den sich ausbreitenden kugeln wurden gemessen und sechs Positionen aus jeder Gruppe wurden gemittelt. 4 zeigt, dass die durchschnittliche Fläche der lichten Weite von Talin 1 Zuschlag Sphäroide erzeugt wesentlich kleiner als die durchschnittliche Fläche durch Steuerung Sphäroide geschaffen wurde, was darauf hindeutet, dass Talin für Mesothelzellen Clearance durch O erforderlichVCA433 Eierstockkrebs Sphäroide. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eierstockkrebs Metastasen. Primäre Tumoren der Eierstöcke entwickeln sich entweder aus dem Eierstock Oberflächenepithel oder Eileiter. Tumorzellen / Cluster brechen aus dem Primärtumor und sammeln sich in der Bauchhöhle. Tumorzellen können dann aggregieren, um mehrzellige Sphäroide zu bilden. Sphäroide dann auf die Mesothelzellen Zellmonolayern Auskleidung der Bauchhöhle zu befestigen. Die Mesothelzellen von unterhalb des beigefügten Eierstockkrebs Sphäroids ausgeschlossen, so dass die Kügelchen den Zugriff auf die zugrunde liegende Basalmembran zu gewinnen. Movie 1. Eierstockkrebs Metastasen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">Hier klicken, um Film anzusehen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> Abbildung 2. </strong&gt; Mesothelzellen Linie die Oberfläche der menschlichen Peritoneum und von unterhalb Ovarialkarzinomzellen Implantate ausgeschlossen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> Abbildung 3. Mesothelzellen Abstand Assay. Eierstockkrebs Sphäroide durch Inkubation von 100 ausgebildet RFP-exprimierenden Eierstockkrebs Zellen pro Vertiefung in einem Poly-HEMA beschichteten 96-Well-Rundboden Kulturschale bei 37 ° C für 16 Stunden. Poly-HEMA verhindert, dass die Zellen aus Befestigung an der Kulturschale, so dass die Zellen in Suspension verbleiben und aneinander haften, um einen Cluster pro Vertiefung zu bilden. Mesothelzellen Zellmonoschichten werden durch Beschichten 6x10 5 Mesothelzellen pro Well in einer 6-Well-Fibronectin beschichteten MatTek Schale und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 16 Stunden hergestellt. Die Sphäroide werden dann an den MatTek Schale mit Mesothelzellen Monoschicht übertragen und die beiden Zellpopulationen werden alle 10 Minuten für 8 Stunden unter Verwendung eines Nikon Ti-E I abgebildetnverted Motorisierte Weitfeld-Fluoreszenz Zeitraffer-Mikroskop und Software-Elemente. Movie 2. Mesothelzellen Abstand Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">Hier klicken, um Film anzusehen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> Abbildung 4. Dämpfung von Talin-1-Expression in OVCA433 Sphäroide sinkt Mesothelzellen Clearance Fähigkeit. OVCA433 Sphäroide (rot) mit und ohne abgeschwächte Expression von Talin-1 durften zu befestigen und dringen in eine ZT Mesothelzellen Monolayer (grün). Die beiden Zellpopulationen wurden alle 10 Minuten für 8 Stunden mit einer Nikon Ti-E umgekehrt Motorisierte Weitfeld-Fluoreszenz Zeitraffer-Mikroskop und Software-Elemente abgebildet. Die Grafik zeigt, dass Talin 1 Dämpfungsignifikant abnimmt Mesothelzelle Clearance (Quantil-Plot mit grünen Balken an der Mittel). Movie 3. Kontrolle OVCA433 Sphäroide (rot) in eine Invasion Mesothelzellen Monolayer (grün). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">Hier klicken, um Film anzusehen</a> . Movie 4. Dämpfung von Talin-1-Expression in OVCA433 Sphäroide (rot) nimmt Mesothelzellen (grün)-Clearance Fähigkeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> .

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Der &quot;Ausverkauf Mesothelzellen Assay&quot; präsentiert hier verwendet Zeitraffer-Mikroskopie, um die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzellen Zellmonolayern überwachen, in der großen räumlichen und zeitlichen Detail. Zuvor hatten mehrere Gruppen 8-14 Endpunkt-Assays verwendet werden, um zu zeigen, dass Eierstock-Krebszellen zu befestigen und dringen in Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Assay ist einzigartig, da sie verwendet fluoreszenzmarkierten Zellen Tumorzellen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> OVCA433 Eierstockkrebszellen </td><td></td><td></td><td> Geschenk von Dr. Dennis Slamon </td></tr><tr><td> ZT Mesothelzellen </td><td></td><td></td><td> Geschenk von Dr. Tan Ince </td></tr><tr><td> Medium 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Cell-Anwendungen Inc. </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS-hitzeinaktiviertem </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Platten mit 96 Vertiefungen </td><td> Corning Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 192066-25G </td><td> Für Poly-HEMA-Lösung aufzulösen 6 mg Poly-HEMA-Pulver in 1 ml 95% EtOH </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> Verdünnen Sie bis 95% in dH 2 0 </td></tr><tr><td> Zellkultur Haube </td><td> NuAire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkultur-Inkubator </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator für Poly-HEMA-Platten </td><td> Labline Instruments </td><td> Kaiserliche III 305 </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 gut Glasboden-Schüssel </td><td> MatTek corp. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma </td><td> F1141-1MG </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Zeitraffer-Mikroskop: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Ti-E Inverted Motorisierte Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskop mit integriertem Perfect Focus System </td></tr><tr><td> Objektiv </td><td> Nikon </td><td></td><td> 20X-0.75 numerische apeture </td></tr><tr><td> Halogen-Transilluminator </td><td> Nikon </td><td></td><td> 0,52 NA Kondensor für langen Arbeitsabstand </td></tr><tr><td> Anregungs-und Emissionsfilter </td><td> Chroma Single-Pass-Filter in Nikon-Gehäuse </td><td></td><td> GFP-Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> Übertragen und Epifluoresce Lichtweg </td><td> Sutter </td&gt; <td></td><td> Smart-Fensterläden </td></tr><tr><td> Linear-kodierte Motortisch </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gekühlte Charged-Coupled Device-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Inkubationskammer mit Temperatur und CO 2-Steuerung </td><td> custom-built </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schwingungsisolierung Tisch </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements-Software </td><td> Nikon </td><td></td><td> Version 3 </td></tr></tbody></table>

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In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Eierstockkrebs ist die fünfte führende Ursache von Krebs verursachten Todesfälle in den Vereinigten Staaten ein. Trotz eines positiven ersten Reaktion auf Therapien, entwickeln 70 bis 90 Prozent der Frauen mit Eierstockkrebs neue Metastasen, und die Rezidivrate ist oft tödlich 2. Es ist daher notwendig, zu verstehen, wie sekundäre Metastasen entstehen, um bessere Behandlungen für Zwischen-und Spätstadium Eierstockkrebs entwickeln. Ovarialkarzinom Metastasen tritt auf, wenn bösartige Zellen aus dem Primärtumor Ort lösen und zu verbreiten, in der gesamten Bauchhöhle. Die disseminierten Zellen können vielzelligen Cluster oder Sphäroide, die entweder ungebunden bleiben wird, oder das Implantat auf Organe in der Bauchhöhle 3 (Abbildung 1, Movie 1) zu bilden. Alle Organe in der Bauchhöhle mit einem einzigen, kontinuierlichen, Schicht von Mesothelzellen 4-6 (2) ausgekleidet ist. Allerdings sind Mesothelzellen abwesend von untenPeritoneal Tumormassen, wie durch eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Studien ausgeschnitten humanem Tumorgewebe Abschnitten 3,5-7 (2) offenbart. Dies deutet darauf hin, dass Mesothelzellen von der Unterseite der Tumormasse sind von einem unbekannten Prozess ausgeschlossen. Zurück in vitro Experimente zeigten, dass primäre Ovarialkarzinom Zellen effizienter zu befestigen extrazellulären Matrix, als Mesothelzellen 8, und neuere Studien zeigten, dass die primäre peritoneale Mesothelzellen tatsächlich eine Barriere für Eierstockkrebs Zelladhäsion und Invasion (im Gegensatz zu Adhäsion und Invasion im Vergleich auf Substraten, die nicht mit Mesothelzellen bedeckt waren) 9,10. Dies würde darauf hindeuten, dass Mesothelzellen als Barriere gegen Eierstock-Krebs Metastasen handeln. Die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die Eierstockkrebszellen diese Barriere zu durchbrechen, und schließt die Mesothel haben bis vor kurzem unbekannt geblieben. Hier beschreiben wir the-Methodik für ein in-vitro-Test, dass die Modelle der Wechselwirkung zwischen Eierstockkrebszelllinien Sphäroide und Mesothelzellen in vivo (Abbildung 3, Movie 2). Unser Protokoll wurde von bisher beschriebenen Methoden zur Analyse Eierstocktumorzelllinien Interaktionen mit Mesothelzellen Monoschichten 16.8 angepasst, und wurde zum ersten Mal in einem Bericht zeigt, dass Eierstocktumorzellen verwenden einen Integrin-abhängige Aktivierung von Myosin und Zugkraft auf den Ausschluss von der Förderung beschrieben Mesothelzellen von unter einem Tumor Sphäroid 17. Dieses Modell nutzt die Vorteile der Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, die beiden Zellpopulationen in Echtzeit zu überwachen und bietet räumliche und zeitliche Informationen über die Wechselwirkung. Die Eierstockkrebs exprimieren rot fluoreszierendes Protein (RFP), während die Mesothelzellen grün fluoreszierendes Protein (GFP). RFP-exprimierenden Eierstockkrebszelllinien Sphäroiden auf die GFP-exprimierenden Mesothelzellen Monoschicht zu befestigen. Die Sphäroide Verbreitung, einzudringen, undzwingen die Mesothelzellen beiseite schaffen ein Loch in der Monoschicht. Dieses Loch wird visualisiert als der negative Raum (schwarz) in der GFP-Bild. Die Fläche des Loches kann dann gemessen werden, um quantitativ die Unterschiede hinsichtlich des Clearance-Aktivität zwischen der Kontrolle und Populationen von Eierstockkrebs und / oder Mesothelzellen werden. Dieser Assay erfordert nur eine kleine Anzahl von Eierstockkrebszellen (100 Zellen pro Sphäroid x 20-30 Sphäroide pro Bedingung), so ist es möglich, diesen Assay unter Verwendung von wertvollen primären Tumorzelle Proben. Ferner kann dieser Assay einfach für Hochdurchsatz-Screening angepasst werden.

Die Mesothelzellen-Clearance-Test hier beschriebenen nutzt die Vorteile der fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Video-Mikroskopie zu visualisieren und quantitativ zu messen die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Test modelliert die frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Eierstockkrebs ist die fünftführende Ursache für krebsbedingte Todesfälle in den Vereinigten Staaten1. Trotz eines positiven ersten Ansprechens auf Therapien erleiden 70 bis 90 ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit von multizellulären Ovarialkarzinom-Sphäroiden, eine Mesothelmonolayer zu infiltrieren, zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Ovarialkarzinomzellen, die rotes Fluoreszenzprotein exprimieren, in Kulturgefäßen mit geringer Haftung inkubiert werden, um multizelluläre Sphäroide zu bilden. Im nächsten Schritt werden Mesothelzellen, die grünes Fluoreszenzprotein exprimieren, auf fibronectinbeschichteten Glasboden-Kulturschalen ausgesät, um Monolayer zu bilden.Der letzte Schritt besteht darin, die Ovarialkarzinom-PHS von den Platten mit geringer Adhäsion auf die Platten mit den Mesothel-Monolagen zu übertragen. Abschließend wird die fluoreszenzbasierte Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet, um die relative Fähigkeit von Kontroll- und experimentellen Ovarialkarzinom-SP zu quantifizieren, ein Loch in der Mesothel-Monolage zu bilden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Endpunkt-Assays liegt darin, dass eine Kombination aus fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet wird, um die Dynamik der mesialen Clearance im Zeitverlauf zu überwachen. Vor der Bildung von PHE bei Eierstockkrebs ist es notwendig, Kulturschalen mit geringer Haftung vorzubereiten. Verwenden Sie 96-Well-Rundbodenkulturschalen. Um diese Kulturschalen herzustellen, geben Sie 30 Mikroliter Poly-Hema-Lösung in jedes Loch einer 96-Well-Zellkulturschale. Die 96-Well-Platten 24 bis 48 Stunden in einem nicht befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren, um das Ethanol zu verdampfen, wodurch ein Poly-Hema-Film in jedem Well zurückbleibt. Dieser Poly-Hema-Film verhindert, dass sich die Zellen an der Unterseite des Wells anheften, und zwingt die Zellen so, in Suspension zu wachsen. Die rotes Fluoreszenzprotein exprimierenden Ovarialkarzinomzellen in diesem Experiment werden in 10 % Basenmedium kultiviert, einem speziell angefertigten Zellkulturmedium, sobald die kulturplatten mit geringer Adhäsion bereit sind.Trypsin wird verwendet, um die Platte mit Ovarialkarzinomzellen abzulösen, indem die Platte zuerst mit PBS gewaschen wird, anschließend ein Milliliter Trypsin hinzugefügt und die Platte fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Nach Zugabe von 10 % Basenmedium zur Neutralisation des Trypsins wird die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-konisches Polypropylenröhrchen überführt. Die Zellen werden in einer Tischzentrifuge bei 900 RCF drei Minuten lang pelletiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 10 % Basenmedium resuspendiert.Nach der Zellzählung mit einem Hämozytometer die Zellkonzentration auf 100 Zellen pro 50 Mikroliter 10 % Base-Medium einstellen, 50 Mikroliter der gleichmäßig suspendierten verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Loch-Polyhema-beschichteten Kulturschale geben und die 96-Loch-Platte 16 Stunden lang in einem Zellkulturgehäuse bei 37 °C inkubieren, damit die Ovarialkarzinomzellen zusammenlagern und in jeder Vertiefung einen einzelnen mehrzelligen Sphäroid bilden. Um dieses Verfahren zu beginnen, die Vertiefungen einer sechs-Loch-Glasboden-Mat-Tech-Schale mit Fibronectin vorbeschichten. Jeweils zwei Milliliter Fibronectin-PBS-Lösung in jede Vertiefung der Schale geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Die grün fluoreszierenden Proteine exprimierenden Mesothelzellen zur Bildung einer Mesothelzellen-Monolayer wurden in 10 % Basalmedium kultiviert. Die Zellen mit Trypsin abgelöst, in einer Platte gesammelt und in einer Tischzentrifuge bei 900 U/min drei Minuten lang zentrifugiert. Den Überstand abpipettieren und die Zellen in 10 % Basalmedium resuspendieren, anschließend mit 10 % Basalmedium auf die gewünschte Konzentration einstellen. Nach Beendigung der 30-minütigen Inkubation der Mat-Tech-Schale mit Fibronectin die Vertiefungen mit zwei Millilitern PBS waschen, den PBS abpipettieren und je 6 × 10⁵ Mesothelzellen pro Vertiefung in jede Vertiefung der sechswelligen Mat-Tech-Schale ausplattieren.Inkubieren Sie die Mat-Tech-Schale über Nacht in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius, damit die Mesothelzellen an der Schale haften und eine Monolayer bilden können. Um diesen Assay zu beginnen, verwenden Sie eine Pipette, um das ovariale Krebs-PHE von der mit Poly-Hema beschichteten 96-Loch-Platte zu entnehmen, aspirieren Sie das Medium aus einem der sechs Wells der Mat-Tech-Schale, die eine Mesothelzell-Monolayer enthält, waschen Sie einmal mit zwei Millilitern PBS und geben Sie das gesamte PHE von der 96-Loch-Platte in ein Well der Mat-Tech-Schale. Dies entspricht ungefähr dem Dreifachen der Anzahl der Steroide, die abgebildet werden sollen, um zu berücksichtigen, dass das PHE auf dem Teil der Schale landet, der nicht abgebildet werden kann.Da nur ein Steroid pro Bildfeld abgebildet werden soll, müssen Aggregationen des Steroids vermieden werden. Schwenken Sie die Petrischale vorsichtig von Seite zu Seite, um die Steroide gleichmäßig über die Monolayer zu verteilen, bevor sie sich anheften. Stellen Sie die Mat-Tech-Schale auf den Objektträger des invertierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops.In der Lage, zeitraffende Aufnahmen über einen Zeitraum von mindestens acht Stunden durchzuführen. Verwenden Sie einen motorisierten Probentisch, um mehrere Positionen in der Petrischale mit mehreren OID-Interkollationsereignissen abzubilden. In einem einzelnen Experiment wird die Ovarialkarzinomzelle PHE auf den Boden der Schale absinken und sich an die Mesothelzelle anheften.Eine Einschichtaufnahme sammelt G-F-P-R-F-P- und Phasenkontrastbilder von mehr als 20 Sphäroid-Einschicht-Interaktionen alle 10 Minuten über einen Zeitraum von acht Stunden. Bei dem Mesothelzellfreisetzungstest dringen die RFP-exprimierenden ovarialen Krebszellen PHE in die GFP-exprimierende Mesothelzelleinschicht ein und erzeugen Löcher in der Einschicht. Die Größen der Löcher werden durch Nachzeichnen der schwarzen Löcher in den GFP-Bildern mithilfe der Element-Software oder einer anderen geeigneten Software wie ImageJ bestimmt. Die Größe des Lochs wird anschließend auf die anfängliche Sphäroidgröße normalisiert, indem die Lochgröße nach acht Stunden durch die Größe des Sphäroids im entsprechenden RFP-Bild zum Zeitpunkt null dividiert wird. Der Mesothelzellfreisetzungstest kann verwendet werden, um die Invasionsfähigkeit genetisch veränderter ovarieller Krebszellen-Sphäroide zu vergleichen, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, durch die ovarielle Krebszellen-Sphäroide die Mesothelschicht löschen.Die Mesothelialschicht in diesem Beispiel zeigt die MESOTHELIALE Clearance-Fähigkeit von Ovarialkarzinomzellen des Typs OVCA 433. Phänotypen mit abgeschwächter Expression von TALON-1 wurden mit Kontroll-OVCA-433-Zellen verglichen. Die von den sich ausbreitenden Phänotypen in der Monolayer verursachten Lücken wurden gemessen, und die Werte an sechs Positionen pro Gruppe wurden gemittelt.Wie in diesem Diagramm gezeigt, war die durch Talon-1-Knockdown-Steroiden erzeugte durchschnittliche Freifläche signifikant kleiner als die durch Kontrollsteroide erzeugte durchschnittliche Fläche, was darauf hindeutet, dass Talon für die Mesothelentscheidung durch OVCA 4 33 Ovarialkarzinom-Zellen erforderlich ist. Dieser Zeitrafferfilm zeigt ein Kontroll-OVCA-4-33-rotes Steroid, das eine grüne MESOTHELIALE Einzelschicht infiltriert. Der nächste Zeitrafferfilm zeigt ein OVCA-4-33-rotes Steroid mit abgeschwächter Expression von Talon 1, das in eine grüne Mesothelialeinzelzellschicht eindringt.Im Vergleich zum vorherigen Film ist offensichtlich, dass die Abschwächung der Talon-1-Expression in den Steroiden die Clearance-Fähigkeit der Mesothelzellen verringert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Wechselwirkung von Ovarialkarzinom, multizellulären Steroiden und Mesothelzell-Monolagen über die Zeit mithilfe der Zeitraffer-Videomikroskopie überwacht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

In diesem Video demonstrieren wir die Entwicklung eines in vitro dreidimensionalen Modells der Auskleidung der Bauchhöhle. Diese organotypische Kultur kann helfen, die Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen zu untersuchen.

Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

Dieses Video beschreibt eine Technik zur quantitativen Messung der Interaktion von Eierstockkrebs-Sphäroiden mit Mesothelzellen, unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Videomikroskopie. Dieser In-vitro-Assay modelliert die Interaktion zwischen metastasierenden Sphäroiden von Eierstockkrebszellen und Mesothelzellen, die die Bauchhöhle auskleiden, in vivo.

Mesothelialer Clearance-Assay: Eine in vitro Technik zur Quantifizierung der Invasionsfähigkeit von Eierstockkrebs-Sphäroiden in mesotheliale Zellmonoschichten

Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Wir skizzieren ein Protokoll, das sowohl in vivo als auch ex vivo Ansätze zur Untersuchung der Besiedlung von peritonealem Fettgewebe, insbesondere des Omentums, bei Eierstockkrebs implementiert. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung und Analyse von Immunzellstrukturen im Omentum vor, die als Milchflecken bekannt sind und Metastasen des Peritonealfettgewebes begünstigen.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

Metastasierung bei Eierstockkrebs ist durch zahlreiche diffuse intraperitoneale Läsionen gekennzeichnet, so dass eine genaue visuelle Quantifizierung der Tumorlast eine Herausforderung darstellt.  In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur in situ und ex vivo Quantifizierung der metastasierten Tumorlast unter Verwendung von rot fluoreszierenden Protein (RFP)-markierten Tumorzellen und optischer Bildgebung.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion eines dreidimensionalen in vitro Modells der Auskleidung der Bauchhöhle, bestehend aus primären menschlichen Mesothelzellen und Fibroblasten, die mit extrazellulärer Matrix überlagert sind, als Werkzeug zur Untersuchung der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen.

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

Um den mehrstufiger Prozess der Peritonealdialyse Verbreitung von Ovarialkarzinomen klären, die aktuelle Studie stellt eine murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumorentstehung und Metastasierung Peritonealdialyse über orthotoper Impfung mit diesen Tumorzellen.

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

ovarian Tumorprogression in einem physiologisch relevanten Modell, mehrzelligen Sphäroiden wurden in einem Mikroeinrichtung unter simulierten Fluidstrom zu studieren. Diese dynamische 3D-Modell emuliert die intraperitoneale Umgebung mit den zellulären und mechanischen Komponenten, bei denen Ovarialkarzinom Metastasen auftreten.

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines dreidimensionalen (3D) ex vivo Modells der Krebszell-Omentum-Interaktion. Das Modell bietet eine Plattform zur Aufklärung von Pro-Tumor-Mechanismen in der Fettnische und zur Erprobung neuartiger Therapien.

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Erfahren Sie, wie ein In-vitro-Assay mit fluoreszenzmarkierten Eierstockkrebs-Sphäroiden und Mesothelzell-Monolagen die frühen Schritte der Metastasierung modelliert. Zeitlupenmikroskopie ermöglicht quantitative Analyse.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

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