Name: Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt 18 O-angereichertem Wasser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie protease- und säurekatalysierte Markierungsworkflows mit 18O-angereichertem Wasser für quantitative Proteomik. Diese Methoden ermöglichen die dynamische Analyse proteolytischer Spaltungsreaktionen mittels Massenspektrometrie.

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Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCR Stipendium 1R01DE019796 unterstützt.

Die vorgestellten LeO-Workflows ermöglichen die stabile Isotopenmarkierung von Proteinverdaus und synthetischen Peptiden. Diese zeitliche Verlauf Experimente (Abbildung 1) sind für vergleichende und quantitativen Proteomik Studien sowie Protease Forschung. Jeder Workflow besteht aus zwei experimentellen Schritte (Abbildung 2): A) Die zeitaufgelöste Abtastung des jeweiligen 18 O-stabilen Isotopen-codierten Reaktion (Protease-katalysierten Peptidspaltung; Protease-katalysierten Carboxyl-Sauerstoff-Austausch; säurekatalysierte Carboxyl Sauerstoffaustausch Reaktion) und B) Analyse durch Massenspektrometrie und grafische Darstellung der 18 O-Einbau Kinetik. A. Zeitverlauf Experimente I. Paleo-Zeitverlauf: Protease-katalysierten Kennzeichnung von proteolytischen Spaltungen <ol><li> (Optional) Disulfidbindungen von Proteinen (10 uM) und Peptide (250 uM) mit DTT (Endkonzentration 2,5 mM) reduziertin 25 mM NH 4 HCO 3 (beide frisch zubereiteten) durch Inkubation für 30 min bei 50 ° C. </li><li> (Optional) herunter Cysteine ​​mit Iodacetamid alkyliert (Endkonzentration 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 durch Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Je nach Protease von Interesse, benötigen Protein / Peptid-Lösungen zu sein bereinigten um restliche Puffer und Alkylierungsmittel entfernen. Verwenden PepClean C-18 Spin-Säulen (Thermo) für Peptid-Bereinigung und Vivaspin Zentrifugalkonzentratoren (Sartorius) Puffer für Protein-Proben austauschen. </li><li> Abgeblasen / exchange Peptide / Proteine ​​in 20 ul Protease Reaktionspuffer (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; Trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0), 1:1 (v / v) H 2 endgültige 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Entnommen wird eine Null Zeitpunkt Probe vor der Zugabe der Protease: Mix 0,5 ul des Reaktionsgemisches und 0,5 ul alpha Cyano-4-HydroxyzimtsäureSäure-Matrix (10 mg / ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA). Spot-Probe auf einem Opti-TOF 384 MALDI Zieltafel (AB SCIEX) und lassen Sie die Lösungsmittel-Tröpfchen bei Raumtemperatur bis trocken (ca. 5 min). </li><li> Teilen Sie die Reaktionslösung in zwei Aliquots. Bei Raumtemperatur oder der empfohlenen Temperatur für das jeweilige Enzym:;: der erste Aliquot wird mit der Protease von Interesse (0,04 nM 75 nM Trypsin ECE-1) inkubiert werden. Das zweite Aliquot wird ohne Protease inkubiert werden und wird als Kontrollprobe zu dienen. Das erste Aliquot eine Standardprobe für Protease-katalysierte 18 O-Kennzeichnung und kann für Peptid-und Protein-Identifizierung, Detektion von proteolytischen Wirkungen und Überwachung der proteolytischen Spaltung Reaktionen eingesetzt werden. Das zweite Aliquot wird verwendet um zu zeigen, dass 18 O-Einbau durch die Protease induziert wird, daher weder Kennzeichnung noch Spaltung wird für diese Probe erwartet. </li><li> Befolgen Sie die Reaktion durch Entfernen Reaktionsaliquots und Schmierblutungen sie als described unter Schritt 5 in Zeitabständen scheinen, als fit. Die oben beschriebenen Reaktionsbedingungen werden verwendet, um eine proteolytische Reaktion für bis zu vier Tagen (ca. 24 Punkte) zu überwachen. Starten Probenahme alle 5 min bis 30 min, dann erkennen alle 30 min bis 2 h, dann ist jede Stunde bis 8 Stunden und alle 8 Stunden bis 4 Tage. Spaltprodukte sollte innerhalb der ersten 12 Stunden erscheinen und das Substrat sollte vollständig hydrolysiert nach 24 Stunden. Verlängerte Reaktionszeit Inkubationszeiten gestatten, um stabile Reaktionsprodukte, die aus diskreten Reaktionszwischenprodukte, das weiter verarbeitet werden, sind zu definieren. Je nach Fragestellung und bestimmten Enzym-Substrat-Paare haben Spotting Zeiten und Inkubationstemperatur moduliert werden, um eine optimale Reaktion Probenahme zu gewährleisten. </li><li> Nachdem die letzte Reaktion Zeitpunkt ist fleckig oder zwischen ausgedehnten Spotting Zeitabständen die MALDI-Target Platte wird auf MALDI-TOF/TOF MS / MS-Analyse vorgelegt, wie unten (Abschnitt B) beschrieben. </li></ol> II. Paleo-Zeitverlauf: Postdigestion Etikettierung von proteolytischen Termini <ol><li> (Optional) Disulfidbindungen von Proteinen (10 uM) und Peptide (250 pM) mit DTT (Endkonzentration 2,5 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 (beide frisch hergestellt) durch Inkubation reduziert und 30 min bei 50 ° C. </li><li> (Optional) herunter Cysteine ​​mit Iodacetamid alkyliert (Endkonzentration 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 durch Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Abhängig von der Protease von Interesse, benötigen Protein / Peptid-Lösungen zu sein bereinigten um restliche Puffer und Alkylierungsmittel entfernen. Verwenden PepClean C-18 Spin-Säulen für die Peptid-Bereinigung und Vivaspin Zentrifugalkonzentratoren für Protein-Puffer Austausch. </li><li> Abgeblasen / tauschen die bereinigten Peptid products / Proteine ​​in 20 ul Protease Reaktionspuffer (z. B. Trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) und Verdau mit Protease von Interesse bis zur Fertigstellung (z. B. Trypsin: 0,04 nM; 37 ° C; 12 h). </li><li> Cleanup Spaltprodukte mit PepClean C-18 Spin-Säulen. Dieser Schritt wird Eliminierung restlicher Proteaseaktivitäten. </li><li> Abgeblasen / tauschen die bereinigten Peptid Produkte in 20 ul Protease Reaktionspuffer (Trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0), 1:1 (v / v) final H 2 18 O </li><li> Entnommen wird eine Null Zeitpunkt Probe vor der Zugabe des Enzyms: Mix 0,5 ul des Reaktionsgemisches und 0,5 ul alpha Cyano-4-Hydroxyzimtsäure Matrix (10 mg / ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA). Spot-Probe auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie die Lösungsmittel-Tröpfchen bei Raumtemperatur bis trocken (ca. 5 min). </li><li> Teilen Sie die Reaktionslösung in zwei Aliquots. Bei Raumtemperatur oder der empfohlenen Temperatur für das jeweilige Enzym: der erste Aliquot wird mit Protease von Interesse (0,04 nM zB Trypsin) inkubiert werden. Das zweite Aliquot wird ohne Protease inkubiert werden und wird als Kontrolle zu dienen. Die ersteAliquot eine Standardprobe für Protease-katalysierten 18 O-postdigestion Beschriftungen und können für Peptid-und Protein-Quantifizierung verwendet werden. Das zweite Aliquot wird verwendet um zu zeigen, dass 18 O-Einbau durch die Protease katalysiert wird, daher wird keine Markierung für diese Probe erwartet. </li><li> Befolgen Sie die Reaktion durch Entfernen Reaktionsaliquots und Spotting ihnen wie unter Schritt 7 beschrieben.) In zeitlichen Abständen scheinen, als fit. Zum Beispiel sahen wir zunächst alle 5 min bis zu 30 min und jede 15 min nach, dass die Carboxyl-Sauerstoff-Austausch durch Trypsin katalysiert überwachen. </li><li> Nachdem die letzte Reaktion Zeitpunkt ist fleckig oder zwischen ausgedehnten Spotting Abständen die MALDI-Target Platte wird auf MALDI-TOF/TOF MS / MS-Analyse vorgelegt, wie unten (Abschnitt B) beschrieben. </li></ol> III. Aleo-Zeitverlauf: Säurekatalysierte Kennzeichnung von Carboxylgruppen <ol><li> Inkubieren einzelnen Peptide (50 nM) mit 1:1 (v / v) 18 O-angereicherte Wasser in ter An-oder Abwesenheit (Kontrolle) von 0,1% (v / v) Trifluoressigsäure endgültige (Gesamtvolumen 30 ul). </li><li> Probe die Reaktionsprodukte täglich für 48 Tage durch Co-Spotting eine 0,5 ul Aliquots der Mischung mit 0.5μl von alpha Cyano-4-Hydroxyzimtsäure Matrix (10 mg / ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA) direkt auf ein MALDI-Target Platte. </li><li> Zwischen Spotting Abständen und nach dem Spotten der endgültigen Reaktion Zeitpunkt einzureichen MALDI Zieltafel für MALDI-TOF/TOF MS / MS-Analyse wie in Abschnitt B beschrieben </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Datenerfassung und-analyse <ol><li> Massenspektren werden auf einem 4800 MALDI TOF / TOF-Analysator (AB SCIEX) erworben. </li><li> Vor der Analyse wird das Gerät mit einer Mischung von Peptid-Standards (Mass Standards Kit zur Kalibrierung von AB SCIEX TOF / TOF Instrumente) mit einer zulässigen Gesamtmasse Messfehler von ± 50 ppm und einer minimalen Anzahl von sechs Gipfeln passend kalibriert. </li><li> MS-Spektren (MassenbereichSchrittgröße 50) mit einer annehmbaren Base Peakintensität Bereich von 2.000 - 45.000; 400 - 3.800 - 4.000 m / z) werden in dreifacher Ausfertigung mit positiven Ionen-Modus mit einer einstellbaren Laserintensität (3.400 erworben. Einzelaufnahmen für Sub-Spektren erworben werden, mit insgesamt 400 Schuss / Spektrum, Stopp-Bedingungen in Kraft nach 800 sub-Spektren kommen erworben werden (bestanden oder nicht bestanden) oder 400 sub-Spektren Pass Akzeptanzkriterien. Im Falle einer low-reiche Proben oder in Gegenwart komplexer biologischer Herkunft das untere Ende des MS Erfassungsbereich sollte bis 800 m / z erhöht werden. Darüber hinaus kann es erforderlich sein, Salz und anderen störenden Verbindungen mit einer Probe Aufräumsegments wie früher oder durch LC-Trennung beschrieben zu entfernen. </li><li> MS-Dateien (. T2d Dateien) werden von der 4000 Series Explorer Datenerfassungs-Software exportiert und importiert in unsere in-house Labor-Informations-System, das MASCOT Distiller-Software (Matrix Science) zur spektralen Verarbeitung und Peak-Erkennung nutzt. Isotopic Umschlägesind entfalteten und 18 O-Einbau-Verhältnisse automatisch unter Verwendung eines Algorithmus ähnlich dem von Mason et al. 12 beschrieben und angepasst durch unsere Gruppe 9. Alternativ Software-Tools wie ZoomQuant 13 und Viper 14, als auch kommerzielle Software-Pakete wie Als BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) und Mascot Distiller Quantifizierung Toolbox (Matrix Science) können dekonvolutieren 18 O-Typ-Daten 15,16. 18 O-Einbau-Verhältnisse als die relativen Beiträge der einzelnen Peptid-Isotop Arten ausgedrückt werden (dh Peptide mit 16 O, 18 O 18 O 1 oder 2) auf die gesamte isotopischen Umschlag. </li><li> Für jede Zeitverlauf Experiment wurden die molekularen Massen ([M + H] +) für alle detektierten Peptidspezies werden aus den zugehörigen MS-Daten extrahiert, und die Werte bei einer 100 ppm Masse Breite klassierten. </li><li> At mindestens drei [M + H] + sind so eingestellt, erforderlich, um eine bin zu füllen. Im Falle der bekannten Substrate wird das gefilterte bin Liste in eine Liste von proteolytischen Spaltprodukten vorhergesagten von dem Substrat unter Verwendung der Peptidsequenz ExPASy FindPept Werkzeug 17 (Vergleich <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) und einen 200 ppm Masse Fehler Akzeptanz Toleranz. </li><li> MS / MS-Spektren sind für alle Massewerte von Spaltprodukten durch den FindPept Tool und bin Werte, die 18 O-Gründungen mit ihnen verknüpft sind vorausgesagt erworben. MS / MS-Daten werden auf dem 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer in 1kV Reflektor positive Ionen-Modus erworben, mit einer festen Laserintensität von 4200 und CID-Gas im ausgeschalteten Zustand. 50 Aufnahmen werden in einem randomisierten Muster pro Sub-Spektren bis zu einem Gesamtbetrag von 40 sub-Spektren pro Spot (was eine Gesamtmenge von 2.000 Schuss / spot) erworben. </li><li> MS / MS-Daten-Dateien (. T2d Dateien) werden von der 4000 Series Explo exportiertrer Datenerfassungs-Software importiert und in unsere in-house Labor-Informations-System, werden Peaks erkannt und MS / MS Peaklisten werden mit den entsprechenden klassierte MS Daten verbunden sind. </li><li> Für Peptid-Identifizierung, werden MS / MS Peaklisten gegen die SwissProt Datenbank mit dem MASCOT Suchmaschine mit folgenden Suchparametern gesucht: kein Enzym Spezifität, 150 ppm Vorläufer-Ion und 0,2 Da Fragment Ionenmasse Toleranzen. </li><li> Peptid Identifikationen kann zusätzlich unter Verwendung des validierten Daten-Explorer-Software (AB SCIEX) durch Bestätigen der charakteristischen 18 O-Inkorporation Muster über y-Reihe Fragmentionen wie durch Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Herstellung von Spectral Zeit und 18 O-Einbau Plots Spectral Zeitdiagramme: MS-Dateien (. T2d Dateien) für jede Reaktion Zeitpunkt werden aus dem Data Explorer-Software als exportiert ASCII-Dateien mit einerMakro-und Importieren in eine Datenanalyse und Grafik-Software-Programm (zB Origin von OriginLab) und als Wasserfall Plots (Abbildung 3). 18 O-Inkorporation Plots: Für jede klassierte Peptidspaltungsproduktes, die jeweiligen Beiträge der einzelnen Peptid Isotop Spezies (16 O, 18 O 18 O 1 oder 2) sind in allen Punkten Reaktionszeit extrahiert und gegen die Zeit aufgetragen (Abb. 4).

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
<li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li>
<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li>
<li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+proteolytic+18O+labeling%3A+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li>
<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
<li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156(2009).</li>
<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
<li>Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li>
<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
<li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Durch die Kombination von stabilen Isotopenmarkierung und hochauflösende Massenspektrometrie in einer zeitaufgelösten Weise ermöglicht die Paleo-Zeitverlauf-Methode für eine dynamische Analyse der Erzeugung von Peptid-Produkte. Der Assay kann verwendet werden, um stabile isotopenmarkierte Peptide für die quantitative und qualitative Proteomstudien erzeugen und die Kinetiken, mit denen proteotypischen Peptiden erzeugt werden ausgewertet werden. Weiterhin ist Paleo-Zeitverlauf zur proteolytischen Wege unter speziellen, ph...

<table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Gutes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Columns </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI Zieltafel </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Materials <table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Alpha cyano-4-Hydroxyzimtsäure </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70.990-1G-F </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodacetamid (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Trypsin Gold- </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Wasser-18 O, 97 O 18 Atom% </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329.878-1G </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Messe Standards Kit zur Kalibrierung von AB SCIEX TOF / TOF-Geräte </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien

protease-und acid-katalysierten labeling workflows beschäftigt<sup&gt; 18</sup&gt; o-angereichertem wasser

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stabile Isotope sind unverzichtbare Werkzeuge in der biologischen Massenspektrometrie. Historisch gesehen, haben 18 O-stabilen Isotopen wurde ausgiebig genutzt, um die katalytischen Mechanismen von proteolytischen Enzymen 1-3 studieren. Mit dem Aufkommen der Massenspektrometrie basierenden Proteomik ist die enzymatisch-katalysierten Einbau von 18 O-Atomen, die aus stabilen Isotopen angereicherte Wasser zu einem beliebten Methode quantitativ zu vergleichen Proteinexpression Ebenen (Übersichtsartikel von Fenselau und Yao 4, Miyagi und Rao 5 und Ye et al. 6). 18 O-Kennzeichnung stellt eine einfache und preiswerte Alternative zur chemischen (zB iTRAQ, ICAT) und metabolische (zB SILAC) Markierungstechniken 7. Abhängig von der Protease verwendet wird, kann 18 O-Kennzeichnung in der Einarbeitung von bis zu zwei 18 O-Atomen in der C-terminalen Carboxylgruppe der Spaltprodukt 3 führen </sup&gt;. Die Markierungsreaktion kann in zwei unabhängige Prozesse, die Peptidbindungsspaltung und die Carboxyl Sauerstoff Austauschreaktion 8 unterteilen. In unserem Paléo (p rotease-a ssisted l Abeling e mploying 18 O-angereichertem Wasser) Anpassung der enzymatischen 18 O-Kennzeichnung, verwendeten wir 50% 18 O-angereichertem Wasser Unterscheidungskraft Isotopensignaturen ergeben. In Kombination mit hochauflösende Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight-Tandem-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/TOF MS / MS) können die charakteristischen Isotop Umschläge zu Spaltprodukten mit einem hohen Maß an Spezifität zu identifizieren. Wir haben vorher haben die Paläo-Methodik zur Erfassung und Charakterisierung endogene Proteasen 9 und überwachen proteolytische Reaktionen 10-11. Da Paleo kodiert das Wesen der proteolytischen Spaltung, ist der Versuchsaufbau einfache und biochemische enrichment Schritte von Spaltprodukten umgangen werden kann. Das Paléo-Verfahren kann leicht an (i) Zeitverlauf Experimente, die die Dynamik der proteolytischen Spaltung Reaktionen und (ii) die Analyse der Proteolyse in komplexen biologischen Proben, die physiologischen Bedingungen stellen zu überwachen erweitert werden. Paleo-Zeitverlauf Experimente helfen identifizieren geschwindigkeitsbestimmenden Verarbeitungsschritte und Intermediate in komplexen proteolytischen Stoffwechselweg Reaktionen. Weiterhin erlaubt die Paleo-Reaktion wir proteolytische Enzyme wie die Serinprotease Trypsin, die fähig, ihre Spaltprodukte binden und katalysieren den Einbau eines zweiten 18 O-Atom ist identifizieren. Solche &quot;double-Kennzeichnung&quot; Enzyme können für postdigestion 18 O-Kennzeichnung, bei denen Peptide ausschließlich durch die Carboxyl-Sauerstoff-Austausch sind beschriftet werden. Unsere dritte Strategie erstreckt Kennzeichnung beschäftigt 18 O-angereichertem Wasser über Enzyme und nutzt sauren pH-Bedingungen, um 18 O-stabilen Isotopen Zeichen einzuführenturen in Peptide.

Wir nutzten die Paleo-Zeitverlauf Workflow dynamisch überwachen den Einbau von 18 O-stabilen Isotopen in Peptid Spaltprodukte durch proteolytische Enzyme erzeugt. Der vorgestellte Ansatz ist ein vielseitiges Werkzeug vergleichsweise studieren proteolytische Prozessierung Wege für unterschiedliche Substrat und Protease-Kombinationen. Durch Abtasten proteolytischen Reaktionen wiederholt über den Verlauf der Reaktion stellt das Paleo-Zeitverlauf Experiment zeitaufgelösten Momentaufnahmen von Substrat und Produkt...

Stabile Isotopenmarkierung Workflows Einsatz<sup&gt; 18</sup&gt; O-angereichertem Wasser (Leo-Workflows) sind vielseitige Werkzeuge zur quantitativen und qualitativen Proteomstudien. In Protease-assisted (Paleo) Workflows,<sup&gt; 18</sup&gt; O-Atome werden durch proteolytische Spaltung und Carboxyl-Sauerstoff-Austausch durch Proteasen vermittelt eingeführt. In der Säure-katalysierten (Aleo) Workflow,<sup&gt; 18</sup&gt; O-Atome durch Carboxyl Sauerstoffaustausch bei niedrigen pH eingeführt.

Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt<sup&gt; 18</sup&gt; O-angereichertem Wasser

Stabile Isotope sind essenzielle Werkzeuge in der biologischen Massenspektrometrie. Historisch gesehen wurden $^{18}\text{O}$-stabile Isotope extensiv eingesetzt, um die katalytische ...

Diese Darstellung zeigt Arbeitsabläufe für die stabile Isotopenmarkierung von Proteinverdauungsprodukten und synthetischen Peptiden unter Verwendung von mit Sauerstoff-18 angereichertem Wasser. Zunächst erfolgt im proteasekatalysierten Paläo-Zeitverlaufsversuch die Inkubation von Substrat und Protease in Gegenwart von 50 % Sauerstoff-18-angereichertem Wasser, um Sauerstoff-18-Atome einzubauen. Anschließend wird für Proteasen, die zur Doppelmarkierung fähig sind, eine erneute Inkubation der nach der Verdauung entstandenen Spaltprodukte mit der betreffenden Protease in Gegenwart von 50 % Sauerstoff-18-angereichertem Wasser durchgeführt.Der EO-Ablauf führt die säurekatalysierte Einlagerung von Sauerstoff-18-Atomen in funktionelle Gruppen zu definierten Zeitintervallen durch. Dabei werden Aliquote der Reaktionsmischungen mit Matrix auf schimmeligen Targetplatten aufgebracht, bevor die massenspektrometrischen Daten erfasst werden, wodurch spektrale Zeitverlaufsdiagramme der Peptidspaltreaktionen sowie Diagramme zur Sauerstoff-18-Einlagerung einzelner Peptidarten erzeugt werden. Markierte Spaltprodukte werden für die Sequenzidentifizierung mittels MS/MS ausgewählt. Letztendlich stellen d

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

DNA und Proteine ​​sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur ortsspezifischen Einführung chemischer Sonden in ein Antikörperfragment, indem eine azidhaltige Aminosäure genetisch eingebaut und anschließend das Azid mit einer chemischen Sonde durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) gekoppelt wird.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.

Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Die Verwendung von thioliertem Uracil zur empfindlichen und gezielten Reinigung neu transkribierter RNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.

Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff FM 4-64 markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release in Hippocampus-Neuronen Kulturen zu messen.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

Erfahren Sie protease- und säurekatalysierte Markierungsworkflows mit 18O-angereichertem Wasser für quantitative Proteomik. Diese Methoden ermöglichen die dynamische Analyse proteolytischer Spaltungsreaktionen mittels Massenspektrometrie.

Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt

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