Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt

Diese Darstellung zeigt Arbeitsabläufe für die stabile Isotopenmarkierung von Proteinverdauungsprodukten und synthetischen Peptiden unter Verwendung von mit Sauerstoff-18 angereichertem Wasser. Zunächst erfolgt im proteasekatalysierten Paläo-Zeitverlaufsversuch die Inkubation von Substrat und Protease in Gegenwart von 50 % Sauerstoff-18-angereichertem Wasser, um Sauerstoff-18-Atome einzubauen. Anschließend wird für Proteasen, die zur Doppelmarkierung fähig sind, eine erneute Inkubation der nach der Verdauung entstandenen Spaltprodukte mit der betreffenden Protease in Gegenwart von 50 % Sauerstoff-18-angereichertem Wasser durchgeführt.

Der EO-Ablauf führt die säurekatalysierte Einlagerung von Sauerstoff-18-Atomen in funktionelle Gruppen zu definierten Zeitintervallen durch. Dabei werden Aliquote der Reaktionsmischungen mit Matrix auf schimmeligen Targetplatten aufgebracht, bevor die massenspektrometrischen Daten erfasst werden, wodurch spektrale Zeitverlaufsdiagramme der Peptidspaltreaktionen sowie Diagramme zur Sauerstoff-18-Einlagerung einzelner Peptidarten erzeugt werden. Markierte Spaltprodukte werden für die Sequenzidentifizierung mittels MS/MS ausgewählt. Letztendlich stellen diese Abläufe vielseitige Werkzeuge für quantitative und qualitative proteomische Untersuchungen dar.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Proteaseforschung zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Reaktionsgeschwindigkeiten, geschwindigkeitsbestimmenden Schritten und Reaktionszwischenstufen in komplexen proteolytischen Wegen. Proteolytische Signaturmuster, die mittels der paläontologischen Zeitreihe identifiziert werden, liefern wichtige Erkenntnisse zur Substratspezifität. Darüber hinaus nutzt der Timer der Daten ebenfalls kinetische Informationen.

Ein Postdoktorand aus meinem Labor wird nun die Prozedur demonstrieren. Der Ablauf der paläontologischen Zeitreihe überwacht Dynamiken von proteolytischen Spaltreaktionen basierend auf proteasekatalysierter Sauerstoff-18-Inkorporation. Für die 20-Mikroliter-Reaktion geben Sie die Peptide zum Protease-Reaktionspuffer, der mit Sauerstoff-18-angereichertem Wasser versetzt ist. Mischen Sie 0,5 Mikroliter der Reaktionsmischung mit 0,5 Mikroliter Matrix und pipettieren Sie auf ein Opti-3-84-MALDI-Zielplättchen. Lassen Sie die Lösungstropfen bei Raumtemperatur trocknen. In der Zwischenzeit teilen Sie die Reaktionsmischung auf zwei Röhrchen auf.

Steuern und Probe für das Probenröhrchen. Protease der Wahl hinzufügen und bei empfohlener Enzym-Reaktionstemperatur inkubieren. Zu den angegebenen Zeitpunkten hinzufügen.

Entnehmen Sie eine 0,5-Mikroliter-Aliquot und mischen Sie sie mit 0,5 Mikrolitern Matrix, anschließend auf die Multitarget-Platte auftragen. Fahren Sie fort mit der Analyse der Reaktionsdynamik mittels MALDI-TOF-MS-Analyse, wie später in diesem Protokoll nach der Verdauungsetikettierung beschrieben. SN produziert Enzyme wie Trypsin, die die Carboxyl-Sauerstoffaustauschreaktion katalysieren, um Sauerstoff-18 einzubauen. Nach Durchführung eines Proteinverdaus ohne Sauerstoff-18-Markierung werden die Spaltprodukte durch eine Peptidreinigungs-C18-Spin-Säule geleitet, um verbleibende Proteaseaktivitäten zu eliminieren.

Resuspendieren Sie die Proben anschließend in 20 µL Puffer für die Trypsinreaktion, der mit Sauerstoff-18 angereichertem Wasser versetzt ist. Entnehmen Sie ein 0,5 µL großes Aliquot und mischen Sie es mit gleicher Menge Matrix. Geben Sie dann einen Tropfen auf eine Opti-Off-3-84-MALDI-Zielplatte und lassen Sie ihn an der Luft trocknen.

Als Nächstes die Reaktionslösung auf Kontroll- und Probenröhrchen aufteilen. Trypsin hinzufügen und 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Reaktion zu überwachen, eine 0,5 µL-Aliquot entnehmen.

Mischen Sie mit 0,5 Mikrolitern Matrix und auftragen auf eine Maltar-Platte. Analysieren Sie die Dynamik dieser Carboxyl-Sauerstoffaustauschreaktion mittels Maldi-Toof-MSM-S-Analyse. Der zeitliche Ablauf des IEO-Arbeitsablaufs beruht auf den säurekatalysierten Carboxyl-Sauerstoffaustauschreaktionen saurer Peptid-Seiten- und -terminale Gruppen.

Zunächst 50 Nanomolar einzelner Peptide mit wasserstoff-18-angereichertem Wasser im Verhältnis eins zu eins in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 % Finaltrichlormilchsäure inkubieren. Täglich 0,5 Mikroliter Aliquote der Reaktion entnehmen und direkt mit Matrix auf eine MALDI-Zielplatte kopipettieren. Die MALDI-Zielplatte regelmäßig zur MALDI-TOF-MS-Analyse der Produktionsmuster einreichen. Dieser Abschnitt ist in der begleitenden Publikation ausführlich beschrieben.

Zunächst erwerben Sie tripelte MS-Spektren im positiven Ionenmodus. Nach der Kalibrierung des Multiplikators und der Einrichtung der MS-Datenaufnahme nehmen Sie Einzelaufnahmen für Teil-Spektren auf. Danach exportieren Sie die MS-Datendateien aus der Explorer-Datenaufnahmesoftware der 4.000er Serie.

Importieren Sie anschließend in ein internes Informationssystem, das die Mascot-Distiller-Software zur Spektralverarbeitung und Peak-Erkennung verwendet. Entfalten Sie die isotopischen Hüllen und bestimmen Sie automatisch die Sauerstoff-18-Inkorporationsverhältnisse; notieren Sie die Sauerstoff-18-Inkorporationsverhältnisse als die relativen Anteile einzelner Peptid-Isotopspezies an der gesamten isotopischen Hülle. Filtern Sie die Bin-Liste und gruppieren Sie jeweils mindestens drei Werte mit einer Massenbreite von 100 PPm für jedes Zeitverlaufs-Experiment.

Extrahieren Sie die molaren Massen aller nachgewiesenen Peptidarten aus den zugehörigen MS-Datendateien. Verwenden Sie nun X pacey, um einen Peptid-Set mit einer Massenfehlertoleranz von 200 PPM festzulegen. Vergleichen Sie die Binnenliste mit den Daten zu den proteolytischen Spaltprodukten, die aus der Substrat-Peptidsequenz vorhergesagt wurden.

Fahren Sie fort, MS/MS-Spektren für alle Massenwerte der durch das Find-Pep-Tool vorhergesagten Spaltprodukte sowie für Bin-Werte mit zugehöriger Sauerstoff-18-Inkorporation aufzunehmen. Sammeln Sie 50 Aufnahmen an MSM-S-Daten in einem randomisierten Muster pro Teil-Spektrum mit bis zu 40 Teil-Spektren pro Spot und exportieren Sie die MS/MS-Dateien. Anschließend exportieren Sie die MSM-S-Datendateien in das Analysesystem zur Peakdetektion und zur Erstellung von MS/MS-Peaklisten, die den entsprechenden Bend-MS-Daten für die Peptididentifizierung zugeordnet sind.

Legen Sie diese Suchparameter in der Mascot-Suchmaschine fest: keine Enzymspezifität, 150 PPM Toleranz für die Präkursorionen und 0,2 Dalton Toleranz für die Fragmentionenmassen. Durchsuchen Sie die M-S-M-S-P-Listen gegen die Swiss-Prot-Datenbank. Peptididentifizierungen können zusätzlich mithilfe von Data-Explorer-Software validiert werden, indem die charakteristischen Muster der Sauerstoff-18-Einlagerung in den Fragmentionen in den spektralen Zeitverlaufsdiagrammen bestätigt werden.

Exportieren Sie die MS-Datendateien für jeden Reaktionszeitpunkt aus der Datenexplorersoftware in ASCI-Dateien mithilfe eines Makros. Importieren Sie anschließend die Dateien in eine Datenanalyse- und Grafiksoftware und stellen Sie sie als Wasserfallplots dar, um Sauerstoff-18-Inkorporationsplots für jede Biegung zu erstellen. Extrahieren Sie aus dem Peptidspaltungsprodukt die relativen Beiträge der einzelnen Peptid-Isotopenspezies über alle Reaktionszeitpunkte hinweg und tragen Sie diese anschließend gegen die Zeit auf.

Spektrale Zeitverlaufsdiagramme wie dieses zeigen die Dynamik proteolytischer Spaltreaktionen. Dieses Experiment analysiert die Spaltung des bioaktiven Peptids Endo und C durch das endotheliale Konvertierungsenzym 1. Eine Wasserfallanordnung stellt die MS-Spektren der zeitlichen Verlaufsversuche dar, um gleichzeitig den Abbau des Substrats sowie das Auftreten von Zwischen- und Endprodukten zu verfolgen.

Die Spaltprodukte werden mittels MS/MS und anhand der charakteristischen Sauerstoff-18-Inkorporationsmuster ihrer Isotopenverteilungen identifiziert. Dieser Reaktionsmechanismus der Trypsin zeigt, dass proteolytische Enzyme die Einlagerung von bis zu zwei Sauerstoff-18-Atomen in die Peptidspaltprodukte vermitteln. In der auf Proteasen basierenden Markierungsstrategie führt die Spaltung der Peptidbindung zu einem 50 %igen Einbau von einzelnen Sauerstoff-18-Atomen in frisch erzeugte Peptidspaltprodukte. Proteasen wie Trypsin, die die Reaktionsprodukte erneut binden, katalysieren darüber hinaus die Einlagerung eines zweiten Sauerstoff-18-Atoms über die Carboxyl-Sauerstoffaustauschreaktion.

Im Gleichgewicht ist die Sauerstoff-18-Markierung im Verhältnis eins zu zwei zu eins auf unlabeled, einfach markierte und doppelt markierte Produkte verteilt. Bei der Vorverdau-Markierung von proteolytischen Enden erfolgt kein Bruch von Peptidbindungen. Stattdessen beruht die Einbindung von bis zu zwei Sauerstoff-18-Atomen ausschließlich auf der Carboxyl-Sauerstoffaustauschreaktion.

Daher erfolgt die Einfügung von Sauerstoff-18 nur bei Proteasen, die ihre Peptid-Spaltprodukte erneut binden. Die säurekatalysierte Markierung mit Sauerstoff-18 führt zur Einfügung von zwei Sauerstoff-18-Atomen pro Carboxylgruppe. Im Verlauf dieses Experiments können die mehrfachen Massenverschiebungen um jeweils zwei Dalton des isotopischen Signals von Angiotensin I durch die Aufnahme von Sauerstoff-18-Atomen nachverfolgt werden.

Durch die Kombination der OPE-Markierung und der hochauflösenden Massenspektrometrie in zeitlich aufgelöster Weise ermöglicht die Paleo-Zeitverlaufsmethode eine dynamische Analyse der Bildung von Peptidprodukten. Der Assay kann verwendet werden, um stabilisierte, topisch markierte Peptide für quantitative und qualitative proteomische Studien zu erzeugen, sowie um die Kinetik zu bewerten, mit der Protopic-Peptide gebildet werden.

Der Paleo-Zeitverlauf wurde entwickelt, um proteolytische Signalwege unter physiologisch relevanten Bedingungen zu bewerten. Diese Technik ebnete den Weg für unsere jüngste Untersuchung lytischer Prozesse in menschlichen Tumormikroumgebungen.