Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine minimalinvasive Methode zur Echtzeitüberwachung der durch N-A-D-P-H-Oxidase abgeleiteten reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS-Produktion in drei verschiedenen entzündlichen Mausmodellen bereitzustellen. Das erste Modell ist die intratracheale Verabreichung von Xan, bei der das proinflammatorische Molekül Xan in die Luftröhre anästhesierter Mäuse injiziert wird. Xan ist ein aus der Pilzzellwand stammendes Produkt, das die N-A-D-P-H-Oxidase aktivieren kann.

Das zweite Modell ist die Ligatur und Punktion, auch CLP genannt. Dabei wird der Bauch der Maus geöffnet, das Caecum mit einer Seidennaht ligiert und anschließend mit einer Nadel punktiert, um eine intraabdominale Sepsis sowie sekundäre akute Lungenentzündung und -schädigung auszulösen. Das dritte Modell besteht in der Gabe von Kohlenstofftetrachlorid per orale Gavage.

Kohlenstofftetrachlorid verursacht hepatocelluläre Nekrose und kann zur Modellierung einer akuten Leberschädigung sowie einer hepatischen Fibrose verwendet werden. Bei Modellmäusen wird eine biolumineszente Bildgebung durchgeführt, um die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu bewerten. Die resultierenden Daten zeigen, dass die N-A-D-P-H-Oxidase die wichtigste Quelle für die ROS-Produktion als Reaktion auf entzündliche Reize ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, beispielsweise der Florence-Sonde, liegt darin, dass sie einen minimalinvasiven Ansatz für die Echtzeitüberwachung der RS-Generierung während einer Entzündung in vivo bietet. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen zur Entzündung und Verletzung nach einer Abwehrreaktion zu beantworten, wie beispielsweise die Rolle von RS bei Lungenentzündung und -schädigung. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir die Rolle reaktiver Sauerstoffspezies in der Wirtsabwehr für alle drei in diesem Video gezeigten Tiermodelle der ROS-Generierung untersuchten.

Verwenden Sie P 47 Fox null Mäuse und alters- und geschlechtsgepaarte C 57 BL sechs DBA Mäuse. Beschaffen Sie die Genehmigung für die Experimente durch den institutionellen Ausschuss für Tierversuche, um die intratracheale Verabreichung von xin vorzubereiten. Desinfizieren Sie die chirurgische Arbeitsfläche mit 70 % Ethanol und legen Sie sie mit einer sterilen Auflage aus.

Der chirurgische Eingriff sollte unter Verwendung eines sauberen chirurgischen Kittels, Handschuhe, Maske und steriler Instrumente für die Anästhesie durchgeführt werden. Füllen Sie den Verdampfer eines Systems zur kontinuierlichen Isofluran-Zufuhr mit zwei bis 3 % Isofluran und schalten Sie es ein. Danach bringen Sie die Mäuse nach zwei bis drei Minuten in die Narkosekammer, überprüfen Sie, ob die Mäuse vollständig anästhesiert sind, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen und Atmung sowie Bewegungen beobachten.

Die Atemfrequenz sollte um etwa 50 % verringert werden. Anschließend rasieren Sie mit einer Schermaschine die Operationsstelle an der Vorderseite des Nackens der Maus. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf die Operationsplattform und setzen Sie eine Nasenkappe zur Aufrechterhaltung der Anästhesie auf. Wiederholen Sie den abwechselnden Auftrag von Betadine und 70 %igem Ethanol auf den Nacken dreimal.

Danach mit einer geraden, scharfen Schere die Haut des vorderen Halsbereichs etwa 0,5 Zentimeter einschneiden. Anschließend mit einer gebogenen Pinzette das umliegende Muskelgewebe der Luftröhre freilegen, um diese für die intratracheale Applikation von Xan freizulegen. Verwenden Sie eine Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, um die Luftröhre im mittleren Bereich zwischen den knorpeligen Ringen zu durchstechen.

Weiterhin lenken Sie die Nadel nach anterior und injizieren langsam ein Mikrogramm pro Gramm Körpergewicht von Xan. Schließen Sie den Schnitt postoperativ mit fünf sterilen Nylon-Nähten („oh“) naht. Stellen Sie die Maus in einen Erholungskäfig, der mit flachem Papier ausgelegt ist, und stellen Sie die Hälfte des Erholungskäfigs auf eine Heizplatte.

Überwachen Sie die Mäuse, bis sie wach sind und sich frei bewegen. Um eine sekundäre Ligatur und Punktion durchzuführen, rasieren Sie den Bauch einer anästhesierten Maus mit einer Schermaschine und platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform. Desinfizieren Sie anschließend den Operationsbereich mit Betadine und 70 %igem Ethanol.

Wie zuvor mit einem Skalpell, machen Sie einen 1,5 cm langen Einschnitt in der Bauchmitte mit einer Schere. Schneiden Sie das Peritoneum und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem Retraktor, um den auf der linken Seite der Bauchhöhle gelegenen Blinddarm zu lokalisieren und freizulegen. Mit nicht quetschenden Pinzetten nach außen ziehen.

Das Sekum anschließend mit einer 4-0-Seidennaht den distalen 50 % des freigelegten Sekums abbinden. Mit einer 21-Gauge-Nadel das Sekum distal zur Ligatur punktieren. Das Sekum anschließend in die Bauchhöhle zurücklegen.

Verschließen Sie die Bauchwand mit vier sterilen Nylon-Nähten. Anschließend verschließen Sie den Schnitt mit fünf sterilen Nylon-Nähten. Verabreichen Sie 0,5 Milliliter Kochsalzlösung mit 2,5 Mikrogramm Buprenorphin subkutan und führen Sie die postoperative Beobachtung wie zuvor durch.

Die orale Gabe von Tetrachlorkohlenstoff ist ein Modell für eine reaktive Sauerstoffspezies-abhängige Leberschädigung. Tetrachlorkohlenstoff wird mittels oraler Gavage verabreicht, wobei die Maus am Nackenfell („scruff“) gehalten wird und der Kopf vertikal zur Speiseröhre ausgerichtet wird. Danach wird die Spitze einer 22-Gauge-Fütterungs- und Dosierkanüle, die Tetrachlorkohlenstoff enthält, hinter die Schneidezähne eingeführt, in Richtung des Rachenhintergrundes und entlang der Speiseröhre nach unten geleitet, woraufhin der Kolben betätigt wird, um den Tetrachlorkohlenstoff zu verabreichen. Die Maus wird hinsichtlich ihrer Erholung überwacht, wie zuvor beschrieben. Biolumineszenzbilder sollten vor sowie vier und 20 Stunden nach der Induktion der ROS-Produktion aufgenommen werden.

Öffnen Sie hierzu die Software Live Image 4.2. Initialisieren Sie anschließend das IVUS 200-Bildgebungssystem. Klicken Sie auf „Initialisieren“ und stellen Sie das System auf Lumineszenzmodus.

Warten Sie, bis die Temperatur der CCD-Kamera stabilisiert ist, was auf dem Bildschirm in der Software angezeigt wird. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 40 Sekunden ein. Danach stellen Sie den Benning auf mittel und die Blende auf ein Achtel.

Platzieren Sie eine anesthetisierte Maus in die Bildgebungskammer mit der temperaturgeregelten Plattform und bringen Sie sie in Rückenlage. Setzen Sie zwei Minuten vor jeder Bildaufnahme einen Nasenkegel zur Verabreichung der Anästhesie wie zuvor an. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, um 50 Mikroliter des luminalen Derivats L 0 1 2 intravenös zu verabreichen.

Führen Sie eine retroorbitale Injektion durch. Schließlich gewinnen Sie Bilder und analysieren Sie diese, wie beschrieben. Im nächsten Abschnitt des Videos analysieren Sie die gesammelten Daten mithilfe der Living Image Software Version 4.2 in der Software.

Öffnen Sie ein Bild und klicken Sie auf die ROI-Werkzeuge in der Werkzeugpalette. Wählen Sie anschließend im Menü der ROI-Werkzeuge die ROI-Form aus und klicken Sie auf den Kreis in der Dropdown-Liste. Wählen Sie die Anzahl der ROIs aus, die dem Bild hinzugefügt werden sollen.

Passt die Position des interessierenden Bereichs (ROI) über der Brust und/oder dem Abdomen an, um die Signalintensität oder den Photonfluss aus dem interessierenden Bereich im ROI-Werkzeuge-Menü zu quantifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Messen“, um die ROI-Messtabelle zu öffnen, die die Daten für alle in den Bildern erstellten ROIs anzeigt. Verwenden Sie eine statistische Analyse-Software, um eine zweifaktorielle a novo-Analyse mit Bon-Ferone-Post-Test zu den einzelnen Zeitpunkten durchzuführen, um die ROS-Produktion in den Lungen von Wildtyp und N-A-D-P-H-Oxidase-defizienten Tieren zu vergleichen.

P 47 Fox-defiziente Mäuse nach Xan-Behandlung. Xan wurde wie in diesem Video beschrieben zum Zeitpunkt der Grundlinie sowie vier und 24 Stunden danach verabreicht. Die Mäuse wurden wie hier gezeigt abgebildet.

Es zeigte sich eine signifikante Zunahme der Photoemission über der Brust bei Wildtypen, jedoch nicht bei P 47. Fox sno Mäusen, vier und 24 Stunden nach der Gabe im Vergleich zum Ausgangswert. Dies deutet darauf hin, dass die N-A-D-P-H-Oxidase die Hauptquelle der ROS-Generierung in der Lunge nach der XUS Sand-Applikation darstellt.

Als Nächstes wurde die ROS-Produktion im CLP-induzierten Sepsismodell bewertet. Die Sepsis ist ein lebensbedrohliches Syndrom, das mit einer Schädigung von Endorganen einhergeht, einschließlich akuter Lungenschädigung und des akuten respiratorischen Distress-Syndroms. ROS-vermittelte Schäden wurden als wichtiger Faktor angesehen, der die durch Sepsis verursachte Multisystemfunktionsstörung antreibt.

Wie in diesem Diagramm gezeigt, waren die ROS-Werte bei Wildtyp-Mäusen vier Stunden nach CLP über der Brust und 24 Stunden nach CLP über dem Abdomen signifikant erhöht. Bei P 47 Fox null-Mäusen hingegen lagen die ROS-Spiegel zu beiden Zeitpunkten vergleichbar mit den Basiswerten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die ROS-Produktion im durch CLP induzierten Sepsis-Mausmodell von der N-A-D-P-H-Oxidase abhängig ist.

Schließlich wurde eine biolumineszente Bildgebung eingesetzt, um die ROS-Produktion in einem durch Tetrachlorkohlenstoff induzierten Leberschadenmodell nachzuweisen. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Modellen von Entzündung und Verletzung war die ROS-Produktion im Abdomen vier Stunden nach Gabe von Tetrachlorkohlenstoff bei P47phox-defizienten Mäusen nur moderat um etwa 35 % gegenüber dem Grundniveau erhöht. Allerdings war das Ausmaß der durch Tetrachlorkohlenstoff induzierten ROS-Generierung bei Wildtyp-Mäusen signifikant stärker ausgeprägt als bei P47phox-defizienten Mäusen.

Diese Daten deuten darauf hin, dass sowohl P 47 Fox-abhängige als auch unabhängige, von N-A-D-P-H-Oxidase vermittelte ROS-Bildung bei akuter durch Carte-Chlorid induzierter Leberschädigung auftreten. Die Ergebnisse der Biolumineszenz-Bildgebung zeigten erhöhte ROS-Spiegel in Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu P 47-Knockout-Mäusen und wiesen darauf hin, dass die DP-H-Oxidase eine Hauptquelle der RS-Produktion als Reaktion auf einen entzündlichen Reiz ist.

Diese Methode bietet einen minimalinvasiven Ansatz zur Echtzeitüberwachung der RS-Generierung während einer Entzündung in vivo.