Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivierung von RO-spezifischen G-D-P-G-T-P-Austauschfaktoren oder GAFs in kultivierten Zellen zu verfolgen, indem ein mutiertes RO-A-GST-Fusionsprotein mit hoher Affinität für aktivierte Gs verwendet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst das mit GST markierte mutierte Row-Protein in Bakterien hergestellt wird. Anschließend wird das an Kügelchen gekoppelte GST-Row-A gereinigt.

Anschließend wird die Reinheit und Konzentration des GST RO A Proteins mittels SDS-Page überprüft. Schließlich werden Zelllysate hergestellt und ein GEF-Präzipitationsassay mit dem GST RO A Protein durchgeführt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die eine erhöhte Präzipitation des aktivierten GS in behandelten Zellen zeigen, basierend auf der Western-Blot-Analyse der präzipitierten Proteine mit einem spezifischen Anti-GF-Antikörper und Quantifizierung durch Dichtezytometrie.

Mit dieser Methode können eine Reihe spannender Fragen im Bereich der rohen GTPS beantwortet werden, beispielsweise wie die zahlreichen rohen G-D-P-G-T-P-Austauschfaktoren auf signalabhängige Weise reguliert werden und wie ihre Aktivität koordiniert ist. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden anfangs in der Regel Schwierigkeiten haben, da das GST RO G 17 A Protein relativ instabil ist und während der Vorbereitung zerfallen kann. Es ist außerdem wichtig, daran zu denken, den GF-Fällungsassay schnell und konstant durchzuführen. Diese Prozedur wird Pfizer Vahid, ein Masterstudent aus meinem Labor, demonstrieren, um E. coli zu transformieren.

Geben Sie schnell ein Viertel (quart) DH5α-kompetente Zellen in ein Eisbad und fügen Sie 1 µL einer DNA-Lösung mit einer Konzentration von 25 bis 50 ng/µL von pXroA-G17A hinzu. Schlagen Sie leicht auf das Röhrchen, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Erhitzen Sie die Zellen dann 45 Sekunden lang auf 42 °C und stellen Sie sie anschließend für zwei Minuten wieder auf Eis.

Gebe 900 Mikroliter Sock-Medium hinzu und inkubiere eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Mit einer gebogenen sterilen Pasteur-Pipette 50 bis 100 Mikroliter der transformierten Bakterien auf eine zuvor vorbereitete LB-Agar- und Persin-Platte auftragen. Die Platte fünf Minuten lang mit der Oberseite nach oben in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator inkubieren, dann umdrehen und über Nacht weiter inkubieren.

Wählen Sie eine gut isolierte Kolonie transformierter Bakterien aus und verwenden Sie diese, um 50 Milliliter LB mit Ampicillin zu beimpfen. Kultivieren Sie über Nacht bei 37 Grad SIU unter Schütteln. Wenn die Kultur die volle Dichte erreicht hat, verdünnen Sie sie mit 450 Milliliter LB-Ampicillin und kultivieren Sie weitere 30 Minuten. Induzieren Sie bei 37 Grad Celsius die Bakterien zur Produktion des Zielproteins, indem Sie 500 Mikroliter einer 100 Millimolar-IPTG-Lösung zu einer 500-Milliliter-Kultur hinzufügen.

Senken Sie die Temperatur auf 22 bis 24 Grad Celsius und inkubieren Sie etwa 16 Stunden lang. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 3.600 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Gefrieren Sie die Pellets mindestens eine Stunde oder vorzugsweise über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.

Nach der Zubereitung von 200 Millilitern Lysepuffer gemäß dem schriftlichen Protokoll, stellen Sie Lysepuffer plus her, indem Sie 10 Milliliter mit einem Millimolar DTT, einem Millimolar PMSF und einer Proteaseinhibitortablette versetzen und dabei auf Eis arbeiten. Geben Sie 10 Milliliter Lysepuffer plus zu den Thor-Pellets und mischen gründlich durch Pipettieren und Vortexen. Sonizieren Sie die Suspension ein Minute lang auf Eis bei Stufe vier mit 50 % Puls.

Zentrifugieren Sie das Sonikat-Lysat bei 15.000 bis 20.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen Sie das geklärte Sonikat in ein steriles, verschließbares 15-Milliliter-Gefäß. Bereiten Sie die Glutathion-Sphäro-Beads vor, indem Sie die 75 %-ige Suspension vorsichtig mischen und mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser 335 Mikroliter in ein 15-Milliliter-Gefäß übertragen. Geben Sie 10 Milliliter kalte PBS hinzu und zentrifugieren Sie dies bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie das Überstandsmittel. Geben Sie ein Milliliter Lysepuffer plus zu den Kügelchen und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie erneut den Überstand und geben Sie Lysepuffer hinzu.

Plus: Um eine 50 %ige Suspension herzustellen, mischen Sie zwei Portionen à 50 Mikroliter equilibrierte Kugelsuspension mit dem vorbereiteten Überstand. Inkubieren Sie unter Rotation bei vier Grad Celsius für 45 Minuten. Bereiten Sie HBS plus vor, indem Sie 100 Milliliter HBS-Puffer mit fünf Millimolar Magnesiumchlorid und einem Millimolar DTT versetzen. Zentrifugieren Sie den Überstand und die Kugeln bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit 10 Milliliter Lysepuffer plus und zweimal mit 10 Milliliter HBS plus. Nach dem letzten Waschschritt stellen Sie eine 50 %ige Suspension her, indem Sie die Perlen in HBS plus, ergänzt um Proteaseinhibitor, erneut suspendieren. Verdünnen Sie 10 Mikroliter der endgültigen Perlenpräparation mit zweifacher Menge Laemmli-Probelösungspuffer, der Beta-Mercaptoethanol enthält.

Danach drei BSA-Standardproben herstellen, indem jeweils 10 Mikroliter, 5 Mikroliter und dann 2,5 Mikroliter einer zwei Milligramm pro Milliliter umfassenden BSA-Standardlösung mit jeweils 10 Mikrolitern Lammypuffer gemischt werden.

Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang, zentrifugieren Sie sie kurz und führen Sie sie zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel durch. Nach Färbung und Entfärben des Gels schätzen Sie die GST-Row-A-G-17-A unter Verwendung der BSA-Standards als Referenz. Aliquotieren Sie ein gleiches Volumen an Kügelchen, das etwa 10 bis 15 Mikrogramm Protein enthält, in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um den GF-Pull-down-Assay vorzubereiten, züchten Sie die zu verwendenden Zellen bis zur Konfluenz in 10-Zentimeter-Dishs und entziehen Sie ihnen mindestens drei Stunden vor dem Assay das Serum.

Kurz vor Beginn des Assays. Lysisepuffer plus Proteaseinhibitoren auf Eis vorbereiten. Kulturmedium von den Schalen entfernen und mit eiskaltem HBS waschen.

Entfernen Sie sämtliches HBS und geben Sie 700 Mikroliter Lysepuffer plus zu jeder Platte hinzu. Benetzen Sie die Platten, um alle Bereiche zu bedecken.

Anschießend die Lysate abkratzen und in nummerierte 1,5-Milliliter-Röhrchen sammeln. Eine Minute bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand für den Nachweis aufbewahren; sofern die Zellzahl in jeder Platte äquivalent war, jeweils 30 µL des Überstands entnehmen und mit 30 µL zweifach konzentriertem reduzierendem Lämmli-Probe-Puffer mischen.

Anschließend aufkochen und auf Eis beiseitegestellt. Die verbleibenden Überstände zu Aliquots der GST-Reihe a G 17 A-Kügelchen hinzufügen und 45 Minuten bei vier Grad Celsius rotieren lassen. Die Kügelchen bei 6.800 ×g für 10 Sekunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Lysepuffer. Mit einer 1-ml-Spritze, die mit einer Nadel der Stärke 30 ausgestattet ist, vollständig den letzten Waschschritt entfernen und 20 Mikroliter zweifach konzentriertes reduzierendes Laemmli-Probe-Puffer hinzufügen. Die Proben fünf Minuten lang kochen, kurz zentrifugieren, um die Kügelchen zu pelletieren, und anschließend die gesamten Zelllysate sowie die präzipitierten Proteinproben auf einem SDS-PAGE-Gel mit der für die untersuchte GF geeigneten prozentualen Konzentration auftrennen.

Schließlich führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um den relevanten GFA nach einem erfolgreichen GF-Assay nachzuweisen. Der Nachweis der Aktivierung des Austauschfaktors GFH1 wird hier gezeigt. Das Protein G17A in Reihe A bindet etwas GFH1 aus den Kontrollzelllysaten, was darauf hindeutet, dass GFH1 eine basale Aktivität besitzt.

Die ausgefällte Menge stieg jedoch in Zellen an, die mit dem entzündlichen Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor alpha behandelt wurden, was der Vorstellung entspricht, dass TNF alpha G FH eins aktiviert. Wichtig ist, dass das Gesamtzelllysat ähnliche Mengen an gfh eins in der Kontrolle und der behandelten Probe zeigt, was darauf hindeutet, dass die Behandlung die G FH-eins-Spiegel nicht veränderte und dass die im Assay verwendete Menge gleich war. Bei der Anpassung dieses Verfahrens ist es wichtig, das GSE RO G 17 A-Protein und die CELLIS eights auf Eis zu halten.

Führen Sie den GF-Assay schnell und konsistent durch und verwenden Sie geeignete positive Kontrollen, die eine Ungültigklärung und Fehlerbehebung ermöglichen.