Name: Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Lernen Sie die Affinitätsfällung aktiver Rho-GEFs aus Epithelzelllysaten mit einem GST-markierten RhoA-Mutantenprotein. Diese Methode ermöglicht die spezifische Detektion und Quantifizierung aktivierter GEFs mittels Western Blot.

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Diese Arbeit wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) (MOP-97774) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada (: 480619 NSERC, Zuschuss nr) finanziert. KS ist ein Empfänger einer KRESCENT New Investigator Award (ein Joint Verleihung des Kidney Foundation von Kanada, kanadische Gesellschaft Nephrologie und kanadischen Institute of Health Research) und einer frühen Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation. FW wird von einem Li Ka Shing Stipendium unterstützt.

1. Transformation von E. coli mit dem pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Bereiten LB-Agar durch Auflösen von 2,5 g und 1,5 g LB-Agar in 100 ml dH 2 O. Autoklaven und kühlen auf geschätzte 50-55 ° C, die als Faustregel gilt, ist, wenn die Flasche bequem gehalten werden kann. </li><li> Bereiten Ampicillin (Amp) Lager durch Auflösen von 50 mg / ml in dH 2 O. Spritzenfilter und frieren Aliquots ungenutzt. Fügen Sie 100 ul Amp Lager (Endkonzentration 50 ug / ml) auf die LB-Agar vom 1.1. Swirl zu mischen und gießen Sie in 10 cm bakterielle Gerichte (15-20 ml / Schale). Erlauben zu verfestigen (15-30 min.) Und Lagerung unbenutzter Platten bei 4 invertiert ° C für 2-3 Wochen. </li><li> Um E. Transformation Coli, schnell aufgetaut eines Aliquots DH5a kompetenten Zellen in einem Eisbad. Fügen Sie 1 ul pGEXRhoA (G17A) DNA verdünnt auf 25-50 ng / ul. Flick das Rohr zu mischen und auf Eis für 30 Minuten inkubieren. Hitzeschock bei 42 ° C für 45 Sekunden und Platz zurück auf Eis für 2 Minuten. Zusatz von 900 mu &amp;; L SOC-Medium wachsen und für eine Stunde bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Verteilt 50-100 ul der transformierten Bakterien auf einer LB-Agar-Amp Platte mit einem abgewinkelten sterilen Pasteurpipette. Inkubieren Sie die Platte wieder richtig herum in einem 37 ° C Inkubator für 5 Minuten und dann invertieren und über Nacht wachsen. </li><li> Eine einzelne Kolonie von der Platte wird zur Herstellung des GST-markierte Protein (Schritt 2.1) aufgenommen werden kann. Für die zukünftige Verwendung, wickeln und lagern Platten bei 4 ° C für ca. 3 Wochen invertiert. Darüber hinaus können Bakterienstämme mehr langfristiger Lagerung wachsenden einzelnen Kolonien in 2 ml sterilem LB-Amp über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln hergestellt werden. Mischen Sie einen aliquoten mit sterilem 80% Glycerin im Verhältnis 1:1 und einfrieren bei -80 ° C </li></ol> 2. Vorbereitung der GST-RhoA (G17A) Perlen <ol><li> Bereiten LB durch Zugabe von 25 g auf 1 L LB dH 2 0 und Autoklavieren. Beim Abkühlen werden 50 pl Amp ab Lager bis 50 ml LB (50 mu g / ml Endkonzentration). Impfen mit einem gut isolierten colony der transformierten Bakterien wachsen bei 37 ° C über Nacht unter Rühren. Wenn bei voller Dichte (OD 600&gt; 1,0) mit 450 ml LB-Amp verdünnen und zu wachsen für weitere 30 Minuten bei 37 ° C </li><li> Vorbereiten einer 100 mM Stammlösung von Isopropyl BD-thiogalactopyranosid (IPTG) durch Auflösen von 0,238 g in 10 ml dH 2 O Shop in Aliquots bei -20 ° C. Induzieren Bakterien Rho-Protein durch Zugabe von 500 ul 100 mM IPTG bis zu 500 ml-Kultur (eine Endkonzentration von 100 pM) zu erzeugen. Absenken der Temperaturen auf 22-24 ° C wachsen und für ~ 16 h Stunden. </li><li> Spin Kultur bei 3600 g für 10 Minuten bei 4 ° C Bei Bedarf können die 500 ml Kultur in 50 ml Röhrchen für Zentrifugation aufgeteilt werden. Freeze-Pellet (e) für mindestens 1 Stunde (oder am besten über Nacht) bei -80 ° C </li><li> Planen 200 ml Lyse-Puffer enthaltend 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl 2 (0,203 g), 1% TX-100 (2 ml). Stammlösungen hergestellt von 1M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O) Und 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Um Lysepuffer + Vorbereitung, Ergänzung mit 10 ml 1 mM DTT (10 ul der Vorrat reicht) und 1 mM PMSF (100 ul der Vorrat reicht) und ein komplettes Mini Protease Inhibitor Tablette. </li><li> Arbeiten auf Eis, 10 ml Lysepuffer + zu den Pellets aus Schritt 2.3. Resuspendieren durch vorsichtiges Vortexen und Pipettieren. Schaumbildung vermeiden. Mit Ultraschall auf Eis für 1 Minute bei Einstellung 4 mit 50% Puls. Drehen Sie das beschallte Lysat bei 15.000-20.000 g für 15 Minuten bei 4 ° C, und entfernen Sie das geklärt Sonifikat (Überstand) in ein steriles 15 ml Tube verschlossen. </li><li> Bereiten Sie die Glutathion-Sepharose durch vorsichtiges Mischen der ursprünglichen Röhrchen, das eine 75% Gülle und Transfer 335 ul in eine 15 ml Tube. Verwenden Sie eine breite Bohrung Spitze, Perlen pipettieren. 10 ml kaltem PBS, und Spin 500 g für 5 Minuten bei 4 ° C Überstand verwerfen, 1 ml Lysepuffer + an die Beads und Spin wie bei früheren waschen. Überstand verwerfen und Add-Lysepuffer + eine 50% ige Aufschlämmung herzustellen. </li><li> Fügen Sie 250 ul Equilibrated Kügelchenaufschlämmung zu dem Überstand aus Schritt 2.5. Drehen bei 4 ° C für 45 Minuten. </li><li> Planen 500 ml HBS, enthaltend 20 mM HEPES (2,38 g) / pH 7,5 und 150 mM NaCl (4,38 g) in dH 2 O Bereiten Stammlösungen 1 M MgCl 2 (0,952 g in 10 ml dH 2 O) und 1 M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O). Um HBS + vorbereiten, ergänzen 100 ml kurz vor Gebrauch mit 5 mM MgCl 2 (50 ul ab Lager lieferbar) und 1 mM DTT (100 ul ab Lager). </li><li> Drehen der Kügelchen aus Schritt 2,7 bei 500 g für 5 Minuten bei 4 ° C Verwerfen des Überstandes und Waschen Perlen 2x mit 10 ml Lysepuffer + und 2x mit 10 ml HBS +. Nach dem letzten Waschen, eine 50% ige Aufschlämmung durch Resuspendieren der Kügelchen in HBS + BD mit BaculoGold Protease-Inhibitor (20 ul 50x BD BaculoGold / ml) ergänzt. </li><li> Verdünnen Sie 10 ul der abschließenden Vorbereitung Perlen mit 2x Laemmli-Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol. Make Rinderserumalbumin (BSA)-Standards. Verwenden Sie ein 2 mg / ml Stammlösung (0,02 g BSA in 10 ml dH 2 O). Mischen Sie 10 ul Lager mit 10 ul Laemmli (20 ug endg.); 5 ul Lager mit 5 &amp;mgr; l dH 2 O und 10 ul Laemmli (10 ug endg.); und 2,5 ul Lager mit 7,5 ul dH 2 O und 10 ul Laemmli (5 ug endg.). Kochen Sie alle Proben (5 min). Drehen des Wulstes Probe und ausgeführt Überstand mit BSA-Standards und Molekulargewichtsmarker auf einem 10% SDS-Polyacrylamid-Gel. </li><li> Bereiten Sie die Coomassie Blau-Färbung (0,1 g in 10 ml Essigsäure, 40 ml Methanol und 50 ml dH 2 O) und der Entfärber-Lösung (500 ml dH 2 O, 400 ml Methanol und 100 ml Essigsäure). Lagerung bei Raumtemperatur. Färben des Gels für 20-30 Minuten, entfernen Sie den Farbstoff (es können mehrere Male wiederverwendet werden) und spülen Sie mit entfärben Lösung zweimal. Fahren Sie mit unter leichtem Schütteln für mehrere Stunden entfärben, bis Banden deutlich sichtbar sind. </li><li> Schätzen Sie die Konzentration von GST-RhoA (G17A) gekoppelt an die Beads mit den BSA-Standards als Referenz (Abb. 2). Aliquot ein gleiches Volumen an Kügelchen, ~ 10-15 ug Protein in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Shop Kügelchen bei 4 ° C innerhalb eines Tages zu verwenden. Einfrieren bei -80 ° C in HBS + / Glycerin im Verhältnis 3:1 bis auf wenige Tage zu benutzen. </li></ol> 3. GEF-Pulldown Assay mit Nukleotid-freien RhoA (G17A) Perlen <ol><li> Wachsen Zellen in 10 cm Schalen bis zur Konfluenz. Serum für mindestens 3 Stunden zu berauben und zu behandeln, als erforderlich. </li><li> Planen Lysepuffer + wie in Schritt 2.4. Bereiten Sie genug Lysepuffer für 700 ul / Schale plus einige zusätzliche Betrag, der für Pipettierfehlern ermöglichen. In der Protease-Inhibitoren unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Arbeiten auf Eis, entfernen Kulturmedium aus dem Geschirr zu waschen und mit eiskalter HBS. Entfernen Sie alle HBS und fügen Sie 700 ul Lysepuffer + zu jedem Gericht. Swirl Platten, um alle Bereiche abzudecken, kratzen und zu sammeln Lysate in nummerierte 1,5 ml Röhrchen. Zentrifugieren bei 15.000 g für 1 min bei 4 ° C Der Überstand wird für den Assay verwendet werden. </li><li> Wenn Ihr Handy die Nummer ist gleichwertig in allenGerichte getestet wird, kann man auch tun, eine Protein-Assay, und bewegen bis 3,5 Schritt. Andernfalls Messung der Proteinkonzentration von jedem Überstand unter Verwendung von Bio-Rad Protein Assay praktischen und Ausgleichen der Überstand für Volumens und der Konzentration. Die Menge des gesamten Proteins hängt von den Zelltypen verwendet werden (typischerweise 1-1,5 mg Protein für LLC-PK1-Zellen). </li><li> Entfernen Sie 30 ul von jedem Überstand und mischen sich mit 30 ul 2x Laemmli-Probenpuffer reduziert, aufkochen und beiseite stellen für Schritt 3.7. Die restlichen Überstände Aliquots der GST-RhoA (G17A) Kügelchen aus Schritt 2.12. Drehen für 45 Minuten bei 4 ° C </li><li> Spin Kügelchen bei 6800 g für 10 Sekunden bei 4 ° C Verwerfen des Überstandes und Waschen der Kügelchen 3x mit Lysepuffer, Spinning in der gleichen Weise zwischen Wäschen. Entfernen Sie den letzten Waschen unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit einer 30 G Nadel ausgestattet und mit 20 ul 2x Laemmli-Probenpuffer reduziert. Kochen für 5 min. Spin zu Pellet-Beads und entweder den Überstand sofort (bevorzugt) oder lagern Sie es eint -80 ° C für eine spätere Analyse. </li><li> Führen Sie 20 ul insgesamt Zelllysaten und alle der gefällten Proteinproben auf den entsprechenden Prozentsatz SDS-Polyacrylamidgel für die Größe der GEF Sie studieren. Erkennen Sie Ihre GEF der Wahl durch Western-Blot unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Teil 1 und 2 des Protokolls beschreibt die Herstellung von GST-RhoA (G17A), die mit GSH-Sepharose-Kügelchen und ihre Prüfung durch SDS-PAGE (siehe Gliederung des Protokolls auf Abb. 1). Eine typische Coomassie-gefärbten Gel wird auf 2 gezeigt. Die Probe mit dem eluierten Protein sollte eine einzelne Bande bei etwa 50 kDa (Abb. 2, Spur 6) enthalten. Die Konzentration des Proteins kann unter Verwendung der BSA Referenzproben werden. Im Beispiel Abb. 2, wird die Konzentration von RhoA (G17A) auf etwa 15 μg/10 ul sein. So wurden Aliquots von 10 ul / Röhrchen vorbereitet. Die typische Ausbeute<html> in unserer Hand liegt bei 15-20 ug Protein aus 10 ml Lyse der Bakterien. Teil 3 des Protokoll beschreibt die Affinität Präzipitationsassay (siehe Übersicht auf Abb. 1). Ein erfolgreicher Test GEF Erkennen der Aktivierung des Austauschs Faktor GEF-H1 ist auf Abb. 3 dargestellt. Die RhoA (G17A) Protein erfasst eine GEF-H1 von der Kontrolle (unbehandelt) Zelllysate, was darauf hindeutet, dass GEF-H1 basale Aktivität aufweist. Der Betrag fällt jedoch Erhöhungen der Zellen mit der inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden, im Einklang mit der Vorstellung, dass TNF-α GEF-H1 5,7 aktiviert. Wichtig ist, zeigen die gesamten Zelllysate ähnliche Mengen GEF-H1 in der Kontrolle und der behandelten Probe, was darauf hindeutet, dass die Behandlung nicht verändert GEF-H1 Ebenen und der Eingang in dem Assay verwendet wird, gleich. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> 1. Übersicht des Protokolls. ove_content &quot;&gt; <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis der Raupe Vorbereitung Protokoll. Ein Coomassie gefärbtes Gel mit erfolgreichen GST-RhoA (G17A) Perle Vorbereitung gezeigt. Perle Probe und BSA-Protein Standards wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 10% Acrylamid-Gel aufgetrennt. Um die Perlen zu testen, wird 10 ul der abschließenden Kügelchenaufschlämmung mit GST-RhoA (G17A) 1:1 mit reduzierenden Laemmli-Probenpuffer und für 5 Minuten gekocht verdünnt. Die Kügelchen wurden kurz zentrifugiert der Überstand auf das Gel aufgetragen. Die folgenden Proben wurden geladen: Spur 1: Molekulargewichtsmarker (MW) (FroggaBio Blueye vorgefärbt Protein Leiter); Lanes 2-4: 5, 10 und 20 ug Bovine Serum Albumin (BSA); Spur 5 ist leer; Spur 6: 10 ul der frisch zubereiteten RhoA (G17A) Perlen. Nach der Trennung abgeschlossen ist, wird das Gel gefärbt mit Coomassie-Blau angefärbt und anschließend an Proteine ​​zu offenbaren. Das Molekulargewicht des GST-RhoA (G17A)-Protein ist etwa 50<html> kDa und läuft auf dem Niveau des 48 kDa-Marker. Die Konzentration des GST-Rho-Protein in diesem besonderen Beispiel wird auf etwa 15 μg/10 ul Aufschlämmung vorliegen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter GEF-Aktivierungs-Assay zeigt TNF-α-induzierte Aktivierung von GEF-H1. Konfluente LLC-PK1-Zellen wurden mit 10 ng / ml TNF-α für 5 Minuten behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen lysiert und aktive GEFs erfasst wurden unter Verwendung von GST-RhoA (G17A) gebundenen Perlen. Die Anwesenheit von GEF-H1 in der ausgefällten Proteine ​​(oben Blot) und Ganzzelllysat Proben (unten Blot) wurde unter Verwendung Western-Blot mit einem Anti-GEF-H1-Antikörper (Cell Signaling). Bitte beachten Sie die erhöhte Menge an ausgefallenen GEF-H1 im Vergleich zu nicht behandelten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden TNF-α-Eingänge behandelt, was auf ein erfolgreiches Ergebnis. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Ein &quot;schlechtes Ergebnis&quot;. Obwohl die GEF Pulldown-Assay hier in Folge irgendeiner GEF-H1 von den Kügelchen eingefangen gezeigt, die ausgefallenen Mengen von Steuerung und TNF-α-behandelten Zellen gleich sind. TNF-α So hat ein Know-Aktivator von GEF-H1 in diesem Fall nicht induzieren die Aktivierung. In diesem speziellen Experiment späteren Fehlersuche vorgeschlagen, dass die TNF-α verwendet nicht frisch genug und wahrscheinlich verschlechtert.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellte Methode ist die einzige verfügbare nicht-radioaktive Aktivierungs-Assay für GEFs, die den aktiven Pool von GEFs in Zellen folgen können. Der Test ist ähnlich wie die Ausfällung Assays für folgende Aktivierung der kleinen GTPasen sowie GEFs gegen Rac und Cdc42 verwendet. Diese Assays verwenden verschiedenen GST-markierte Proteine ​​und leichte Unterschiede bei den hier beschriebenen, aber die grundlegenden Schritte sind die gleichen. Somit ist dieses Protokoll leicht für andere GTPase und GEF Aktivierungsassays angepasst werden. Das vorgestellte GEF-Assay wurde kürzlich für den Antrag auf Kernfraktionen 9,10 geändert. Mit weiteren Modifikationen könnte Testen von GEF Aktivierung in anderen subzellulären Kompartimenten auch möglich. Wir verwenden die Methode vorgestellt, um die Aktivierung von GEFs in epithelialen Zelllinien 5,6,7 studieren. Mit ein wenig Optimierung, sollte dieser Test ausreichend sein, um von einem beliebigen GEFs Zelllinie zu erkennen. Wenn adapting zu einem bestimmten Zelltyp, finden Sie die optimale Zellzahl, Volumen Lysepuffer und Nachweisverfahren für das GEF zu prüfen (eine gute Antikörper für Western-Blot ist wichtig). Bei der Ersteinrichtung des Assays ist es ratsam, einen Reiz, der bekanntlich die GEF von Interesse zu aktivieren verwenden. Bei Verwendung eines unbekannten Reiz, immer mit einem Positiv-Kontrolle zu überprüfen, ob Ihr Test funktioniert. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Aktivierung von bekannten GEFs durch Western-Blotting nachzuweisen. Es ist jedoch auch geeignet, um unbekannte GEFs identifizieren. Zu diesem Zweck sollte festgehalten GEFs von Kontrolle und stimulierten Proben auf einem mit Coomassie-gefärbten Gel analysiert werden. Bands, die nur in stimulierten Proben erscheinen, enthalten möglicherweise aktiviert GEFs und können für die Identifizierung durch Massenspektrometrie (zB 5) gesendet werden. Schließlich wird ein Warnhinweis. Der Assay basiert auf der Annahme, dass die posttranslationale Modifikationen machen GEFs aktiv nach Zelllyse bleiben erhalten basiert. Tatsächlich ist dies eindeutig der ca.sich für eine Reihe von GEFs, und da die Betriebe, hat dieser Assay von verschiedenen Gruppen verwendet worden, um die Aktivierung unterschiedlicher GEFs, einschließlich GEF-H1, p115RhoGEF und XPLN (zB 5,11,12,13) ​​zu erfassen. Die Erhaltung des aktiven Zustand jedoch möglicherweise nicht bei allen GEFs passieren, und daher ist es denkbar, dass dieser Test nicht für alle GEFs arbeiten. Es muss auch angemerkt werden, dass viele GEFs Aktivität auszuüben zu mehr als einem kleinen GTPasen. Wenn also eine spezifische GEF studiert wird, wird empfohlen, diesen Test mit GEF Niederschlag Assays für andere kleine GTPasen, sowie funktionelle Studien, RhoA, Rac1 und Cdc42 zu ergänzen. Kritische Schritte in dem Protokoll: Kolonien von transformierten Bakterien sollte aus frischen, gut vorbereitet Platten abgeholt werden, um eine angemessene Auswahl von Amp, gute Auswuchs und Ertrag zu gewährleisten. Voraussetzungen für die Transformation kompetenter Zellen von anderen Herstellern stammen können variieren und sollte konsultiert werden. </p&gt; Alle Schritte des Proteins Herstellung Protokoll (aus Schritt 2.3) und der Assay (aus Schritt 3.2) bei 4 ° C mit kalten Lösungen und Zentrifugen durchgeführt werden. Bakterienlyse (Schritt 2.5) sollte gründlich und vollständig, um eine homogene Suspension zu erhalten. Wenn Lysieren der Bakterien, Wirbel und das Lysat pipettieren abwechselnd unter Halten desselben bei 4 ° C und sicherzustellen, Ultraschallbehandlung auf Eis zu verhindern Denaturierung des Proteins erfolgt. Wenn Sie ein anderes Modell des Ultraschallgeräts kann Bedingungen angepasst werden müssen. Die Inkubation von Sonifikat mit den Kügelchen sollten immer bei 4 ° C auf einem Rotator getan werden, um eine ausreichende Bindung zu gewährleisten, und darauf zu halten das Timing in Einklang gebracht werden. GST-Rho-Mutanten sind etwas instabil, wenn sie in Bakterien exprimiert, so ist es am besten vorbereiteten Perlen sofort oder innerhalb weniger Tage zu verwenden. Die Präzipitationsassay (Teil 3) ist an der Zeit und Temperatur empfindlich, einAktive GEFs leicht aus dem Zelllysat verloren, sollte so Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Der folgende Abschnitt enthält einige Hinweise zur Fehlersuche. Keine oder nur sehr geringe Menge des mutierten Proteins Rho in der endgültigen Herstellung Wulst: Dies kann durch eine ineffiziente Induktion, unzureichend Lyse der Bakterien, oder ein Verlust des Proteins während des Herstellungsverfahrens oder Lagerung verursacht werden. Zur Behebung einiger dieser Möglichkeiten können Proben von Bakterien vor und nach der Induktion analysiert werden. Wenn es schlechte Induktion des Proteins wiederholen Sie den Vorgang mit einer Kolonie von einer frisch ausgestrichenen Platte oder aus Re-transformierte kompetente Zellen. Verschiedene IPTG-Konzentrationen und Induktionszeiten sollte auch getestet werden. Wenn die Lyse unzureichend ist (dh das Protein bleibt in der Pellet anstelle der Überstand) Variieren Salz und Detergenzkonzentrationen im Lysepuffer versucht werden. Alternate Beschallung Zeiten undEinstellungen sollten berücksichtigt werden, und die Proben vor und nach der Beschallung kann mittels Mikroskopie überprüft werden, um die Effizienz der Lyse zu bestimmen. Nr. ausgefällt GEF, obwohl das GST-Protein, das auf den Kügelchen ist: Dies kann aufgrund von technischen Problemen während der Fällung Assay oder durch eine reale Abwesenheit der Aktivierung des untersuchten GEF mit dem Stimulus. Verwenden Sie immer ein Stimulus bekannt als Positiv-Kontrolle zu überprüfen, ob Ihr Test funktioniert. Verwenden Sie die vorbereiteten Perlen innerhalb von wenigen Tagen. Wenn der Niederschlag Assay erfasst nicht nachweisbare Mengen des GEF unter allen Bedingungen untersucht, ob Ihr GEF vorhanden ist, und ist gut erkennbar in der Überstand nach Zentrifugation, die für den Test (Schritt 3.3) verwendet werden soll. Achten Sie darauf, alle Puffer und Protease-Inhibitoren sind frisch, und alle Schritte auf dem Eis so schnell wie möglich. Erhöhen Sie die Menge an Protein-Eingang (zB durch Verwendung von Lysaten von 2 Platten / Probe). Wenn der Niederschlag Assay zeigt basalen Niederschlägenzung Ihrer GEF, aber keinen Unterschied zwischen der Kontrolle und stimulierten Proben (Abb. 4) zu sehen, starten Fehlersuche durch die Überprüfung, dass die eingesetzten Stimulus mit anderen bekannten Effekte (z. B. durch den Nachweis Aktivierung anderer Signalwege) gearbeitet. Erwägung ziehen, den Behandlungsbedingungen und / oder Konzentrationen. Verlassen Sie sich auf Daten aus der Literatur, wie Ihre Berichterstattung Stimulus Rho oder andere Signalisierung aktiviert, um wahrscheinlich Zeiten und Konzentrationen vorherzusagen. Bei der Optimierung der Behandlungszeit, verwenden sowohl kurze und lange Zeit Punkte, wie GEF Aktivierung wahrscheinlich das Beste, nachweisbar zu einem Zeitpunkt vor gut nachweisbar Rho-Aktivierung. Schließlich könnte der gleiche Reiz in einem variablen Grad der Aktivierung aufgrund einer Änderung in Zelle Reaktionsfähigkeit durch den Durchgang Nummer verursacht, Zellkonfluenz, etc. führen

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Wird bald verfügbar sein </td><td> Erstellt im Labor von Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (Ref. 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Shop -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC-Medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Shop Lager bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (IsoPropyl BD-thiogalactopyranosid) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion-Sepharose-Kügelchen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr&gt; <td> Kompletter Mini, EDTA-free 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> 2x Laemmli-Probenpuffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Blueye Leiter </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Name der Ausrüstung </td><td> Firma </td&gt; <td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> RC-5B-Zentrifuge </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Micro-Zentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Bakterielle Schüttler </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Verwendung bei 37 ° C oder bei 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Verwenden Sie bei RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Besondere Einrichtungen verwendet.

affinity niederschlag von active rho-gefs mit hilfe eines gst-markiertes mutant rho-protein (gst-rhoa (g17a)) aus epithelialen zelllysate

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Die Proteine ​​der Rho-Familie kleiner GTPasen sind zentrale Regulatoren des Zytoskeletts und steuern eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellwanderung, Genexpression, Zellzyklus-Progression und Zell-Adhäsion ein. Rho-Proteine ​​sind molekulare Schalter, die aktiv sind in GTP-gebundenen und inaktiv im GDP-gebundenen Zustand. Ihre Aktivierung wird von einer Familie der Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor (GEF) vermittelt wird. Rho-GEFs bilden eine große Familie, mit überlappenden Spezifitäten 2. Obwohl viele Fortschritte bei der Identifizierung der GEFs durch bestimmte Signale aktiviert worden sind, gibt es noch viele Fragen in Bezug auf die restlichen Weg-spezifische Regulation dieser Proteine. Die Anzahl der Rho-GEFs über 70, und jede Zelle exprimiert mehrere GEF Protein. Zudem aktivieren viele dieser Proteine ​​nicht nur Rho, aber andere Mitglieder der Familie und trägt zu der Komplexität der regulatorischen Netzwerke. Wichtig ist, erkundenwie GEFs geregelt erfordert eine Methode, um den aktiven Pool von einzelnen GEFs in Zellen durch verschiedene Stimuli aktiviert folgen. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine Methode verwendet, um zu bewerten und zu quantifizieren, die zur Verfügung stehenden aktive Rho-spezifischen GEFs mit einer Affinität Präzipitationsassay. Dieser Test wurde vor ein paar Jahren im Labor Burridge 3,4 entwickelt und wir haben es in der Niere röhrenförmigen Zelllinien 5,6,7 verwendet. Der Assay nutzt ein &quot;Nukleotid frei&quot; Mutante RhoA, mit einer hohen Affinität für aktive GEFs. Die Mutation (G17A) macht das Protein zu binden, nicht in der Lage GDP oder GTP und dieser Zustand ahmt den Zwischenzustand, die mit dem GEF gebunden ist. Ein GST-getaggte Version dieses mutierte Protein wird exprimiert und gereinigt aus E. coli, gebunden an Glutathion-Sepharose-Kügelchen und zur Fällung von aktiven GEFs aus Lysaten von unbehandelten und stimulierten Zellen. Da die meisten GEFs werden über posttranslationale Modifikationen oder Entlassung aus hemmenden Bindungen, ihren aktiven Zustand aktiviertwird in Zelllysaten erhalten, und sie können durch diesen Test 8 erkannt werden. Gefangen Proteine ​​können für bekannte GEFs sondiert werden durch Detektion mit spezifischen Antikörpern unter Verwendung von Western-Blotting oder durch Massenspektrometrie analysiert, um unbekannte GEFs durch bestimmte Stimuli aktiviert zu identifizieren.

Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt ein Assay zur spezifischen Aktivierung von RhoA GDP / GTP (GEFs) in kultivierten Zellen unter Verwendung eines mutierten RhoA GST-Fusionsprotein, das eine hohe Affinität für aktiviert GEFs hat folgen. GEFs aus Zelllysaten durch Western-Blotting und quantifiziert durch Densitometrie erkannt ausgefällt.

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

Proteine der Rho-Familie der kleinen GTPasen sind zentrale Regulatoren des Zytoskeletts und steuern eine Vielzahl zellulärer Prozesse, einschließlich der Zell...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivierung von RO-spezifischen G-D-P-G-T-P-Austauschfaktoren oder GAFs in kultivierten Zellen zu verfolgen, indem ein mutiertes RO-A-GST-Fusionsprotein mit hoher Affinität für aktivierte Gs verwendet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst das mit GST markierte mutierte Row-Protein in Bakterien hergestellt wird. Anschließend wird das an Kügelchen gekoppelte GST-Row-A gereinigt.Anschließend wird die Reinheit und Konzentration des GST RO A Proteins mittels SDS-Page überprüft. Schließlich werden Zelllysate hergestellt und ein GEF-Präzipitationsassay mit dem GST RO A Protein durchgeführt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die eine erhöhte Präzipitation des aktivierten GS in behandelten Zellen zeigen, basierend auf der Western-Blot-Analyse der präzipitierten Proteine mit einem spezifischen Anti-GF-Antikörper und Quantifizierung durch Dichtezytometrie.Mit dieser Methode können eine Reihe spannender Fragen im Bereich der rohen GTPS beantwortet werden, beispielsweise wie die zahlreichen rohen G-D-P-G-T-P-Austauschfaktoren auf signalabhängige Weise reguliert werden und wie ihre Aktivität koordiniert ist. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden anfangs in der Regel Schwierigkeiten haben, da das GST RO G 17 A Protein relativ instabil ist und während der Vorbereitung zerfallen kann. Es ist außerdem wichtig, daran zu denken, den GF-Fällungsassay schnell und konstant durchzuführen. Diese Prozedur wird Pfizer Vahid, ein Masterstudent aus meinem Labor, demonstrieren, um E. coli zu transformieren.Geben Sie schnell ein Viertel (quart) DH5α-kompetente Zellen in ein Eisbad und fügen Sie 1 µL einer DNA-Lösung mit einer Konzentration von 25 bis 50 ng/µL von pXroA-G17A hinzu. Schlagen Sie leicht auf das Röhrchen, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Erhitzen Sie die Zellen dann 45 Sekunden lang auf 42 °C und stellen Sie sie anschließend für zwei Minuten wieder auf Eis.Gebe 900 Mikroliter Sock-Medium hinzu und inkubiere eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Mit einer gebogenen sterilen Pasteur-Pipette 50 bis 100 Mikroliter der transformierten Bakterien auf eine zuvor vorbereitete LB-Agar- und Persin-Platte auftragen. Die Platte fünf Minuten lang mit der Oberseite nach oben in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator inkubieren, dann umdrehen und über Nacht weiter inkubieren.Wählen Sie eine gut isolierte Kolonie transformierter Bakterien aus und verwenden Sie diese, um 50 Milliliter LB mit Ampicillin zu beimpfen. Kultivieren Sie über Nacht bei 37 Grad SIU unter Schütteln. Wenn die Kultur die volle Dichte erreicht hat, verdünnen Sie sie mit 450 Milliliter LB-Ampicillin und kultivieren Sie weitere 30 Minuten. Induzieren Sie bei 37 Grad Celsius die Bakterien zur Produktion des Zielproteins, indem Sie 500 Mikroliter einer 100 Millimolar-IPTG-Lösung zu einer 500-Milliliter-Kultur hinzufügen.Senken Sie die Temperatur auf 22 bis 24 Grad Celsius und inkubieren Sie etwa 16 Stunden lang. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 3.600 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Gefrieren Sie die Pellets mindestens eine Stunde oder vorzugsweise über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.Nach der Zubereitung von 200 Millilitern Lysepuffer gemäß dem schriftlichen Protokoll, stellen Sie Lysepuffer plus her, indem Sie 10 Milliliter mit einem Millimolar DTT, einem Millimolar PMSF und einer Proteaseinhibitortablette versetzen und dabei auf Eis arbeiten. Geben Sie 10 Milliliter Lysepuffer plus zu den Thor-Pellets und mischen gründlich durch Pipettieren und Vortexen. Sonizieren Sie die Suspension ein Minute lang auf Eis bei Stufe vier mit 50 % Puls.Zentrifugieren Sie das Sonikat-Lysat bei 15.000 bis 20.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen Sie das geklärte Sonikat in ein steriles, verschließbares 15-Milliliter-Gefäß. Bereiten Sie die Glutathion-Sphäro-Beads vor, indem Sie die 75 %-ige Suspension vorsichtig mischen und mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser 335 Mikroliter in ein 15-Milliliter-Gefäß übertragen. Geben Sie 10 Milliliter kalte PBS hinzu und zentrifugieren Sie dies bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie das Überstandsmittel. Geben Sie ein Milliliter Lysepuffer plus zu den Kügelchen und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie erneut den Überstand und geben Sie Lysepuffer hinzu.Plus: Um eine 50 %ige Suspension herzustellen, mischen Sie zwei Portionen à 50 Mikroliter equilibrierte Kugelsuspension mit dem vorbereiteten Überstand. Inkubieren Sie unter Rotation bei vier Grad Celsius für 45 Minuten. Bereiten Sie HBS plus vor, indem Sie 100 Milliliter HBS-Puffer mit fünf Millimolar Magnesiumchlorid und einem Millimolar DTT versetzen. Zentrifugieren Sie den Überstand und die Kugeln bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit 10 Milliliter Lysepuffer plus und zweimal mit 10 Milliliter HBS plus. Nach dem letzten Waschschritt stellen Sie eine 50 %ige Suspension her, indem Sie die Perlen in HBS plus, ergänzt um Proteaseinhibitor, erneut suspendieren. Verdünnen Sie 10 Mikroliter der endgültigen Perlenpräparation mit zweifacher Menge Laemmli-Probelösungspuffer, der Beta-Mercaptoethanol enthält.Danach drei BSA-Standardproben herstellen, indem jeweils 10 Mikroliter, 5 Mikroliter und dann 2,5 Mikroliter einer zwei Milligramm pro Milliliter umfassenden BSA-Standardlösung mit jeweils 10 Mikrolitern Lammypuffer gemischt werden.Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang, zentrifugieren Sie sie kurz und führen Sie sie zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel durch. Nach Färbung und Entfärben des Gels schätzen Sie die GST-Row-A-G-17-A unter Verwendung der BSA-Standards als Referenz. Aliquotieren Sie ein gleiches Volumen an Kügelchen, das etwa 10 bis 15 Mikrogramm Protein enthält, in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um den GF-Pull-down-Assay vorzubereiten, züchten Sie die zu verwendenden Zellen bis zur Konfluenz in 10-Zentimeter-Dishs und entziehen Sie ihnen mindestens drei Stunden vor dem Assay das Serum.Kurz vor Beginn des Assays. Lysisepuffer plus Proteaseinhibitoren auf Eis vorbereiten. Kulturmedium von den Schalen entfernen und mit eiskaltem HBS waschen.Entfernen Sie sämtliches HBS und geben Sie 700 Mikroliter Lysepuffer plus zu jeder Platte hinzu. Benetzen Sie die Platten, um alle Bereiche zu bedecken.Anschießend die Lysate abkratzen und in nummerierte 1,5-Milliliter-Röhrchen sammeln. Eine Minute bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand für den Nachweis aufbewahren; sofern die Zellzahl in jeder Platte äquivalent war, jeweils 30 µL des Überstands entnehmen und mit 30 µL zweifach konzentriertem reduzierendem Lämmli-Probe-Puffer mischen.Anschließend aufkochen und auf Eis beiseitegestellt. Die verbleibenden Überstände zu Aliquots der GST-Reihe a G 17 A-Kügelchen hinzufügen und 45 Minuten bei vier Grad Celsius rotieren lassen. Die Kügelchen bei 6.800 ×g für 10 Sekunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Lysepuffer. Mit einer 1-ml-Spritze, die mit einer Nadel der Stärke 30 ausgestattet ist, vollständig den letzten Waschschritt entfernen und 20 Mikroliter zweifach konzentriertes reduzierendes Laemmli-Probe-Puffer hinzufügen. Die Proben fünf Minuten lang kochen, kurz zentrifugieren, um die Kügelchen zu pelletieren, und anschließend die gesamten Zelllysate sowie die präzipitierten Proteinproben auf einem SDS-PAGE-Gel mit der für die untersuchte GF geeigneten prozentualen Konzentration auftrennen.Schließlich führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um den relevanten GFA nach einem erfolgreichen GF-Assay nachzuweisen. Der Nachweis der Aktivierung des Austauschfaktors GFH1 wird hier gezeigt. Das Protein G17A in Reihe A bindet etwas GFH1 aus den Kontrollzelllysaten, was darauf hindeutet, dass GFH1 eine basale Aktivität besitzt.Die ausgefällte Menge stieg jedoch in Zellen an, die mit dem entzündlichen Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor alpha behandelt wurden, was der Vorstellung entspricht, dass TNF alpha G FH eins aktiviert. Wichtig ist, dass das Gesamtzelllysat ähnliche Mengen an gfh eins in der Kontrolle und der behandelten Probe zeigt, was darauf hindeutet, dass die Behandlung die G FH-eins-Spiegel nicht veränderte und dass die im Assay verwendete Menge gleich war. Bei der Anpassung dieses Verfahrens ist es wichtig, das GSE RO G 17 A-Protein und die CELLIS eights auf Eis zu halten.Führen Sie den GF-Assay schnell und konsistent durch und verwenden Sie geeignete positive Kontrollen, die eine Ungültigklärung und Fehlerbehebung ermöglichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll verwendet einen Pull-Down-Assay auf das Niveau der aktiven RhoC GTPase innerhalb der Zellen zu bestimmen.

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Clathrin-vermittelte Endozytose hängt Adapter Proteine, die Fracht Auswahl und Clathrin-Mantel Montage zu koordinieren. Hier beschreiben wir Verfahren, die Adapter-Clathrin physikalische Interaktion und Live Cell Imaging Ansätze benutzt als Modell die Hefe endocytischen Adapter-Protein Sla1p studieren.

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Dieses Video zeigt einen Wettbewerbsassay zur Untersuchung von GTPase-bindenden Proteinpartnern. Unter Verwendung von nukleotidgebundenem GTPase-Protein, das auf magnetischen Beads immobilisiert ist, kann die kompetitive Bindung zwischen zwei interagierenden Proteinpartnern für dieselbe Bindungsstelle auf der GTPase untersucht werden, um die Bindungsaffinitäten der Proteinpartner zu beurteilen.

Wettbewerbsbindungsassay zur Untersuchung konkurrierender GTPase-bindender Proteinpartner

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

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Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

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Lernen Sie die Affinitätsfällung aktiver Rho-GEFs aus Epithelzelllysaten mit einem GST-markierten RhoA-Mutantenprotein. Diese Methode ermöglicht die spezifische Detektion und Quantifizierung aktivierter GEFs mittels Western Blot.

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate (Video) | JoVE Journal

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

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