Name: Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Lernen Sie die digitale Intravitalmikroskopie zur Analyse von Leukozyten-Endothel-Interaktionen bei Ischämie-Reperfusionsschaden im Ratten-Cremaster. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtungen zur Aufklärung inflammatorischer Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des &quot;Deutschen Forschungsgemeinschaft&quot;, um SU Eisenhardt (EI 866/1-1) unterstützt.

<ol><li>Cetin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+fucoidin+%28a+neutrophil+rolling+inhibitor%29+on+ischemia+reperfusion+injury%3A+experimental+study+in+rat+epigastric+island+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps.</a> Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+xanthine+oxidase+and+granulocytes+in+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury.</a> Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).</li>
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<li>van den Heuvel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Ischaemia-reperfusion+injury+in+flap+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plast.+Reconstr.+Aesthet.+Surg%22%5BJournal%5D)">Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery.</a> J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).</li>
<li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+lectins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface lectins in the immune system.</a> Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).</li>
<li>van der Flier, A., Sonnenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+interactions+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Function and interactions of integrins.</a> Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).</li>
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<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+of+the+renal+microvascular+endothelium+alters+barrier+function+after+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).</li>
<li>Serracino-Inglott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nitric+oxide+synthase+expression+during+hepatic+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion.</a> Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).</li>
<li>Eppinger, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+ischemia-reperfusion+injury+of+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung.</a> Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).</li>
<li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+apoptotic+cell-membrane+changes+at+the+single-cell+level+in+the+beating+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart.</a> Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Woeste, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octreotide+attenuates+impaired+microcirculation+in+postischemic+pancreatitis+when+administered+before+induction+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia.</a> Transplantation. 86, 961-967 (2008).</li>
<li>Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+mimics+the+cardioprotective+effect+of+ischemic+preconditioning+via+a+glibenclamide-sensitive+mechanism+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart.</a> Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).</li>
<li>Dobschuetz, E. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+intravital+fluorescence+microscopy--a+novel+method+for+the+assessment+of+microvascular+permeability+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis.</a> Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).</li>
<li>Vutskits, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+methylene+blue+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of methylene blue on the central nervous system.</a> Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).</li>
<li>Takasu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+time+with+combined+early+blood+transfusion+and+fluid+administration+in+uncontrolled+hemorrhagic+shock+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats.</a> J. Trauma. 8, 312-316 (2010).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Cremaster+Muscle+Preparation+for+Intravital+Imaging+of+the+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2874(2011).</li>
<li>Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+inflammation%3A+a+role+for+mast+cells+in+intestine+but+not+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle.</a> Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).</li>
<li>Leoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflamed+phenotype+of+the+mesenteric+microcirculation+of+melanocortin+type+3+receptor-null+mice+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion.</a> FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).</li>
<li>Simoncini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+oestrogen+receptor+with+the+regulatory+subunit+of+phosphatidylinositol-3-OH+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase.</a> Nature. 407, 538-541 (2000).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia%2FReperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activation-specific+human+anti-%7Balpha%7DM%7Bbeta%7D2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-reactive+protein%3A+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGranger%2C+DN+%22Physiology+and+pathophysiology+of+leukocyte+adhesion%22">Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion</a>. , Oxford University Press. New York. 520(1995).</li>
<li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Microcirc.+Clin.+Exp%22%5BJournal%5D)">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorescent+dyes+on+selectin+and+integrin-mediated+stages+of+adhesion+and+migration+of+flowing+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes.</a> J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Leukozyten-Endothel-Interaktion, sind die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Aktivierung des Komplementsystems die Hauptmerkmale der IRI-induzierten Gewebe Dysfunktion. 26. Die Mikrozirkulation des betroffenen Gewebes als integraler Standort für die entzündliche Entstehung betrachtet wird. Abgesehen von Ex-vivo-Experimente wie Flow Assays Kammer 27, 28 ist es zwingend notwendig, um gut etablierte Modelle der intravitalen Bildgebung weiter zu der in vivo-Relevanz zu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Geräts: </td><td> Firma: </td><td> Artikelnummer: </td><td> Kommentare: </td></tr><tr><td> Forene 100% (V / V) </td><td> Abt </td><td> B506 </td><td> API Isofluran </td></tr><tr><td> Terylene Suture </td><td> Serag Weissner </td><td> OC108000 </td><td></td></tr><tr><td> Portex feinen Bohrung Plastikschläuche </td><td> Smiths Medical </td><td> 800/100/100 </td><td> 0,28 mm Innendurchmesser </td></tr><tr><td> 0,9% ige Kochsalzlösung </td><td> Fresinus Kabi </td><td> 808771 </td><td></td></tr><tr><td> Change-A-Spitze Deluxe Kit Kauter </td><td> Bovie Medical </td><td> Del1 </td><td></td></tr><tr><td> Abbocath-T-14G </td><td> Venisystems </td><td> G713- A01 </td><td> verwendet als Tubus </td></tr><tr><td> Servo Ventilator 900C </td><td> Maquet </td><td></td><td> verwendet als Tier ventialtor </td></tr><tr><td> Logische Druckaufnehmer </td><td> Smiths Medical </td><td> MX1960 </td><td></td></tr><tr><td> Sirecust 404-Monitor </td><td> Siemens </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ABL 700 Benchtop Analyzer </td><td> Radiometer </td><td></td><td> Blut für Gasmessung </td></tr><tr><td> Heizkissen </td><td> Effenberger </td><td> 8319 </td><td></td></tr><tr><td> Alu-Bühne </td><td> ALFUN </td><td> AW7022 </td><td></td></tr><tr><td> Operationsmikroskop OPMI 6-SDFC </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikrochirurgische Instrumente Labor set </td><td> S &amp; T </td><td> 767 </td><td></td></tr><tr><td> Biemer Gefäß-Clip </td><td> Diener </td><td> 64,562 </td><td></td></tr><tr><td> Anlegezange </td><td> Diener </td><td> 64,568 </td><td> Biemer für Gefäß-Clip </td></tr><tr><td> Rhodamin 6G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4127 </td><td></td></tr><tr><td> Vaseline weiß DAB </td><td> Winthrop </td><td> 2726853 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td></td><td></td><td> 32x32 mm </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Intravital Setup </td></tr><tr><td> Zeis Axio Scope A-1 MAT </td><td> Carl Zeis </td><td> 490036 </td><td> Epifluoreszenzmikroskop </td></tr><tr><td> 470 nm-LED </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td> Fluoreszenz-Lichtquelle </td></tr><tr><td> Colibri 2 System </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td></td></tr><tr><td> W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC </td><td> Carl Zeis </td><td> 421452 </td><td> Wasserimmersionsobjektiv </td></tr><tr><td> AxioCam MRm Rev. 3 FireWire </td><td> Carl Zeis </td><td> 426509 </td><td> hoch auflösende Digitalkamera </td></tr><tr><td> Axio Vision LE-Software </td><td> Carl Zeis </td><td> 410130 </td><td> verwenden für die Offline-Analyse </td></tr></tbody></table>

real-time digital imaging von leukozyten-endothel-interaktion in der ischämie-reperfusionsschaden (iri) der ratte cremastermuskel

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) wurde in einer großen Reihe von pathologischen Zuständen, wie z. B. Schlaganfall, Herzinfarkt, intestinale Ischämie sowie nach der Transplantation und Herz-Kreislauf-Chirurgie. 1 Reperfusion des zuvor ischämischen Gewebe in Verbindung gebracht, während die wesentlich für die Vorbeugung irreversibler Gewebeverletzung, entlockt übermäßige Entzündung des betroffenen Gewebes. Angrenzend an die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Aktivierung des Komplementsystems und erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität, die Aktivierung von Leukozyten eine der wichtigsten Akteure in der pathologische Kaskade von Gewebeschäden während der Reperfusion ist. 2, 3 ist Leukozytenaktivierung ein mehrstufiger Prozess, bestehend Walzen, feste Adhäsion und und wird durch eine komplexe Interaktion zwischen Adhäsionsmolekülen in Reaktion auf Lockstoffe wie Komplement, Chemokine oder der Plättchen-aktivierenden Faktor vermittelt werden. 4 &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Während Leukozytenrollen in postkapillären Venolen wird überwiegend durch die Wechselwirkung der Selektine mit ihren fünf Zähler Liganden, feste Adhäsion von Leukozyten an das Endothel ist Selectin-gesteuerten über Bindung an intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM) und vaskuläre zellvermittelten Adhäsionsmoleküle (VCAM). 6, 7 Goldstandard für die in vivo-Beobachtung von Leukozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung ist die Technik der Intravitalmikroskopie, erstmals 1968 beschrieben. 8 Obwohl verschiedene Modelle von IRI (Ischämie-Reperfusionsschaden) für verschiedene Organe beschrieben worden sind, sind nur wenige 9-12 geeignet für die direkte Visualisierung der Rekrutierung von Leukozyten in der mikrovaskulären Bett auf einem hohen Niveau der Bildqualität. 8 Wir fördern hier die digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie der postkapillären Venole in der Mikrozirkulation cremastericader Ratte 13 als eine bequeme Methode, um qualitativ und quantitativ analysieren Leukozytenrekrutierung für IRI-Forschung in der quergestreiften Muskulatur und eine detaillierte Anleitung zur Durchführung des Verfahren. Wir erläutern häufigsten Fallstricke und geben nützliche Tipps, die den Leser in den wirklich zu schätzen, und sicher ausführen sollte die Methode. In einer Schritt für Schritt zeigen wir Protokoll, wie man mit der Atmung gesteuerten Anästhesie unter ausreichender Kontrolle zu halten, das Tier narkotisiert fest für längere Zeit loszulegen. Anschließend beschreiben wir das cremasterica Vorbereitung als dünne flache Platte für herausragende optische Auflösung und ein Protokoll für die Leukozyten-Bildgebung in der IRI, aber gut in unseren Labors etabliert.

Digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie von postkapillären Venolen in der cremasterica Mikrozirkulation ist eine bequeme Methode, um Einblicke in die Leukozyten-Endothel Interaktion zu gewinnen<em&gt; In-vivo-</em&gt; In Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der quergestreiften Muskulatur. Wir bieten hier ein ausführliches Protokoll, um sicher fahren zu können, die Technik und ihre Anwendungen zu diskutieren und Einschränkungen.

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) sind an einer Vielzahl pathologischer Zustände beteiligt, wie etwa bei zerebralen Schlaganfällen, Myokardinfarkten, ...

Die intravitale Mikroskopie der CRE-Matrix-Mikrozirkulation ist eine geeignete Methode, um Einblicke in Ischämie und Reperfusionsschäden des gestreiften Muskelgewebes zu erhalten. Schritt für Schritt beschreiben wir, wie man mit einer atemgesteuerten Anästhesie unter ausreichender Überwachung mittels arterieller Kanülierung beginnt, um das Tier über längere Zeiträume stabil anästhesiert zu halten. Wir erläutern die Kanülierung der Vena jugularis und beschreiben anschließend die Präparation der CRE-Matrix als dünne, flache Schicht für eine hervorragende optische Auflösung.Wir stellen ein Protokoll für die Leukozytenbildgebung bei ischämischer Perfusionsverletzung bereit, das in unseren Laboren gut etabliert ist. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Aktivierung von Leukozyten bei Ischämie zu analysieren. Forschung zur Reperfusionsschädigung.Die Ischämie-Fusionsverletzung ist an einer Vielzahl von pathologischen Zuständen beteiligt, wie beispielsweise Myokardinfarkt, Darmischämie sowie nach Transplantation und kardiochirurgischen Eingriffen. Die Hyperperfusion zuvor ischämischen Gewebes, obwohl entscheidend zur Verhinderung irreversibler Gewebeschäden, führt zu einer übermäßigen Entzündungsreaktion im betroffenen Gewebe, verbunden mit der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, der Aktivierung des Komplementsystems und einer erhöhten mikrovaskulären Permeabilität. Die Aktivierung von Leukozyten ist einer der zentralen Faktoren in der pathologischen Abfolge entzündlicher Gewebeschädigungen während der Reperfusion.Hier stellen wir die intravitale Mikroskopie des postkapillären Venulärsystems als eine praktische Methode zur Analyse der Leukozytenaktivierung bei ischämischer Reperfusionsschädigung vor. Außerdem erläutern wir häufig auftretende Fehlerquellen und geben nützliche Tipps, die es dem Leser ermöglichen sollen, die Methode richtig einzuschätzen und sicher durchzuführen. Nach Genehmigung durch die Ethikkommission und Anästhesierung männlicher Ratten mit einem Körpergewicht von 120 bis 180 Gramm wird die Ratte in eine Plexiglasbox platziert und zwei bis drei Volumenprozent Isofluran über einen Isofluranverdampfer verabreicht.Sobald der geeignete Anästhesiegrad erreicht ist, wird die Ratte gewogen und der ventrale zervikale Bereich rasiert. Legen Sie das Tier in dorsaler Rückenlage auf eine Heizplatte, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten, und applizieren Sie Isofluran mit zwei Volumenprozent über eine Silikonmaske. Die folgenden Vorbereitungen lassen sich am besten mit einem Operationsmikroskop durchführen.Führen Sie einen zwei Zentimeter langen horizontalen Hautschnitt im Bereich der Sulcus-ribis-anterior-Schnittstelle durch. Mobilisieren Sie die Speicheldrüsen lateral. Nun befinden Sie sich vor den ventralen Halsmuskeln.Trennen Sie sie vorsichtig in der Mittellinie und finden Sie die Luftröhre. Freilegen Sie ein bis zwei Zentimeter der Luftröhre und platzieren Sie eine Mikrozange von unten, um sie anzuheben. Führen Sie nun etwa zur Hälfte durch die ventrale Seite der Luftröhre einen Schlauch mit 14 Gauge als Trachealtubus in den unteren Teil der Luftröhre ein, der zuvor mit einem Tierbeatmungsgerät verbunden wurde.Die Atmung kann anschließend volumengesteuert mit einer Frequenz von 35 bis 45 Atemzügen pro Minute erfolgen. Ein Atemzugvolumen von 4,5 bis fünf M und eine ISO-Fluorkonzentration von 1,5 bis zwei Volumenprozent für die Karotiskanülierung. Der rechte sternale Hioidmuskel wird durch stumpfe Dissektion freigelegt.Um eine Arteria carotis zu lokalisieren, trennen Sie den Nervus vagus vorsichtig von der Arteria carotis und legen Sie die Arterie auf Anki-Mikro-Forceps, um den Blutfluss vom Herzen vorbei zwei Ligaturen unterhalb der Arteria carotis in Bezug auf das Herz zu stoppen; die distalere Ligatur wird fest gebunden, während die proximale Ligatur locker um die Arteria carotis gebunden wird. Das Anlegen einer zweiten proximalen Ligatur verhindert Blutungen nach dem Entfernen der Mikro-Forceps mithilfe von Mikroscheren, wobei ein kleiner Schnitt zwischen den beiden Ligaturen in die Arteria carotis gemacht wird. Führen Sie einen mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllten Polyäthylen-Katheter ein, der mit einem Druckmesswandler verbunden ist.Entfernen Sie die Mikrozange und führen Sie den Katheter weiter in die Arterie ein. Führen Sie intermittierend eine arterielle Blutgasanalyse mit einem Blutgasanalysator durch und halten Sie den Blut-pH-Wert im physiologischen Bereich, um die intravenöse Applikation fluoreszierender Farbstoffe oder anderer Substanzen von Interesse zu ermöglichen. Konzentrieren Sie sich mit dem Operationsmikroskop auf den Bereich der linken gularen Vene, halten Sie in jeder Hand eine Zange, reißen Sie die dünne Faszie auf, um die Vena jugularis freizulegen.Befestigen Sie die Vene an einer schräg stehenden Mikrozange, um den Blutfluss zu stoppen. Mit der Zange werden zwei gleich lange Fadenstücke auf dieselbe Weise wie bei der Karotiskanülierung unter die Vena jugularis geschoben, dann wird ein kleiner Schnitt in die Vena jugularis gesetzt und eine mit Zelllinienlösung gespülte Polyethylen-Kanüle eingeführt. Fädeln Sie die Kanüle in Richtung Herz ein und ziehen Sie den dem Herzen nächstgelegenen Ligaturfaden fest. Um die Vene und den Katheter herum verwenden wir eine aluminiumbeschichtete Cremaster-Imaging-Stufe vier, die rasch die gewünschte Temperatur der Heizplatte annimmt. Der anfängliche Schnitt wird in der Haut und im äußeren Samenstrang oberhalb des Skrotums am weitesten entfernten Ende vorgenommen, gefolgt von einer vorsichtigen Dilatation des subdermalen Raums mit einer feinen Schere. Sobald das Gewebe freigelegt ist, wird es mit einer vorgewärmten Kochsalzlösung angefeuchtet.Das Bindegewebe zwischen der äußeren Samenstrangfascia und dem CRE-Master-Muskel wird sorgfältig entfernt, um die Trimestermuskeln von den umgebenden Geweben zu lösen. Eine kontinuierliche Überströmung während der Dissektion befeuchtet das Gewebe, was die Sichtbarkeit und Entfernung erleichtert, beispielsweise das distale Ende des CRE-Master-S, um es festzuhalten und leicht zu dehnen, wobei das Ende des S im distalen Bereich des Sacks an der ventralen Seite liegt, und den Schnitt proximal zu verlängern. Mit Mikroscheren werden sorgfältig blutende Gefäße entlang der Schnittlinien klassifiziert.Unter Verwendung einer thermischen Cory liegt der offene Cray-Mastermuskel flach auf der Aluminium-Pedestaldosis und ist weiterhin durch dünne Bänder mit den unterhalb des Hodens liegenden EPIs verbunden, einschließlich einer kleinen Arterie und Vene. Nutzen Sie die Ery, um die Gefäße zu verschließen, und durchtrennen Sie die Bindegewebsbänder zwischen diskalem und Cremastergewebe. Drücken Sie den isolierten Hoden vorsichtig in den Leistenkanal zurück.Zusätzlich zur ersten Fixierung, bei der vier Stellen des Gewebes fixiert werden, befestigen Sie die Fäden vorsichtig und breiten das Cremastergewebe radial auf der Aluminiumplatte aus. Platzieren Sie die beiden Enden eines Polyethylen-Katheters nahe am Cremastergewebe, um die Überleitungsanordnung vorzubereiten. Ziehen Sie mit einer Spritze eine Linie aus Vaseline um den Cremastermuskel, um eine Flüssigkeitskammer zu bilden.Legen Sie eine quadratische Deckglas über das Cric-Gewebe und befestigen Sie die Ränder fest an der Vaseline-Linie. Das Cremaster-Gewebe ist nun bereit für die mikroskopische Bildgebung. Der grundlegende Aufbau für die intravitale Bildgebung kann variieren.Wir verwenden ein intravitales Epi-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer 470 Nanometer LED-Lichtquelle für die EP-Laminierung ausgestattet ist. Mithilfe eines Wasserimmersionsobjektivs erzielen wir eine Vergrößerung von etwa 800x und nehmen die Beobachtung mittels einer hochauflösenden Digitalkamera auf. Für die Epi-Fluoreszenz-Aufnahmen sollte das Experiment in einem abgedunkelten Raum durchgeführt werden.Für die Leukozytenmarkierung injizieren Sie rumine six J intravenös über den Jugularkatheter in einer Konzentration von 0,4 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht. Wählen Sie ein postkapilläres Gefäß zur Beobachtung. Der Durchmesser des Gefäßes sollte zwischen 20 und 60 Mikrometer liegen und der Blutfluss ausreichend sein.Bevor die Ischämie eintritt, lassen Sie das Gewebe 30 Minuten lang stabilisieren. Führen Sie danach eine 30 Sekunden dauernde Aufzeichnung durch, um die Basiswerte für das Rollen und die Adhärenz von Leukozyten zu bestimmen. Plazieren Sie vorsichtig eine Bemervaskularklammer mit Hilfe von Applikationspinzetten am proximalen Ende des exponierten Kremastergewebes.Entfernen Sie die Gefäßklemme nach 30 Minuten der Ischämie. Anschließende Aufnahmen können während der gesamten Reperfusion durchgeführt werden. Zur Quantifizierung des Leukozyten-Rollens definieren Sie eine virtuelle Linie, die das Gefäß senkrecht schneidet und in allen Aufzeichnungen konsistent ist.Zählen Sie manuell die Anzahl der rollenden Leukozyten, die die Linie innerhalb von 30 Sekunden passieren. Zur Quantifizierung der adhärenten Leukozyten definieren Sie einen 200 Mikrometer langen, konsistenten Abschnitt des Gefäßes in allen Aufzeichnungen.Zählen Sie die Anzahl der deutlich sichtbaren Leukozyten, die während 30 Sekunden stationär verharren. Repräsentative Ergebnisse werden innerhalb des schriftlichen Protokolls bereitgestellt. Obwohl die Ischämie-Reperfusionsschädigung in verschiedenen Organsystemen beschrieben wurde, beschreiben wir hier eine Methode zur Analyse der Leukozyten-Endothel-Interaktion bei der Reperfusionsschädigung von quergestreiftem Muskelgewebe.Daher ist die Methode besonders für die Freihautplastik relevant, da angenommen wird, dass die nach ischämischen Gewebeschäden in anderen Organen die gleichen entzündlichen Mechanismen beteiligt sind. Die beschriebene Methode kann verwendet werden, um grundlegende Einblicke in die pathologischen Mechanismen bei ischämischer Fusionsschädigung zu erhalten. Die Induktion einer Ischämie im Musculus cremaster lässt sich leicht durchführen und spiegelt klinisch relevante Bedingungen wie die Freihautplastik hervorragend wider.Außerdem können Modifikationen wie kalte Ischämie oder warme Ischämie oder die chromatische Superfusion mit Substanzen, die die Entzündung beeinflussen, leicht angewendet werden. Die intraorale Injektion kann die Methode der Wahl sein, wenn eine Behandlung Stunden oder Tage vor der Aufzeichnung erforderlich ist.

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Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Diese Studie demonstriert die chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte für die Visualisierung der in vivo zellfreien Schicht. In dieser Studie werden wesentliche Faktoren diskutiert, die die Genauigkeit der zellfreien Schichtbreitenmessung beeinflussen.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer Ischämie-Reperfusion (IR) Modell auf Mausohrhaut mit Magnetspann. Mit Hilfe eines speziell angefertigten intravital Bildgebung Modell untersuchen wir in vivo Entzündungsreaktionen post-Reperfusion. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung dieser Technik besteht darin, das Verständnis zu verlängern, wie Leukozyten Haut IR Verletzung reagieren.

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Nierenischämie-Reperfusionsverletzungen sind mit hoher Morbidität und Mortalität bei hospitalisierten Patienten verbunden. Hier stellen wir ein einfaches und effektives Mausmodell der einseitigen renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung vor und geben einen sequentiellen Überblick über repräsentative pathologische Veränderungen, die in der Niere beobachtet wurden.

Ein effektives Mausmodell der einseitigen renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Induktion einer mesenterialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und zur Visualisierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in mesenterialen Venolen mittels intravitaler Mikroskopie vor. Der Blutfluss in der Arteria mesenterica superior war für 1 h eingeschränkt, gefolgt von einer Reperfusion, was eine direkte Quantifizierung der Leukozytenadhäsion und NETose ermöglichte.

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Ein Laser-Speckle-Kontrastbildgebungssystem wurde verwendet, um die Veränderungen im renalen mikrovaskulären Blutfluss während einer einseitigen Nierischämie-Reperfusion nach der Resektion der rechten Niere bei Mäusen zu überwachen.

Mikrovaskuläre Perfusion überwacht durch Laser-Speckle-Kontrastbildgebung während der Nierenischämie-Reperfusionsverletzung bei Mäusen

Lernen Sie die digitale Intravitalmikroskopie zur Analyse von Leukozyten-Endothel-Interaktionen bei Ischämie-Reperfusionsschaden im Ratten-Cremaster. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtungen zur Aufklärung inflammatorischer Mechanismen.

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel (Video) | JoVE Journal

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

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