Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Die intravitale Mikroskopie der CRE-Matrix-Mikrozirkulation ist eine geeignete Methode, um Einblicke in Ischämie und Reperfusionsschäden des gestreiften Muskelgewebes zu erhalten. Schritt für Schritt beschreiben wir, wie man mit einer atemgesteuerten Anästhesie unter ausreichender Überwachung mittels arterieller Kanülierung beginnt, um das Tier über längere Zeiträume stabil anästhesiert zu halten. Wir erläutern die Kanülierung der Vena jugularis und beschreiben anschließend die Präparation der CRE-Matrix als dünne, flache Schicht für eine hervorragende optische Auflösung.

Wir stellen ein Protokoll für die Leukozytenbildgebung bei ischämischer Perfusionsverletzung bereit, das in unseren Laboren gut etabliert ist. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Aktivierung von Leukozyten bei Ischämie zu analysieren. Forschung zur Reperfusionsschädigung.

Die Ischämie-Fusionsverletzung ist an einer Vielzahl von pathologischen Zuständen beteiligt, wie beispielsweise Myokardinfarkt, Darmischämie sowie nach Transplantation und kardiochirurgischen Eingriffen. Die Hyperperfusion zuvor ischämischen Gewebes, obwohl entscheidend zur Verhinderung irreversibler Gewebeschäden, führt zu einer übermäßigen Entzündungsreaktion im betroffenen Gewebe, verbunden mit der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, der Aktivierung des Komplementsystems und einer erhöhten mikrovaskulären Permeabilität. Die Aktivierung von Leukozyten ist einer der zentralen Faktoren in der pathologischen Abfolge entzündlicher Gewebeschädigungen während der Reperfusion.

Hier stellen wir die intravitale Mikroskopie des postkapillären Venulärsystems als eine praktische Methode zur Analyse der Leukozytenaktivierung bei ischämischer Reperfusionsschädigung vor. Außerdem erläutern wir häufig auftretende Fehlerquellen und geben nützliche Tipps, die es dem Leser ermöglichen sollen, die Methode richtig einzuschätzen und sicher durchzuführen. Nach Genehmigung durch die Ethikkommission und Anästhesierung männlicher Ratten mit einem Körpergewicht von 120 bis 180 Gramm wird die Ratte in eine Plexiglasbox platziert und zwei bis drei Volumenprozent Isofluran über einen Isofluranverdampfer verabreicht.

Sobald der geeignete Anästhesiegrad erreicht ist, wird die Ratte gewogen und der ventrale zervikale Bereich rasiert. Legen Sie das Tier in dorsaler Rückenlage auf eine Heizplatte, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten, und applizieren Sie Isofluran mit zwei Volumenprozent über eine Silikonmaske. Die folgenden Vorbereitungen lassen sich am besten mit einem Operationsmikroskop durchführen.

Führen Sie einen zwei Zentimeter langen horizontalen Hautschnitt im Bereich der Sulcus-ribis-anterior-Schnittstelle durch. Mobilisieren Sie die Speicheldrüsen lateral. Nun befinden Sie sich vor den ventralen Halsmuskeln.

Trennen Sie sie vorsichtig in der Mittellinie und finden Sie die Luftröhre. Freilegen Sie ein bis zwei Zentimeter der Luftröhre und platzieren Sie eine Mikrozange von unten, um sie anzuheben. Führen Sie nun etwa zur Hälfte durch die ventrale Seite der Luftröhre einen Schlauch mit 14 Gauge als Trachealtubus in den unteren Teil der Luftröhre ein, der zuvor mit einem Tierbeatmungsgerät verbunden wurde.

Die Atmung kann anschließend volumengesteuert mit einer Frequenz von 35 bis 45 Atemzügen pro Minute erfolgen. Ein Atemzugvolumen von 4,5 bis fünf M und eine ISO-Fluorkonzentration von 1,5 bis zwei Volumenprozent für die Karotiskanülierung. Der rechte sternale Hioidmuskel wird durch stumpfe Dissektion freigelegt.

Um eine Arteria carotis zu lokalisieren, trennen Sie den Nervus vagus vorsichtig von der Arteria carotis und legen Sie die Arterie auf Anki-Mikro-Forceps, um den Blutfluss vom Herzen vorbei zwei Ligaturen unterhalb der Arteria carotis in Bezug auf das Herz zu stoppen; die distalere Ligatur wird fest gebunden, während die proximale Ligatur locker um die Arteria carotis gebunden wird. Das Anlegen einer zweiten proximalen Ligatur verhindert Blutungen nach dem Entfernen der Mikro-Forceps mithilfe von Mikroscheren, wobei ein kleiner Schnitt zwischen den beiden Ligaturen in die Arteria carotis gemacht wird. Führen Sie einen mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllten Polyäthylen-Katheter ein, der mit einem Druckmesswandler verbunden ist.

Entfernen Sie die Mikrozange und führen Sie den Katheter weiter in die Arterie ein. Führen Sie intermittierend eine arterielle Blutgasanalyse mit einem Blutgasanalysator durch und halten Sie den Blut-pH-Wert im physiologischen Bereich, um die intravenöse Applikation fluoreszierender Farbstoffe oder anderer Substanzen von Interesse zu ermöglichen. Konzentrieren Sie sich mit dem Operationsmikroskop auf den Bereich der linken gularen Vene, halten Sie in jeder Hand eine Zange, reißen Sie die dünne Faszie auf, um die Vena jugularis freizulegen.

Befestigen Sie die Vene an einer schräg stehenden Mikrozange, um den Blutfluss zu stoppen. Mit der Zange werden zwei gleich lange Fadenstücke auf dieselbe Weise wie bei der Karotiskanülierung unter die Vena jugularis geschoben, dann wird ein kleiner Schnitt in die Vena jugularis gesetzt und eine mit Zelllinienlösung gespülte Polyethylen-Kanüle eingeführt. Fädeln Sie die Kanüle in Richtung Herz ein und ziehen Sie den dem Herzen nächstgelegenen Ligaturfaden fest.

Um die Vene und den Katheter herum verwenden wir eine aluminiumbeschichtete Cremaster-Imaging-Stufe vier, die rasch die gewünschte Temperatur der Heizplatte annimmt. Der anfängliche Schnitt wird in der Haut und im äußeren Samenstrang oberhalb des Skrotums am weitesten entfernten Ende vorgenommen, gefolgt von einer vorsichtigen Dilatation des subdermalen Raums mit einer feinen Schere. Sobald das Gewebe freigelegt ist, wird es mit einer vorgewärmten Kochsalzlösung angefeuchtet.

Das Bindegewebe zwischen der äußeren Samenstrangfascia und dem CRE-Master-Muskel wird sorgfältig entfernt, um die Trimestermuskeln von den umgebenden Geweben zu lösen. Eine kontinuierliche Überströmung während der Dissektion befeuchtet das Gewebe, was die Sichtbarkeit und Entfernung erleichtert, beispielsweise das distale Ende des CRE-Master-S, um es festzuhalten und leicht zu dehnen, wobei das Ende des S im distalen Bereich des Sacks an der ventralen Seite liegt, und den Schnitt proximal zu verlängern. Mit Mikroscheren werden sorgfältig blutende Gefäße entlang der Schnittlinien klassifiziert.

Unter Verwendung einer thermischen Cory liegt der offene Cray-Mastermuskel flach auf der Aluminium-Pedestaldosis und ist weiterhin durch dünne Bänder mit den unterhalb des Hodens liegenden EPIs verbunden, einschließlich einer kleinen Arterie und Vene. Nutzen Sie die Ery, um die Gefäße zu verschließen, und durchtrennen Sie die Bindegewebsbänder zwischen diskalem und Cremastergewebe. Drücken Sie den isolierten Hoden vorsichtig in den Leistenkanal zurück.

Zusätzlich zur ersten Fixierung, bei der vier Stellen des Gewebes fixiert werden, befestigen Sie die Fäden vorsichtig und breiten das Cremastergewebe radial auf der Aluminiumplatte aus. Platzieren Sie die beiden Enden eines Polyethylen-Katheters nahe am Cremastergewebe, um die Überleitungsanordnung vorzubereiten. Ziehen Sie mit einer Spritze eine Linie aus Vaseline um den Cremastermuskel, um eine Flüssigkeitskammer zu bilden.

Legen Sie eine quadratische Deckglas über das Cric-Gewebe und befestigen Sie die Ränder fest an der Vaseline-Linie. Das Cremaster-Gewebe ist nun bereit für die mikroskopische Bildgebung. Der grundlegende Aufbau für die intravitale Bildgebung kann variieren.

Wir verwenden ein intravitales Epi-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer 470 Nanometer LED-Lichtquelle für die EP-Laminierung ausgestattet ist. Mithilfe eines Wasserimmersionsobjektivs erzielen wir eine Vergrößerung von etwa 800x und nehmen die Beobachtung mittels einer hochauflösenden Digitalkamera auf. Für die Epi-Fluoreszenz-Aufnahmen sollte das Experiment in einem abgedunkelten Raum durchgeführt werden.

Für die Leukozytenmarkierung injizieren Sie rumine six J intravenös über den Jugularkatheter in einer Konzentration von 0,4 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht. Wählen Sie ein postkapilläres Gefäß zur Beobachtung. Der Durchmesser des Gefäßes sollte zwischen 20 und 60 Mikrometer liegen und der Blutfluss ausreichend sein.

Bevor die Ischämie eintritt, lassen Sie das Gewebe 30 Minuten lang stabilisieren. Führen Sie danach eine 30 Sekunden dauernde Aufzeichnung durch, um die Basiswerte für das Rollen und die Adhärenz von Leukozyten zu bestimmen. Plazieren Sie vorsichtig eine Bemervaskularklammer mit Hilfe von Applikationspinzetten am proximalen Ende des exponierten Kremastergewebes.

Entfernen Sie die Gefäßklemme nach 30 Minuten der Ischämie. Anschließende Aufnahmen können während der gesamten Reperfusion durchgeführt werden. Zur Quantifizierung des Leukozyten-Rollens definieren Sie eine virtuelle Linie, die das Gefäß senkrecht schneidet und in allen Aufzeichnungen konsistent ist.

Zählen Sie manuell die Anzahl der rollenden Leukozyten, die die Linie innerhalb von 30 Sekunden passieren. Zur Quantifizierung der adhärenten Leukozyten definieren Sie einen 200 Mikrometer langen, konsistenten Abschnitt des Gefäßes in allen Aufzeichnungen.

Zählen Sie die Anzahl der deutlich sichtbaren Leukozyten, die während 30 Sekunden stationär verharren. Repräsentative Ergebnisse werden innerhalb des schriftlichen Protokolls bereitgestellt. Obwohl die Ischämie-Reperfusionsschädigung in verschiedenen Organsystemen beschrieben wurde, beschreiben wir hier eine Methode zur Analyse der Leukozyten-Endothel-Interaktion bei der Reperfusionsschädigung von quergestreiftem Muskelgewebe.

Daher ist die Methode besonders für die Freihautplastik relevant, da angenommen wird, dass die nach ischämischen Gewebeschäden in anderen Organen die gleichen entzündlichen Mechanismen beteiligt sind. Die beschriebene Methode kann verwendet werden, um grundlegende Einblicke in die pathologischen Mechanismen bei ischämischer Fusionsschädigung zu erhalten. Die Induktion einer Ischämie im Musculus cremaster lässt sich leicht durchführen und spiegelt klinisch relevante Bedingungen wie die Freihautplastik hervorragend wider.

Außerdem können Modifikationen wie kalte Ischämie oder warme Ischämie oder die chromatische Superfusion mit Substanzen, die die Entzündung beeinflussen, leicht angewendet werden. Die intraorale Injektion kann die Methode der Wahl sein, wenn eine Behandlung Stunden oder Tage vor der Aufzeichnung erforderlich ist.