Name: Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Lernen Sie Raman-Spektroskopie zur berührungslosen, label-freien Überwachung von Zellen und extrazellulärer Matrix. Diese Methode ermöglicht die Analyse biochemischer Zusammensetzung in Echtzeit.

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Wir bedanken uns bei Steffen Koch für seine technische Unterstützung und Shannon Lee Layland (beide Fraunhofer IGB Stuttgart) für seine hilfreichen Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziell von der Attract-Programm der Fraunhofer-Gesellschaft und des BMBF (beide KS-L.) Unterstützt.

1. Vorbereitung der biologischen Probe <ol><li> Präparation von lebenden Zellen <ol><li> Herstellung von adhärenten Zellen <ol><li> Seed in vitro-kultivierten oder frisch isolierten Zellen auf einem Glasboden-Spiegel (Greiner BioOne / Deutschland) und inkubieren sie bei 37 ° C und 5% CO 2 bis Zellhaftung abgeschlossen ist. </li><li> Kulturmedium entfernen und danach vorsichtig waschen dreimal mit PBS vor Messung. Halten der Zellen mit PBS oder Zellkulturmedium während des gesamten Messverfahrens bedeckt. </li></ol></li><li> Herstellung von Zellen in Suspension <ol><li> Trennen in vitro-kultivierten Zellen nach Anspruch gemeinsame Protokolle (z. B. Trypsin-EDTA, Zellabschabung), zentrifugiert und die Zellen erneut zu suspendieren des erhaltenen Zellpellet wurde in PBS oder Zellkulturmedium. </li><li> Übertragen Sie 100 ul der Zellsuspension (Konzentration: max. 100.000 Zellen / ml) auf einem Glasboden Gericht. </li></ol></li></ol></li><li> Vorbereitung der natIVE-Gewebe <ol><li> Nach der Ernte der Gewebe, übertragen Sie sie auf sterile, eiskaltem PBS und bewahren Sie sie nicht länger als 12 Stunden bei 4 ° C oder auf Eis vor Messung. Frühere Experimente haben gezeigt, dass eine verlängerte Lagerzeit (kalte Ischämiezeit&gt; 12 Stunden bei 4 ° C) im spektralen Veränderungen durch natürliche Abbauprozesse geführt. </li><li> Die Messungen müssen mit dem Gewebe in PBS oder Medium bedeckt, um eine Beschädigung der ECM-Proteinen und Zellen aufgrund von Gewebe Trocknung vermeiden durchgeführt werden. </li></ol></li></ol> 2. Raman-Spektrometer Unsere maßgeschneiderten Raman-Spektrometer kombiniert eine Standard-Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 71) mit einem Raman-Spektrometer, die den direkten Vergleich von Hellfeld-und Fluoreszenz-Aufnahmen mit der Raman-Spektren ermöglicht. Die grundlegenden Einrichtung besteht aus einem 784 nm Diodenlaser (Toptica Photonik AG / Deutschland), ein Kerbfilter für die Trennung von der Raman-gestreute Licht von dem Anregungslicht, ein Mikroskop einnd einen Spektrographen (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) mit einer Charge Coupled Device (CCD-Kamera) für den Nachweis von spektralen Informationen (von Soft Imaging Systems / Deutschland F-View) optimiert. 3. Steuerung von Laser-Funktion <ol><li> Starten Sie die Software Andor Solis (Andor / Großbritannien) und stellen Sie die Temperatur des CCD-Kamera bis -60 ° C, um den Lärm durch thermisch induzierte Ströme in der Kamera zu minimieren. </li><li> Legen Sie einen Silizium-Wafer auf dem Mikroskoptisch für die Kalibrierung. </li><li> Schalten Sie den Laser und stellen Sie die Leistung auf 85 mW. </li><li> Verwenden Sie die Software Zelle B (Olympus / Deutschland), um den Laser auf den Wafer zu konzentrieren, bis XY erscheint. </li><li> Messen Sie den Silizium-Wafer mit einer einzigen Integrationszeit von 1 s mit einem 60x Objektiv Luft. </li><li> Ändern der Einheit der x-Achse von Pixel-Zahl, um Raman-Verschiebung (cm -1) im Andor Solis Software. </li><li> Variieren Sie den Laser-Fokus des Silizium-Peak bei 520 cm -1 indas gesammelte Spektrum, um die maximal mögliche Intensität dieser Raman-Band zu finden. Der Mindestbetrag zählt muss höher als 11.000, um eine erfolgreiche Kalibrierung haben. </li></ol> 4. Raman-spektroskopische Messungen Alle Messungen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. <ol><li> Grundeinstellungen <ol><li> Verwenden Sie einen 60x Wasserimmersionsobjektiv (Olympus / Deutschland) mit einer numerischen Apertur von 1,2, um das Spektrum der Proben zu sammeln. </li><li> Ändern Sie die Einstellungen Akquisition bis 10 Integrationen / 10 Sekunden für insgesamt 100 Sekunden pro Messung. </li></ol></li><li> Messung der adhärenten Zellen <ol><li> Nehmen Sie den Glasboden Schüssel mit den Zellen und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Um ein besseres Signal zu erhalten und sicherzustellen, Reproduzierbarkeit, fokussieren Sie den Laser auf den Zellkern, drehen Sie das Mikroskop Licht aus und sammeln Sie das Spektrum. </li><li> Messen eines Referenz-Spektrum des Hintergrundrauschens Esehr 10 Spektren durch Bewegen des Laserfokus neben der Zelle. Es ist wichtig zu bedenken, dass, wenn die Schärfe ein neuer Hintergrund für jede Tiefenschärfe müssen gesammelt werden. </li></ol></li><li> Messung von Zellen in Suspension <ol><li> Übertragen Sie 100 ul der Zellsuspension in den Glasboden Schüssel und legen Sie es auf das Mikroskop Bühne. </li><li> Fokus des Lasers auf der Mitte der Zelle, drehen Sie den Mikroskop Licht aus und sammeln Sie das Spektrum. </li><li> Messen eines Referenz-Spektrum des Hintergrundrauschens alle 10 Spektren durch Bewegen des Laserfokus neben der Zelle. Beim Wechsel des Fokus, muss ein neuer Hintergrund für die neue Tiefenschärfe erfasst werden. </li></ol></li><li> Die Messung der nativen Geweben <ol><li> Nehmen Sie die Probe und setzen Sie es in einem Glasboden Gericht. Der interessierende Bereich (ROI) ist ausgerichtet mit Blick auf den Boden der Schale. </li><li> Füllen Sie die Schale mit PBS genug, um die Probe zu decken. </li><li> Legen Sie ein Deckglas über die Probe, jede mov vermeidenement der Probe während der Messung. </li><li> Stellen Sie den Laser-Fokus in die Struktur von Interesse (Tiefenauflösung ist Laser-und Gewebe-abhängig) und sammeln Sie die Spektren. </li><li> Sammeln einer Referenz-Spektrum des Hintergrundrauschens alle 10 Spektren durch Bewegen des Laserstrahl auf aus dem gesamten Gewebebereich. Beim Wechsel des Fokus, muss ein neuer Hintergrund für die neue Tiefenschärfe erfasst werden. </li></ol></li><li> Die Messung der Immunfluoreszenz (IF)-markierten Kryoschnitten <ol><li> § frisch, Snap-gefrorenen Gewebeproben mit einem Standard-cryotom und montieren sie auf Silica-beschichtete Deckgläser. </li><li> Färben der Kryoschnitte nach einem Routine-Protokoll für IF, die nur einen kurzen Fixierungsschritt (max. 10 Minuten mit 4% Paraformaldehyd) und unter Verwendung geeigneter Antikörper für die Detektion des Proteins von Interesse. </li><li> Führen Raman-Messungen Fokussierung in dem Bereich, wo Fluoreszenz auftritt. </li></ol></li><li> Elastin Abbauversuche <ol><li> Place die ventricularis der Schweine seziert Aortenklappensegel (Elastin-reich, Blut anströmseitigen Schicht des Herzens Klappensegel) mit Blick auf die Unterseite der Glasboden Gericht. </li><li> Messen Sie die nativen Gewebe als &quot;nicht inkubierten Kontrolle&quot; bei 30 zufällig gewählten Punkten in der gesamten Gewebeoberfläche mit Schwerpunkt in den fibrillären Strukturen. </li><li> Teilen Sie die Probe in 3 Abschnitte und legen Sie sie in separate 2,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 2 ml einer Elastase-Lösung (5 U / ml, Worthington / Deutschland) gefüllt. </li><li> Inkubieren Sie das Gewebe entweder 15 oder 30 Minuten bei 37 ° C </li><li> Nach einer Inkubationszeit von entweder 15 oder 30 Minuten, entfernen Sie das Gewebe von der Eppendorf-Röhrchen und waschen Sie vorsichtig mit PBS, um vollständig zu stoppen der enzymatischen Reaktion. </li><li> Messen Sie jede Probe bei 30 zufällige Punkte, wobei der Schwerpunkt in den fibrillären Strukturen. </li></ol></li></ol> 5. Datenverarbeitung und-analyse <ol><li> Raman-Spektren Verarbeitung Die Vorbehandlung dererzeugten Spektren erfolgte mit OPUS-Software (Bruker Optik GmbH / Deutschland). <ol><li> Um Störsignale aus dem Glas und Medium sowie zu reduzieren, um Variationen von Veränderungen in der Ausrichtung während der Messung zu vermeiden, subtrahiert die entsprechenden Hintergrund-Spektrum von dem gesammelten Spektren. </li><li> Reduzieren Sie die Spektren der Wellenzahl Region zwischen 400-1800 cm -1, die die höchste Menge an Informationen bietet. </li><li> Bei Bedarf Normalisierung der Spektren der maximalen Spitze. Die Normalisierung Faktoren aus den Intensitätsschwankungen und systematische Ausfälle, die Vereinfachung der Nachweis von strukturellen Veränderungen in der Probe-Spektren. </li><li> Führen Sie eine Baseline-Korrektur, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Experimente zu erhöhen. </li></ol></li><li> Raman-Spektren Analyse Die Raman-Spektren wurden mit Hilfe der PCA mit The Unscrambler (CAMO / Norwegen) Software. Diese multivariate Analyse erkennt Unterschiede und Gemeinsamkeiten innerhalb der spektralen DatenSets. Jedes Spektrum wird als ein einzelner Punkt in einem mehrdimensionalen Raum auf den gesammelten Zählungen für jeden Raman-Verschiebung der Basis aufgetragen. Jedes Prinzip Komponente (PC) beschreibt eine bestimmte Menge der gesamten Informationen in den Originaldaten enthalten. Der erste PC ist derjenige, der die höchste Quelle der Variation enthält. Jeder PC enthält folgende, in Ordnung, weniger Informationen als die vorherige. Jede Variable hat einen Wert und eine Beladung auf jedem PC. Durch Auftragen PCs (= Scores), können wichtige Zusammenhänge Probe ausgesetzt sein. Die Belastungen beschreiben den Beitrag jedes analysierte Variable an die PCA. <ol><li> Beschriften Sie jede Gruppe von Messungen durch die Schaffung von Zeile reicht für jede Probe-Gruppe. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Grundeinstellungen für das PCA: Kreuzvalidierung, die NIPALS Algorithmus, keine Rotation und die Analyse starten. Diese Einstellungen sind abhängig von Spektren. </li><li> Führen Sie die PCA. </li></ol></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Raman-spECTRA von anhaftenden Zellen erzeugt weisen oft ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und eine geringe Signalintensität (Abb. 1). 11 Aufgrund der Tatsache, dass der Laserfokus in der Nähe der Glasboden, der Einfluss der Störung eingestellt werden muss Glas-Signal ist recht hoch, was Maskierung der eigentlichen Probe-Signal. Folglich könnte die Probe Signal minimiert oder sogar beseitigt werden während eines nachfolgenden Abzug des Hintergrunds. Somit ziehen wir es vor Zellen in Suspension zu verwenden für unsere Raman-spektroskopische Analyse, wie sie den Nachweis von mehr detaillierte spektrale Informationen möglich ist. Jedoch zeigen die Spektren von adhärenten und Suspensionszellen die gleichen Haupt-Peaks unterscheiden sich nur in ihrer Intensität. Zur Charakterisierung der verschiedenen Zelltypen innerhalb einer Suspension, ist keine Vorbehandlung erforderlich. Die mittlere Raman-Spektren und Standardabweichung von menschlichen Fibroblasten, mesenchymale Stammzellen (MSCs), Chondrozyten und Keratinozyten in Suspension gemessenenin Abbildung 2 dargestellt. Alle Raman-Spektren sind ähnlich strukturiert, mit Gipfeln, die aus typischen Biomolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden (siehe Tabelle 1). Für 12 dieser Zelltypen, der Spektralbereich zwischen 600 und 1800 cm -1 enthält die meisten relevanten spektralen Informationen, durch die deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelltypen (Abb. 2A) nachweisbar. Beispielhafte, betonte wir ein Spektralbereich (1280-1350 cm -1) zeigt klare strukturelle Unterschiede, die zugeordnet werden Molekülschwingungen von Kollagen und Lipiden ist. Im Gegensatz dazu sind morphologische Analysen nicht geeignet für die Identifizierung und Unterscheidung der meisten Zellen (2B-I). Während der Unterschied zwischen Chondrozyten und Hautzellen zu beobachten ist (Abb. 2D, H gegen B, F und E, I), sind Fibroblasten und MSCs schwer zu trennen unter ausschließlicher Verwendung von Hellfeld-micrsocopieren (Abb. 2 B, F gegen C, G). 13 Raman-spektroskopische Analyse von nativem Gewebe, insbesondere von ECM-Proteine, erfordert, dass ein ROI kann durch Hellfeld-Abbildung visualisiert, um in der Lage, auf die jeweilige Struktur zu konzentrieren. Für die Zuordnung eines Proteins an einer spezifischen Fingerabdruck-Spektrum, erzeugten wir Raman-Spektren von kommerziell erhältlichen reinen Proteinen und immunhistologisch gefärbten Gefrierschnitte. Hier haben wir festgestellt, das Fingerabdruck-Spektren der elastischen Fasern in nativen Geweben Vergleich lyophilisierten Elastin und Immunfluoreszenz-gefärbten Kryoschnitten Verwendung eines Antikörpers gegen Elastin. Da jedoch Elastin verfügt über eine hohe Autofluoreszenz, die in den Raman-Spektren reflektiert wird, ist die Datenanalyse Herausforderung (3A). Um das systematische Versagen aufgrund von Probe-spezifische Eigenschaften wie Autofluoreszenz, eine angemessene Verarbeitung der Datenmengen zu reduzieren, ist von entscheidender Bedeutung. In unseren Daten einalyses, verwendeten wir Normierung auf die deutlich höhere Signalintensität des reinen Proteins Elastin beseitigen und so, konnten wir vergleichbare Raman-Spektren zu erzeugen (3B). Elastin ist eines der stabilsten ECM-Proteine ​​im Körper und ist daher sehr schwer abbaubar. 14. In unserem experimentellen Aufbau, Abbau induzierte Elastin wir bei gesunden Schweinen Aortenklappensegel indem eine enzymatische Verdauung. Die Anwendung der multivariaten Analyse PCA, identifizierten wir signifikante Unterschiede zwischen den Raman-Spektren von enzymatisch behandelten Proben und native Steuerelemente (Abb. 3C). Diese spektralen Unterschiede wurden in der Lade-Spektrum bei 861, 1003 und 1664 cm -1 beobachtet. Erwartete strukturelle Veränderungen der Elastin-Fasern durch längere Belichtungszeiten zu Elastase wurden von HART-Färbung (Abb. 4), die ebenfalls in deutlicher trennbar Punktzahl Cluster wurden reflektiert (Abb. 3C) gezeigt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mittlere Raman-Spektren von freistehenden und adhärente Fibroblasten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> 2. (A) Mittlere Raman-Spektren und Standardabweichung von vier verschiedenen primären isolierten Zelltypen (Fibroblasten, MSCs, Chondrozyten und Keratinozyten). Der Rahmen unterstreicht den Spektralbereich von 1280 - 1350 cm -1 mit strukturellen Unterschieden. (BE) Hellfeld-Bilder von Einzelhäusern (B) Fibroblasten, (C) MSCs, (D) und Chondrozyten (E) Keratinozyten. Maßstabsbalken entspricht 20 um. (FI) Hellfeld-Abbildungen von den anhängenden (F) Fibroblasten, (G) MSCs, (H) Chondrozyten und (I) Keratinozyten. Scale-bar gleich 200 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Abbildung 3. (A) Raman-Spektren ohne Normalisierung der lyophilized Elastin (blaue Linie), Immunfluoreszenz (IF)-markierten Kryoschnitten (orange Linie) und elastischen Fasern (rote Linie) im nativen Aortenklappensegel gemessen. Die hohe Signalintensität von lyophilisierten Elastin wird durch Autofluoreszenz verursacht. (B) Raman-Spektren nach der Normalisierung, um systemische Fehler zu beseitigen. (C) Spielstände und Belastungen der Vergleich zwischen unbehandelten Kontrollgruppe (rot) und enzymatisch abgebaut (blau und grün) elastischen Fasern innerhalb der nativen Gewebe. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Abbildung 4. Hirschzungenfarn gefärbten Schweinen Aortenklappensegel. Elastische Fasern sind visualisiert in schwarz. (A) und (B) zeigen unbehandelten Kontrollgruppe und (C) und (D) zeigen Gewebeproben, die dem Elastin abbauenden Enzym Elastase für 30 Minuten ausgesetzt wurden. <table border="1"><tbody><tr><td> Wellenzahl in cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Belegung 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Phospholipide </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA-Basen, OPO-Backbone </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Phenylalanin </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amid-III </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Protein / Lipid </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amid IC = C </td><td> Protein-Lipid </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Raman-Banden, die in Spektren aller Zelltypen (Fibroblasten, MSCs, Chondrozyten und Keratinozyten) erkannt werden.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Raman-Spektroskopie ist ein geeignetes Instrument, um biologische Proben, wie In-vitro-kultivierten Zellen und ECM-Proteine ​​sowie Zellen in natürlichem Gewebe analysieren. 11,15,16 Hier haben wir gezeigt, dass dieses berührungslose, ermöglicht Label-freien Technik der Unterscheidung verschiedener Zelltypen und der Nachweis von ECM Proteinabbau die ausschließlich auf der biomolekularen Zusammensetzung dieser biologischen Proben. Der große Vorteil der Raman-Spektroskopie ist die Fähigkeit, nicht invasiv zu quantifizieren die biochemische Fingerabdruck einer Probe durch die entstehende Raman-Spektren. Im Gegensatz zu Infrarot-Spektroskopie, die ähnliche Informationen liefert, können Raman-Spektren von wässrigen Proben gesammelt werden, wie die Raman-Streuung von Wasser ist schwach. Darüber hinaus wird die Raman-Spektroskopie ausschließlich auf dem Nachweis der Rückstreuung von monochromatischem Licht basiert, weshalb keine Probe Verarbeitung wird vor Messung erforderlich ist. Diese Attribute machen RaMann-Spektroskopie eine vielversprechende Alternative für potenzielle In-vivo-Imaging-Applikationen. In dieser Hinsicht ist kohärente Anti-Stokes Raman-Spektroskopie (CARS) eine sehr interessante Technik, da sie schneller und empfindlicher Erfassung von Daten auf den gleichen Schwingungs-Signale in unseren Experimenten verwendeten Basis ermöglicht. 15,16 Andere alternative Methoden, einschließlich Multiphotonen-induzierter Autofluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen Bildgebung wurden zuvor als geeignet erwiesen für die Überwachung der biologischen Proben nicht-oder minimal invasiv. 17 Allerdings sind diese bildgebenden Verfahren sind mit sehr hohen Kosten verbunden und werden an Autofluoreszenz-erzeugenden Moleküle beschränkt. Darüber hinaus ist Raman-Spektrometer leicht mit herkömmlichen optischen Mikroskopen verbinden. Diese Eigenschaften machen die Raman-Spektroskopie ein wertvolles Werkzeug, um biologische Proben in physiologischen Umgebungen zu studieren. Eines der aktuellen Einschränkungen unserer Raman-Spektroskopie ist eingerichtetDie relativ kleine Laserfokus (250 nm Halbwertsbreite (FWHM) seitliche und 700 nm FWHM axial), die von einer hohen numerischen Apertur Objektiv (NA = 1,2) erzeugt wird. Obwohl eine hohe numerische Apertur ermöglicht, eine gute Menge des emittierten Raman-Licht was in einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu decken, erzeugt die hohe NA nur eine kleine Auswahl Fokus innerhalb der Probe, die typischerweise viel kleiner als eine Zelle. Um Raman-Spektren von verschiedenen Zellen vergleichen zu können, ist die Sammlung von einer repräsentativen Spektrum wesentlich, das ist schwierig, mit einem kleinen Schwerpunkt zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, sind wir auf einem Prozess, um das Signal Sammlung an verschiedenen Stellen innerhalb der Zelle (= Raman-spektroskopische Mapping), was zu einer spektralen Mittelung und Nachgeben gegenüber einem repräsentativen Spektrum automatisieren arbeiten. Darüber hinaus wird diese Technik einen Überblick über die Verteilung der spezifischen Raman-Banden, zum Beispiel des Proteins innerhalb einer Zelle. Biol.miologische Proben sind sehr komplex und bestehen aus einem heterogenen Gemisch von Biomolekülen, die mit dem gesammelten Ramanspektren wirken. Daher ist die spektrale Muster sehr komplex und die Überwachung eines einzigen Typ eines Moleküls in einem Raman-Spektrum nur schwer mit der Überlagerung verschiedener Signale Molekül zu erreichen. Darüber hinaus kann intrinsische Fluoreszenz der Probe zu maskieren wertvolle Informationen schwächerer Raman-Signale. Interessanterweise wird in einigen unserer früheren Studien haben wir festgestellt, in den Raman-Spektren Autofluoreszenz als wichtigste Unterscheidungsmerkmal zwischen Zelltypen (MSCs und Fibroblasten) mit einem geeigneten Analyse-Tool. 13. Wir auch festgestellt, dass die Veränderung der gesamtwirtschaftlichen Raman-Signalintensität kann als dienen ein Indikator für den Zustand von Kollagen und kollagenen Fasern innerhalb der ECM von Aortenklappensegel. 9 jedoch bei der Analyse des Zustandes von Elastin in diesen Geweben, waren wir nicht in der Lage, ähnliche Ergebnisse zu erkennen. Wie in der Folge genanntens Abschnitt waren wir nur in der Lage, Veränderungen der spezifischen Raman-Banden in den Elastase-behandelten Proben erkennen, wenn auf die nativen Kontrollen verglichen. Wir haben nicht einen Rückgang des gesamten Raman-Signal in den enzymatisch behandelten Proben wie erwartet. Diese Beobachtungen führten zu einem Score-Diagramm, das nicht verraten wollte eine klare Cluster-Bildung wie in der vorherigen Studie beobachtet. 9 Im Gegensatz dazu der Einfluss der enzymatischen Behandlung wurde im Rahmen der PCA Ergebnisse nachweisbar. Wir gehen davon aus, dass diese Diskrepanzen zwischen den beiden ECM-Proteine, Elastin und Kollagen, auf morphologischen Unterschieden und unterschiedlichen enzymatischen Abbauprozessen beruhen: innerhalb der Aortenklappe Flugblatt, ist die Kollagen-reiche Zone (fibrosa) eine durchgehende Schicht, die durch das Lösen wird enzymatische Behandlung, wobei das Elastin enthaltende Zone (ventricularis) eine Netzwerk-Konfiguration, führen nach der Exposition gegenüber Elastase (4) angezeigt wird. Einzel-Messungen vor Ort waren daher nicht entspreaß, solche kleinen Brüche innerhalb der Elastin-Netzwerk zu erkennen. Hier würde ein Raman-Mapping des Gewebes zu helfen, um Netzwerk-Übersicht zu identifizieren. Eine weitere Herausforderung bei Raman-Spektroskopie von biologischen Proben ist, die Messung zu reduzieren. Eine Lösung ist, die Laserleistung, die geeignet, solange die biologischen Proben nicht durch Photo-Schäden betroffen ist zu erhöhen. Alle unsere aktuellen Experimente sind Proof-of-principle-Studien mit Schwerpunkt auf der Grundlagenforschung, allerdings ist unser übergeordnetes Ziel zu Raman-Spektroskopie für klinische Anwendungen einschließlich der regenerativen Medizin (z. B. Qualitätskontrolle von Tissue-Engineering-Produkten), vor der Transplantation Transplantat Überwachung und Umsetzung Krebsdiagnostik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Elastin-Antikörper </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; Citratpuffer </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> Glasboden Gerichte </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Die Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

berührungslose, label-freie Überwachung von zellen und extrazellulären matrix mittels raman-spektroskopie

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Zerstörungsfreie, berührungslose und Label-freien Technologien zur Zell-und Gewebekulturen zu überwachen sind auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung benötigt werden. 5.1 jedoch derzeit verfügbaren Methoden erfordern Routine Verarbeitungsschritte und die Integrität der Probe verändern. Raman-Spektroskopie ist ein schnelles Verfahren, das die Messung von biologischen Proben ermöglicht, ohne die Notwendigkeit für weitere Verarbeitungsschritte. . Dieser Laser-basierte Technologie erkennt die inelastische Streuung von monochromatischem Licht 6 Wie jede chemische Schwingung zu einem bestimmten Raman-Bande (Wellenzahl in cm -1) zugeordnet ist, verfügt jeder biologischen Probe eines typischen spektralen Muster aufgrund ihrer inhärenten biochemische Zusammensetzung 7. - 9 Im Raman-Spektren, die Peakintensitäten korreliert mit der Menge der vorliegenden molekularen Bindungen. 1 Ähnlichkeiten und Unterschiede der spektralen Datensätze unter Verwendung einer multivariaten Analyse (zB Hauptkomponentenanalyse (PCA)) detektiert werden kann. 10 </sup&gt; Hier führen wir die Raman-Spektroskopie an lebenden Zellen und nativen Geweben. Die Zellen werden entweder auf Glasboden ausgesät oder in der Schwebe gehalten unter normalen Bedingungen der Zellkultur (37 ° C, 5% CO 2) vor der Messung. Native Gewebe präpariert und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C vorherigen Messungen. Je nach unserer experimentellen Aufbau, wir dann entweder auf dem Zellkern oder extrazellulären Matrix (ECM) Proteine, wie Elastin und Kollagen konzentriert. Bei allen Untersuchungen werden mindestens 30 Zellen oder 30 zufällige Punkte von Interesse innerhalb des ECM gemessen. Daten Bearbeitungsschritte enthalten Hintergrund-Subtraktion und Normalisierung.

Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Im Bereich der biomedizinischen Forschung werden zerstörungsfreie, berührungslose und markierungsfreie Technologien zur Überwachung von Zell- und Gewebekulturen benötigt.1-5 Jedoch ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen und Gewebe mithilfe einer berührungslosen und markerfreien Methode zu überwachen. Dies wird durch die Raman-Spektroskopie erreicht, eine laserbasierte Technologie, die die inelastische Streuung von monochromatischem Licht erfasst und anhand der inhärenten biochemischen Zusammensetzung jedes biologischen Probenmusters ein typisches Spektralmuster erzeugt, wozu ein Standard-Fluoreszenzmikroskop mit einem Raman-Spektrometer gekoppelt wird. Der direkte Vergleich von Hellfeld- und Fluoreszenzbildern mit Raman-Spektren dient der Überwachung zahlreicher biologischer Proben. Jeder chemischen Schwingung wird eine spezifische Raman-Bande zugeordnet, und die Peakintensität korreliert mit der Menge der vorhandenen molekularen Bindungen. Ähnlichkeiten und Unterschiede der spektralen Datensätze werden erkannt. Durch die Anwendung einer multivariaten Analyse können die resultierenden Spektren verwendet werden, um die Integrität von Geweben nach der Entnahme einer Biopsie zu überprüfen oder die Sterilität isolierter Zellen nachzuweisen.Außerdem ermöglicht diese Technik die Charakterisierung und Identifizierung verschiedener Zelltypen in vitro. Letztendlich ist die Raman-Spektroskopie eine aussichtsreiche laserbasierte Methode für die Gewebezüchtung und klinische Anwendungen. Mithilfe einer berührungslosen, markierungsfreien Analyse wird das Verfahren von Daniel Cabal Barrio, einem Techniker, und Miriam Tala, einer Doktorandin in meinem Labor, demonstriert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Routineverfahren wie der Histologie und der Immunfluoreszenz-Bildgebung besteht darin, dass keine Probenvorbereitung erforderlich ist.Obwohl diese Methode Einblicke in den Zustand einzelner Zellen und Matrixkomponenten ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf mehrzellige Gewebe und Organe anwenden. Zur Herstellung maßgeschneiderter Ramanspektren wird ein Standard-Fluoreszenzmikroskop mit einem Raman-Spektrometer gekoppelt, das einen direkten Vergleich von Fluoreszenzbildern mit Raman-Spektren erlaubt. Der grundlegende Aufbau besteht aus einem 784 Nanometer Diodenlaser, einem Sperrfilter zur Trennung des Raman-streuten Lichts vom Anregungslicht, einem Mikroskop und einem Spektrografen mit einer auf die Detektion spektraler Informationen optimierten CCD-Kamera (charge coupled device).Um die Laserfunktion zu steuern, starten Sie die Software und/oder Solace und stellen Sie die Temperatur der CCD-Kamera auf minus 60 Grad Celsius ein, um das Rauschen durch thermisch induzierte Ströme in der Kamera zu minimieren. Platzieren Sie eine Siliziumscheibe auf dem Mikroskopständer für den Kalibrierungsprozess. Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie die Leistung auf 85 Milliwatt ein.Verwenden Sie die Softwarezelle B, um den Laser auf den Wafer zu fokussieren, bis XY erscheint. Messen Sie den Siliziumwafer mit einer einzelnen Integrationszeit von einer Sekunde. Verwenden Sie ein 60×-Luftobjektiv und ändern Sie die Einheit der X-Achse von Pixelanzahl auf Ramen.Die Verschiebung in der and- oder Soli-Software verändert den Laserfokus des Silikon-Peaks bei der Wellenzahl 520 im aufgezeichneten Spektrum. Um die maximale Intensität dieses Raman-Bands zu erzielen, muss die Mindestanzahl an Zählungen höher als 11.000 sein, um eine erfolgreiche Kalibrierung vor der Spektrenmessung sicherzustellen. Bereiten Sie die biologischen Proben gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Alle Messungen werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wie in diesem Video gezeigt.Unter Verwendung eines 60×-Wasserimmersionsobjektivs mit einer numerischen Apertur von 1,2 sollten Spektren mit 10 Integrationen pro 10 Sekunden über insgesamt 100 Sekunden pro Messung aufgezeichnet werden. Um haftende Zellen zu messen, stellen Sie eine Glasbodenkulturschale mit den Zellen auf den Mikroskoptisch. Um ein besseres Signal zu erhalten und die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, fokussieren Sie den Laser auf den Zellkern, schalten Sie das Mikroskoplicht aus und beginnen Sie mit der Aufnahme des Spektrums.Messen Sie alle 10 Spektren ein Referenzspektrum des Hintergrunds, indem Sie den Laserfokus neben die Zelle bewegen. Es ist wichtig zu beachten, dass bei einer Änderung der Fokustiefe ein neuer Hintergrund für jede Fokusebene aufgenommen werden muss. Alternativ überführen Sie zur Messung von Zellen in Suspension 100 Mikroliter der Zellsuspension in eine Glasbodenkulturschale.Nachdem die Probe auf dem Mikroskoptisch platziert wurde, fokussieren Sie den Laser auf das Zellzentrum, schalten Sie das Mikroskoplicht aus und beginnen Sie erneut mit der Spektrumsaufnahme. Messen Sie alle 10 Spektren ein Referenzspektrum des Hintergrunds, indem Sie den Laserfokus neben die Zelle verlagern. Um die Spektren nativer Gewebe zu messen, bringen Sie die Probe in eine Glasbodenkulturschale ein.Der interessierende Bereich sollte so ausgerichtet sein, dass er zur Unterseite der Schale zeigt. Füllen Sie die Schale mit ausreichend PBS, um die Probe zu bedecken. Legen Sie ein Deckglas über die Probe, um jegliche Bewegung der Probe zu vermeiden.Während der Messungen stellen Sie den Laserfokus auf die Struktur von Interesse ein und beginnen mit der Aufnahme der Spektren. Nehmen Sie alle 10 Spektren ein Referenzspektrum des Hintergrunds auf, indem Sie den Laserfokus außerhalb des gesamten Gewebebereichs positionieren, und erfassen Sie stets einen neuen Hintergrund für jede Fokustiefe bei der spektralen Messung von immunfluoreszenzmarkierten Kryoschnitten. Schneiden Sie frische, schockgefrorene Gewebeproben. Montieren Sie mithilfe eines Standard-Cryo-Ome auf silikabeschichteten Deckgläsern. Färben Sie die Kryoschnitte gemäß einem routinemäßigen Protokoll für Immunfluoreszenz, wobei nur ein kurzer Fixierungsschritt durchgeführt wird und geeignete Antikörper zur Detektion des Proteins der Wahl verwendet werden. Raman-Messungen, fokussiert auf den Bereich, in dem Fluoreszenz auftritt.Um Elastinabbau-Experimente zu demonstrieren, werden die Ventrikelseiten der präparierten porcinen Aortenklappenblättchen mit der Unterseite auf das Glas ausgerichtet. Unterer Probenträger. Messen Sie das native Gewebe als nicht inkubierte Kontrolle an 30 zufälligen Stellen über die gesamte Gewebeoberfläche hinweg. Das Fokussieren auf die faserigen Strukturen teilte die Probe in zwei Abschnitte, die in separate 2,5-Milliliter-Eppendorfgefäße gegeben wurden, die mit zwei Millilitern einer Elastase-Lösung gefüllt waren. Inkubieren Sie das Gewebe entweder 15 oder 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation entfernen Sie das Gewebe aus dem Eppendorfgefäß und waschen es vorsichtig mit PBS, um die enzymatische Reaktion vollständig zu stoppen.Messen Sie jede Probe an 30 zufälligen Stellen, wobei der Fokus auf die faserartigen Strukturen gerichtet ist. Die Verarbeitung der Raman-Spektren beginnt mit der Vorbehandlung der erzeugten Spektren mithilfe der Opus-Software. Ziehen Sie zunächst das entsprechende Hintergrundspektrum von den aufgezeichneten Spektren ab, um störende Signale des Glases und des Mediums zu reduzieren sowie Variationen aufgrund von Fokusveränderungen zu vermeiden.Reduzieren Sie während der Messungen das Spektrum auf den Wellenzahlbereich zwischen 401 und 800, der bei Bedarf die höchste Informationsdichte bietet. Normalisieren Sie die Spektren zur Maximum-Peak-Normalisierung, um Intensitätsschwankungen bei systematischen Fehlern auszugleichen und die Erkennung struktureller Veränderungen in den Probenspektren zu vereinfachen. Führen Sie eine Basislinienkorrektur durch, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Experimenten zu erhöhen.Analysieren Sie die Raman-Spektren mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit der Unscrambler-Software. Diese multivariate Analyse erfasst Unterschiede und Ähnlichkeiten innerhalb der Spektraldatensätze. Jedes Spektrum wird als einzelner Punkt in einem mehrdimensionalen Raum abgebildet, basierend auf den erfassten Zählraten für jede Raman-Verschiebung.Jede Hauptkomponente, abgekürzt als PC, beschreibt eine bestimmte Menge der Gesamtinformation, die in den ursprünglichen Daten enthalten ist. Die erste PC enthält die größte Variationsquelle. Jede nachfolgende PC enthält der Reihe nach weniger Information als die vorhergehende.Jede Variable besitzt eine Bewertung und eine Ladung für jede Hauptkomponente. Durch die Darstellung der Hauptkomponenten können wichtige Stichprobenkorrelationen aufgedeckt werden. Die Ladungen beschreiben den Beitrag jeder analysierten Variable zur PCA. Kennzeichnen Sie jede Messgruppe, indem Sie Zeilenbereiche für jede Probengruppe erstellen, und verwenden Sie die folgenden grundlegenden Einstellungen für die PCA-Kreuzvalidierung: den Nip-Al-Algorithmus, keine Rotation, und starten Sie die Analyse.Diese Einstellungen sind spektrumabhängig. Abschließend ist bei der Durchführung der PCA zu beachten, dass rohe Ramanspektren, die von anhaftenden Zellen generiert wurden, häufig ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und eine geringe Gesamtsignalintensität aufweisen. Der Laserfokus muss nahe am Glasboden eingestellt werden, was das eigentliche Signals des Probenmaterials überlagert.Daher könnte das Signal der Probe während einer nachfolgenden Hintergrundsubtraktion minimiert oder sogar vollständig eliminiert werden. Umgekehrt ermöglichen Zellen in Suspension die Detektion detaillierterer spektraler Informationen. Die Spektren von adhärenten und in Suspension kultivierten Zellen weisen jedoch dieselben Hauptpeaks auf, die sich lediglich in ihren Intensitäten unterscheiden entities zur Charakterisierung verschiedener Zelltypen innerhalb einer Suspension, ist keine Vorbehandlung erforderlich.Die mittleren Raman-Spektren und Standardabweichungen von humanen Fibroblasten, mesenchymalen Stammzellen, Chondrozyten und Keratinozyten, gemessen in Suspension, sind hier dargestellt. Alle Raman-Spektren weisen eine ähnliche Struktur auf, mit Peaks, die von typischen Biomolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden stammen. Für diese Zelltypen enthält der spektrale Bereich zwischen der Wellenzahl 601 und 800 die relevantesten spektralen Informationen, anhand derer klare Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelltypen nachweisbar sind.Ein beispielhafter spektraler Bereich zeigt deutliche strukturelle Unterschiede, die molekularen Schwingungen von Kollagen und Lipiden zugeordnet werden können. Im Gegensatz dazu eignen sich morphologische Analysen nicht zur Identifizierung und Unterscheidung der meisten Zellen. Während der Unterschied zwischen Chondrozyten und Hautzellen beobachtbar ist, sind Fibroblasten und mesenchymale Stammzellen schwer voneinander zu trennen.Unter ausschließlicher Verwendung der Hellfeldmikroskopie zur Zuordnung von natives Gewebe zu einem spezifischen Fingerabdruckspektrum wurden Raman-Spektren kommerziell erhältlicher reiner Proteine sowie immunhistologisch gefärbter Kryoschnitte erzeugt. Hierbei wurden Fingerabdruckspektren elastischer Fasern in natives Gewebe durch Vergleich mit lyophilisiertem Elastin und immunfluoreszent gefärbten Kryoschnitten identifiziert, die mit einem Antikörper gegen Elastin markiert waren. Da Elastin jedoch eine starke Autofluoreszenz aufweist, die sich in den Raman-Spektren widerspiegelt, ist die Datenanalyse herausfordernd, um systematische Fehler aufgrund probespezifischer Eigenschaften wie der Autofluoreszenz zu minimieren, und eine geeignete Verarbeitung der Datensätze ist entscheidend.Bei der Datenanalyse wurde eine Normalisierung verwendet, um die deutlich höhere Signalintensität des reinen Elastins zu eliminieren, wodurch vergleichbare Raman-Spektren entstanden. Elastin ist eines der stabilsten Proteine der extrazellulären Matrix im Körper und daher äußerst schwer abbaubar. Hier.Der Elastinabbau wurde in gesunden porcinen Aortenklappenblättchen durch eine enzymatische Verdauung induziert; mittels multivariater Analyse wurden mittels PCA signifikante Unterschiede zwischen den Raman-Spektren enzymatisch behandelter Proben und nativen Kontrollen identifiziert. Diese spektralen Unterschiede zeigten sich im Ladespektrum bei Wellenzahlen von 861, 1003 und 1.664. Erwartete strukturelle Veränderungen in den elastinhaltigen Fasern infolge verlängerter Expositionszeiten gegenüber Elastase spiegelten sich in deutlicher separierbaren Score-Clustern wider, die hier die Scores des Vergleichs zwischen unbehandelten Kontrollen und enzymatisch abgebauten elastischen Fasern im nativen Gewebe darstellen. Diese erwarteten strukturellen Veränderungen sind ebenfalls in den angefärbten porcinen Aortenklappenblättchen des Herzens sichtbar, wie in diesem Ausschnitt durch den Vergleich der unbehandelten Kontrolle mit den Gewebeproben, die 30 Minuten lang dem elastinabbauenden Enzym Elastase ausgesetzt waren, veranschaulicht wird.Diese Technik er&ouml;ffnet Forschern auf den Gebieten der Zell- und Matrixbiologie sowie der regenerativen Medizin und Gewebeengineering die M&ouml;glichkeit, nicht nur die Analyse des Zellph&auml;notyps in Echtzeit durchzuf&uuml;hren, sondern auch entscheidende Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen in Zwei innerhalb eines nativen Milieus zu identifizieren.

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