Name: Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Lernen Sie die Nano-FEM-Methode zur Proteinlokalisierung in Elektronenmikrografien mit korrelierter Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie an transgenen Nematoden. Diese Technik ermöglicht präzise Bildgebung von Histone-Proteinen im Zellkern.

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Wir danken Harald Hess und Eric Betzig für den Zugang zum PALM Mikroskop für proof-of-principle Experimente, Richard Fetter für den Austausch Fixierung Protokollen, Reagenzien und Ermutigung. Wir danken Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema und Marc Hammarlund für die DNA-Konstrukte. Wir danken auch Carl Zeiss Inc. für den Zugang zu den Zeiss PAL-M, eine Beta-Version des Zeiss ELYRA P.1 PALM Mikroskop.

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<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
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<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
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Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel wird von Carl Zeiss, Inc. gesponsert

Hier beschreiben wir, wie man fluoreszierende Proteine ​​erhalten in Kunststoff, lokalisieren die fluoreszierenden Proteine ​​in den Abschnitten und Bild die Ultrastruktur mittels Elektronenmikroskopie. Die Proteine ​​wurden unterhalb der Beugungsgrenze mit PALM Mikroskopie Nanometer-Auflösung lokalisiert. Um dieses Protokoll zu bestimmten Proben anzupassen, sollte die folgenden Parameter berücksichtigt werden: Fluorophor, Quantifizierung und Ausrichtung. Die Wahl des fluoreszierenden Proteins oder organischen Fluorophor hängt von der Anwendung und dem Modellsystem. Wir haben eine Vielzahl von fluoreszierenden Proteinen, einschließlich EGFP, YFP, Citrin, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry und Dendra 12 getestet. Die Erhaltung der Fluoreszenz von jedem Fluorophor war ähnlich, was darauf hindeutet, dass alle fluoreszierenden Proteinen erhalten kann mit dem beschriebenen Verfahren werden. Wir wählten tdEos weil es ausgesprochen gut in C. elegans, blieb Proteine ​​funktionell, wenn die tdEos verschmolzen, und weil seinePhotoaktivierung Eigenschaften waren optimal für PALM Mikroskopie. Allerdings hat Aggregation oder nicht Ausdruck tdEos wurde gelegentlich beobachtet 12. Je nach Anwendung kann ein anderes Fluorophor besser geeignet sein. In vielen Fällen ist es nicht notwendig, einen photoaktivierten fluoreszierenden Proteins zu verwenden. Einfache korrelative Fluoreszenz Elektronenmikroskopie erfordert keine photoaktivierten Fluoreszenzprotein. GFP oder organische Farbstoffe zur Bilder Fluoreszenz markierte Proteine ​​in den Abschnitten oberhalb der Beugungsgrenze verwendet werden. Beispielsweise kann ein Bild, ein Axon in einem Neuropil mittels Fluoreszenzmikroskopie und korrelieren das Fluoreszenzsignal einer bestimmten Axons in einer elektronenmikroskopischen Aufnahme durch Abbilden der Fluoreszenz an einem Fluoreszenzmikroskop. Andere Superauflösung Techniken wie stimulierte Emission Mikroskopie (STED) 12, Grundzustand Depletion-Mikroskopie von einzelnen Moleküls Rücklauf (GSDIM) 13 gefolgt, undstrukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM) 14, erfordern keine photoaktivierten fluoreszierende Proteine. Darüber hinaus sind super-resolution imaging Techniken, organischen Farbstoffen 9,15,16 oder die intrinsische Eigenschaft von fluoreszierenden Sonden 17 verwenden leicht anwendbar. In PALM, kann die Anzahl der Moleküle, da quantifizierte Fluoreszenz jedes Molekül räumlich und zeitlich getrennt werden. Allerdings kann die Quantifizierung für vier Gründen irreführend: Oxidation, Unterschätzung, Überzählen und Überexpression. Erstens kann ein Bruchteil der fluoreszierenden Proteine ​​denaturiert oder oxidiert während Probenprozessierungsvorrichtung 5,12. Obwohl ~ 90% des Fluoreszenzsignals durch Fixierung und Einbettung in unserem Protokoll erhalten wurde, kann eine Oxidation des fluoreszierenden Proteins auftreten, nachdem die Probe wurde geschnitten und die Oberfläche Sauerstoff ausgesetzt. Zweitens ist die Aktivierung der photoaktivierbaren Proteine ​​stochastischen und somit mehrere Moleküle könnenaktiviert in einer gegebenen beugungsbegrenzten Fleck 8. Fluoreszenz von den mehreren Moleküle wird als einer Stelle erscheinen und somit die Gesamtzahl der Proteine ​​wird undercounted werden. Drittens kann ein ähnliches Problem zu Überzählen führen. In PALM wird jedes fluoreszierende Protein lokalisiert und dann auf &quot;Löschen&quot; durch Bleichen. Allerdings können fluoreszierende Proteine ​​aus dem dunklen Zustand, ohne dauerhaft gebleichte 18 zurückzukehren. Solche Moleküle werden dann mehrfach gezählt werden. Viertens tagged Proteine ​​als Transgene exprimiert und sind oft in mehreren Kopien, die zur Überexpression führen kann präsentieren. Daher kann die Quantifizierung von PALM für die Schätzung jedoch nicht genau bestimmen die Anzahl von Molekülen in einer bestimmten Position ist. Die Ausrichtung eines PALM Bild mit einer elektronenmikroskopischen Aufnahme kann auch wegen der Auflösung Unterschied in Licht und Elektronenmikroskopie und Verzerrung, die durch den Elektronenstrahl hervorgerufen Herausforderung sein. Goldpartikel dienen als dicht locsierte Bezugsmarkierungen in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Allerdings ist fluoresecence aus Gold Partikel nicht photoaktivierten und erscheint als eine große beugungsbegrenzten Fleck. Somit ist die Platzierung eines Fluoreszenzbilds auf einer elektronenmikroskopischen Aufnahme eine Schätzung. Verzerrungen können auch aus Wechselwirkungen der Elektronen mit dem Kunststoffteil entstehen. Acrylharze wie GMA sind weniger stabil unter dem Elektronenstrahl, und die Abmessungen des Kunststoffes verändert werden kann. Unter diesen Umständen kann das Ausrichten des Fluoreszenz mit Ultrastruktur die nicht-lineare Transformation der Bezugsmarkierungen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hochdruck-Gefrierschrank </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> Empact und HPM 100 von Leica oder hpf-01 ab Wohlwend können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> Automatisierte freeze Substitutionseinheit </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 kann auch verwendet werden. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon und Vutara verkaufen auch Gewerbe PALM Mikroskope. </td></tr><tr><td> Rasterelektronenmikroskop </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Andere hochauflösenden SEM Mikroskope verwendet werden kann. </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459.844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumpermanganat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetat </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH-Wert von Uranylacetat von diesem Unternehmen etwas höher ist. </td></tr><tr><td> Glycol-Methacrylat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02.630-AA </td><td> Low Säure, TEM Klasse. </td></tr><tr><td> N, N-Dimethyl-p-toluidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryoröhrchen </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Glasfläschchen </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar Film </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM Kapsel </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC Schläge </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Gold-Nanopartikel </td><td> Mikrosphären-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Fordern 2x konzentrierte Lösung </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization mit photo-aktivierten localization microscopy and electron microscopy

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Abbilden der Verteilung von Proteinen ist wesentlich für das Verständnis der Funktion von Proteinen in einer Zelle. Fluoreszenzmikroskopie wird weitgehend für Proteinlokalisierung, aber subzelluläre Zusammenhang ist oft in Fluoreszenz-Aufnahmen fehlen. Immuno-Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite kann lokalisieren Proteine, aber die Technik ist durch das Fehlen von Antikörpern kompatibel, schlechte Konservierung von Morphologie und begrenzt, da die meisten Antigene nicht zur Probenoberfläche ausgesetzt sind. Korrelativen Ansätzen kann die Fluoreszenz Bild aus einer ganzen Zelle erst einmal erwerben, entweder von Immun-Fluoreszenz oder genetisch markierten Proteine. Die Probe wird dann fixiert und für die Elektronenmikroskopie eingebettet und die Bilder korreliert werden 1-3. Jedoch schließt die niedriger Auflösung Fluoreszenzbild und das Fehlen von Bezugsmarkierungen die genaue Lokalisierung von Proteinen. Alternativ können Fluoreszenz-Bildgebung nach Erhalt der Probe in Kunststoff ausgeführt werden. Indieser Ansatz ist der Block geschnitten und Fluoreszenzbilder und elektronenmikroskopische Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt sind 4-7 korreliert. Allerdings überdeckt die Beugungsgrenze des Lichts in dem korrelierten Bild die Positionen der einzelnen Moleküle, und die Fluoreszenz erstreckt sich oft über die Grenze der Zelle. Nano-Auflösung Fluoreszenz-Elektronenmikroskopie (nano-FEM), zur Lokalisierung von Proteinen im nanoskaligen Maßstab durch bildgebende den gleichen Abschnitten mit Foto-activated localization microscopy (PALM) und Elektronenmikroskopie. PALM überwindet die Beugungsgrenze durch bildgebende einzelner fluoreszierender Proteine ​​und anschließend Kartierung der Schwerpunkt jedes fluoreszierenden Fleck 8-10. Wir skizzieren die Nano-FEM-Technik in fünf Schritten. Zuerst wird die Probe fixiert und eingebettet unter Verwendung von Bedingungen, die die Fluoreszenz des markierten Proteinen zu erhalten. Zweitens sind die Harz-Blöcke in ultradünnen Segmente (70-80 nm), die montiert sind geschnitteneauf einem Deckglas. Drittens wird die Fluoreszenz in diesen Abschnitten mit dem Zeiss PALM Mikroskop abgebildet. Viertens werden Elektronen dichte Strukturen in den gleichen Abschnitten mit einem Rasterelektronenmikroskop abgebildet wird. Fünftens werden die Fluoreszenz-und elektronenmikroskopische Aufnahmen ausgerichtet mit Goldpartikeln Bezugsmarken. Zusammenfassend kann die subzelluläre Lokalisation von fluoreszent markierte Proteine ​​in einer Auflösung im Nanometerbereich auf etwa eine Woche bestimmt werden.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Lokalisierung fluoreszent markierte Proteine ​​in elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Fluoreszenz wird zuerst lokalisiert durch Foto-activated localization microscopy auf ultradünne Schnitte. Diese Bilder werden dann an elektronenmikroskopischen Aufnahmen von dem gleichen Abschnitt ausgerichtet ist.

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Die Kartierung der Proteinverteilung ist essenziell für das Verständnis der Funktion von Proteinen in einer Zelle. Die Fluoreszenzmikroskopie wird in großem Umfang für ... verwendet.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine in Elektronenmikrografien mittels korrelierter Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie zu lokalisieren. Diese Methode, bekannt als nanoFEM, wird verwendet, um Proteine in C. elegans zu lokalisieren. Zunächst wird ein transgener Wurm, der Histone-TD-Eos exprimiert, in Kunstharz eingebettet und geschnitten.Jeder Abschnitt wird sowohl mittels photoaktivierter Lokalisierungsmikroskopie oder PALM als auch mittels Rasterelektronenmikroskopie abgebildet. Die beiden Mikroaufnahmen für jeden Abschnitt werden mithilfe von Referenzmarkern mit Photoshop ausgerichtet. Das korrelative Bild zeigt die Lokalisation von Histonmolekülen im Zellkern. Der Hauptvorteil der Technik, die wir heute beschreiben werden, besteht also darin, dass wir anstelle von Immuno-EM genetisch kodierte Fluoreszenzfarbstoffe verwenden, sodass jedes Protein mit einem fluoreszierenden Protein assoziiert ist. Bei der Verwendung von Immuno-EM können viele Antikörper nicht mit Kunststoffen interagieren. Dies ist einfach nicht kompatibel, und selbst wenn es der Fall ist, können die Antikörper nicht tief genug in den Schnittbereich eindringen, in dem sich die Antigene befinden.Mithilfe von fluoreszierenden Proteinen wird jedes Protein mit einem Fluorophor markiert. Heute wird also Shige Wbi diese Technik demonstrieren. Die folgende Vorgehensweise wird an transgenen Nematoden gezeigt, die mit dem fluoreszierenden Protein TDE os markierte Histone exprimieren.Für diese Demonstration verwenden wir Bakterien als Kryoschutzmittel, aber Sie können auch 20 % BSA zum Einfrieren von *C. elegans* verwenden. Eine Stunde vor der Gefriertauschung füllen Sie die automatisierte Gefriertauschung oder ein FS-Gerät mit flüssigem Stickstoff. Bereiten Sie zudem im Voraus die benötigten Fixierungslösungen gemäß den Anweisungen im beigefügten Dokument vor, lagern Sie die Fixierungslösungen in Portionen zu je einem Milliliter in Kryoröhrchen und stellen Sie diese bis zur Verwendung in flüssigen Stickstoff.Verwenden Sie einen Pinsel, um die Tiere von einem Bakterienrasen abzunehmen und sie in einen 100-Mikron-Probenbehälter zu überführen. Füllen Sie die Vertiefung leicht über, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen. Danach platzieren Sie den Probenbehälter in der Halterung eines Hochdruckgefriermikroskops, um die Probe einzufrieren. Anschließend überführen Sie die Probe unverzüglich in ein flüssiges Stickstoffbad neben der Gefrierkammer.Als Nächstes das Probenmaterial mit einem Spatel und einer Pinzette in ein Kryoröhrchen mit Fixierungslösung überführen. Dabei sicherstellen, dass die Probe stets unter flüssigem Stickstoff bleibt. Diesen Vorgang für jede Probe wiederholen und anschließend alle Kryoröhrchen in eine FS-Einheit überführen.Nachdem alle Kryoröhrchen in eine FS-Einheit eingebracht wurden, starten Sie das Programm. Der Gefrier- und Verarbeitungsprotokoll ist in diesem Diagramm dargestellt. Während der anfänglichen Inkubation bei minus 90 Grad Celsius wird das glasartige Eis durch das Fixativ in Aceton ersetzt.Dann, wenn die Probentemperatur ansteigt, vernetzt das Fixativ im flüssigen Aceton die Probe, um die Struktur zu erhalten. Wenn die Temperatur in der FS-Einheit minus 60 Grad Celsius erreicht, stellen Sie Szintillationsgefäße mit 20 Milliliter 95 %igem Aceton in die FS, um sie abzukühlen. Sobald dann die Temperatur minus 50 Grad Celsius erreicht, entfernen Sie mit einer Pasteurpipette und einer P-200-Spitze das Fixativ und geben etwa ein Milliliter vorgekühltes 95 %iges Aceton zu jeder Probe hinzu. Galle.Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 20 Minuten über einen Zeitraum von zwei Stunden. Außerdem stellen Sie während der Inkubation bei minus 50 Grad Celsius eine Szintillationsflasche, die 20 Milliliter 0,1 %iger Urinacetatlösung in 95 % Aceton enthält, in die FS-Kammer, um sie auf minus 50 Grad Celsius vorzukühlen. Fügen Sie danach, nach dem letzten Acetonwaschgang, etwa ein Milliliter Urinacetatlösung zu jeder Flasche hinzu, um die Probe anzufärben und den Membrankontrast zu verbessern.Wenn das Programm unterbrochen wurde, starten Sie es erneut. Wenn die Temperatur minus 40 Grad Celsius erreicht hat, stellen Sie Szintillationsgefäße mit 95 % Ethanol in die FS-Kammer. Wenn die Temperatur minus 30 Grad Celsius erreicht hat, ersetzen Sie alle 20 Minuten über einen Zeitraum von zwei Stunden mithilfe einer Pasteurpipette das Urinacetat durch 95 % Ethanol.Es ist wichtig, in diesem Schritt Ethanol zu verwenden, da das Harz in Gegenwart von Aceton nicht polymerisiert. Im nächsten Teil des Protokolls werden die Proben in Kunststoff eingebettet, während die Proben bei minus 30 Grad Celsius gehalten werden. In der a FS ersetzen Sie nach drei bis fünf Stunden das 95 % Ethanol durch vorab gekühltes 30 % Glykolsäuremethacrylatharz oder GMA in 95 % Ethanol; nach vier bis sechs Stunden ersetzen Sie das 30 % GMA durch 70 % GMA; danach entfernen Sie das 70 % GMA und inkubieren die Proben über Nacht in 97 % GMA.Die schrittweise Erhöhung der GMA-Konzentration ermöglicht das Eindringen des Mediums in die Gewebe. Beachten Sie, dass da 3 % Wasser dem GMA-Harz zugesetzt wird, 97 % GMA nicht verdünnt ist. Mit Ethanol am nächsten Tag überführen Sie die Proben mithilfe einer Pasteur-Pipette in eine Einbettform in der A FS, stellen Sie die Proben in die Einbettform und tauschen dann das 97 % GMA dreimal innerhalb von sechs Stunden bei minus 30 Grad Celsius gegen frisch hergestelltes GMA aus.Nach dem dritten Austauschschritt klopfen Sie leicht auf die Bakterienmatrix, um die Probe vom Kryoschutzmittel zu trennen. Geben Sie den Initiator nn-Dimethyl-Udin zum 97 %igen GMA in einem Belüftungsfläschchen hinzu. Die Menge des hinzugefügten Initiators beträgt 1,5 Mikroliter pro Milliliter GMA. Geben Sie die GMA-Lösung unverzüglich in jede Einbettform und positionieren Sie die Tiere so in der Form, dass sie gleichmäßig verteilt sind.Starten Sie das Programm erneut, damit die Temperatur auf minus 20 Grad Celsius ansteigt. Obwohl das Harz innerhalb einer Stunde schnell polymerisiert, lassen Sie den Kunststoff über Nacht bei minus 20 Grad Celsius aushärten. Um sicherzustellen, dass die Polymerisation vollständig abgeschlossen ist.Nachdem der Kunststoff ausgehärtet ist, das Präparat in einer mit Stickstoffgas gefüllten Vakuumtütte bei minus 20 Grad Celsius lagern. Das Schneiden von in GMA eingebetteten Präparaten sollte anschließend wie in der beigefügten Anleitung für die fotoaktivierbare Lokalisierungsmikroskopie oder PALM-Bildgebung beschrieben durchgeführt werden. Das Mikroskopsystem sollte mit der E-M-C-C-D-Kamera, die auf minus 70 Grad Celsius oder darunter eingestellt ist, eingerichtet werden.Tragen Sie mithilfe einer Pipette etwa 50 µL 100 Nanometer großer Goldpartikel in einer Konzentration von 1×10¹⁰ Partikel pro Milliliter auf die zu bildende Probe auf. Legen Sie eine schwarze Abdeckung über die Proben und lassen Sie die Lösung 30 Sekunden lang auf dem Deckglas stehen. Um die Goldlösung zu entfernen, blasen Sie diese an den Rand des Deckglases und nehmen die Lösung mit einem Kim-Tuch auf.Tragen Sie dann Vakuumfett auf einen runden Deckglas-Halter auf und setzen Sie das Deckglas ein. Geben Sie Immersionsöl auf die Unterseite des Decks. Setzen Sie es direkt unterhalb der Probe an.Setzen Sie den Probenträger in den Schlitz am Mikroskoptisch ein und justieren Sie ihn so, dass er fest sitzt und die Schnitte über dem Objektiv zentriert sind. Achten Sie besonders darauf, die Objektive nicht zu berühren. Suchen Sie anschließend mithilfe der Hellfeldbeleuchtung die Schnitte mit einem 10×-Objektiv ein.Danach auf das 100×-Objektiv wechseln und auf die Probe fokussieren. Gegebenenfalls auf Fluoreszenzanregung umschalten, wobei der 488 Nanometer Laser mit einer Intensität von 10 % verwendet wird. Fünf Minuten warten, damit sich die Probentemperatur einstellen kann. Anschließend die Bereiche mit der stärksten Fluoreszenz identifizieren und scharfstellen.Schalten Sie die Laser auf 561 Nanometer um und erhöhen Sie die Intensität auf 100 %. Um die Hintergrundautofluoreszenz auszulöschen, belichten Sie die Probe etwa zwei Minuten lang. Falls sich die Fokussierung während des Auslöschens verändert, warten Sie fünf Minuten, bevor Sie die Fokussierung korrigieren und Bilder aufnehmen. Sobald das Auslöschen abgeschlossen ist, schalten Sie den 405 Nanometer Laser ein und stellen Sie ihn auf die niedrigste Intensität.Beginnen Sie mit der Aufnahme der Bilder mit 20 Bildern pro Sekunde. Sammeln Sie genügend Bilder, um das Ziel des Experiments zu erreichen. Hier werden 5.000 bis 6.000 Bilder aufgenommen, um die Lokalisation von 584 Histonproteinen innerhalb eines Zellkerns zu bestimmen.Nachdem 5.000 Einzelbilder aufgenommen wurden, werden alle Moleküle mithilfe der Bildverarbeitungssoftware identifiziert und kartiert. Das endgültige Fluoreszenzbild, auch sogenanntes „Sofortbild“, ist eine Zusammensetzung aller auf der Kamera detektierten Fluoreszenzsignale. Im Gegensatz dazu bildet das PALM-Bild die OID jeder fluoreszierenden Stelle ab und zeigt lediglich an, wo sich jedes Protein befindet.Vor der REM-Bildgebung färben Sie die Schnitte vier Minuten lang mit 2,5 % Urinacetat in Wasser. Spülen Sie das Urinacetat gründlich mit filtriertem Milli-Q-Wasser ab. Nach dem Trocknen der Schnitte beschichten Sie die Deckgläser mit einer Kohlenstoffschicht mittels Sputtern, bis sie deutlich dunkel erscheinen.Bringen Sie leitendes Kohlenstoffband an der Kante der Deckglasabdeckung an einem Ende und am Metallstummel am anderen Ende an, damit die sich auf der Oberfläche der Deckglasabdeckung ansammelnden Elektronen geerdet werden. Befestigen Sie die Deckglasabdeckung in der SEM-Kammer und lokalisieren Sie die Probe im Mikroskop. Erstellen Sie ein Bild mit niedriger Vergrößerung der Probe, zoomen Sie dann in den Bereich von Interesse und gewinnen Sie Aufnahmen mit hoher Vergrößerung.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem neuen Abschnitt, bis alle Abschnitte abgebildet wurden. Anschließend müssen die PALM- und EM-Aufnahmen ausgerichtet werden. Öffnen Sie dazu zunächst die aufgenommenen REM-Bilder in Photoshop.Erstellen Sie ein neues Fenster mit den Abmessungen 5.000 × 5.000 Pixeln und einer Auflösung von 300 Pixeln pro Zoll. Kopieren Sie das geladene SEM-Vergrößerungsbild in das neue Fenster. Verwenden Sie den Befehl „Freies Transformieren“ im Bearbeiten-Menü, um das Bild so zu skalieren, dass es das gesamte Fenster ausfüllt.Kopieren Sie anschließend die SEM-Aufnahmen mit höherer Vergrößerung und skalieren und transformieren Sie sie nach Bedarf. Wählen Sie die Bildrotation aus der Bild-Dropdown-Menüleiste und spiegeln Sie das Sum-Turf-Bild horizontal. Kopieren und fügen Sie das Sum-Turf-Bild in eine neue Ebene ein.Verwenden Sie den Befehl „Freies Transformieren“ im Bearbeitungsmenü, um das Bild so zu skalieren, dass es ungefähr die gleiche Größe wie das Elektronenmikrograf mit niedriger Vergrößerung hat. Drehen Sie anschließend das Bild nach Bedarf, um die Fluoreszenz der Goldpartikel mit den entsprechenden in dem REM sichtbaren Strukturen abzugleichen. Kopieren Sie danach das Palmblattbild in eine neue Ebene und wenden Sie die gleiche Transformation an, um ein Bild mit höherer Vergrößerung zu extrahieren.Heranzoomen auf den interessierenden Bereich und Kopieren des Palmenbildes aus diesem Bereich. Das Bild in ein SEM-Bild mit höherer Auflösung für die Präsentation einfügen. Auf das Palmenbild sollte eine Transparenzverlauf angewendet werden, sodass nur der schwarze Hintergrund, nicht jedoch die Palmen-Signale transparent werden.Kopieren Sie das Transform-Palm-Bild in eine neue Ebene. Wählen Sie mithilfe der Farbbereichsfunktion im Auswahlmenü die Palmensignale, jedoch nicht den Hintergrund aus. Wählen Sie anschließend ein Hintergrundpixel als Referenz aus und aktivieren Sie die Invertierungsoption.Schneiden Sie die gewünschten Palmensignale aus und fügen Sie sie in eine neue Ebene ein. Wenden Sie Transparenz auf die Hintergrundebene an und stellen Sie diese auf 10 % ein. Dies ermöglicht die Visualisierung der Palmensignale, indem der Hintergrund transparent gemacht wird, ohne die Intensität zu beeinträchtigen. Histonprotein.Das mit His 11 markierte TD-Eos wurde stabil im Nematoden C. elegans exprimiert, und die transgenen Tiere wurden gemäß dem in diesem Video beschriebenen Protokoll aufgearbeitet und abgebildet. PALM- und Elektronenmikrografien wurden aus demselben Schnitt gewonnen. Die Goldnanopartikel, die sowohl in den Fluoreszenz- als auch in den Elektronenmikrografien sichtbar sind, wurden anschließend zur Ausrichtung der beiden Bilder verwendet.Hier betrachten wir einen Bereich nahe dem oberen Ende des Mikrofotos vergrößert. Wie hier zu sehen ist, subzelluläre Strukturen wie ein Zellkern.Ein Kern, nukleäre Poren und das endoplasmatische Retikulum können beobachtet werden. Die markierten Histonmoleküle sind jedoch ausschließlich im Kern lokalisiert, nicht aber im Kerninneren. Wie erwartet ermöglicht die korrelative PALM- und Elektronenmikroskopie somit die Proteinlokalisierung mit höchster Auflösung. Nach Durchführung dieses Verfahrens kann man diese Schnitte mit der Proteindistribution nehmen und mittels Array-Tomographie stapeln, um eine dreidimensionale Struktur zu erzeugen, die zeigt, wo die Proteine in der Zelle verteilt sind.Und beachten Sie, dass Osmiumtetroxid eine sehr gefährliche Chemikalie ist, und Sie sollten immer Handschuhe tragen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die CryoAPEX-Methode, bei der ein APEX2-markiertes Membranprotein durch Transmissionselektronenmikroskopie innerhalb optimal konservierter Zell-Ultrastruktur lokalisiert werden kann.

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine klonierbare elektronenmikroskopische Markierungstechnologie zum Nachweis von Metallothionein-markierten Proteinen in Zellen unter Verwendung einer neuartigen, auf dem Mechanismus der Autonukleationsunterdrückung basierenden Gold-Nanopartikel-Synthesetechnik.

Direkte Synthese von EM-sichtbaren Gold-Nanopartikeln in Zellen zur Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur

Lernen Sie die Nano-FEM-Methode zur Proteinlokalisierung in Elektronenmikrografien mit korrelierter Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie an transgenen Nematoden. Diese Technik ermöglicht präzise Bildgebung von Histone-Proteinen im Zellkern.

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

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