Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine in Elektronenmikrografien mittels korrelierter Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie zu lokalisieren. Diese Methode, bekannt als nanoFEM, wird verwendet, um Proteine in C. elegans zu lokalisieren. Zunächst wird ein transgener Wurm, der Histone-TD-Eos exprimiert, in Kunstharz eingebettet und geschnitten.

Jeder Abschnitt wird sowohl mittels photoaktivierter Lokalisierungsmikroskopie oder PALM als auch mittels Rasterelektronenmikroskopie abgebildet. Die beiden Mikroaufnahmen für jeden Abschnitt werden mithilfe von Referenzmarkern mit Photoshop ausgerichtet. Das korrelative Bild zeigt die Lokalisation von Histonmolekülen im Zellkern.

Der Hauptvorteil der Technik, die wir heute beschreiben werden, besteht also darin, dass wir anstelle von Immuno-EM genetisch kodierte Fluoreszenzfarbstoffe verwenden, sodass jedes Protein mit einem fluoreszierenden Protein assoziiert ist. Bei der Verwendung von Immuno-EM können viele Antikörper nicht mit Kunststoffen interagieren. Dies ist einfach nicht kompatibel, und selbst wenn es der Fall ist, können die Antikörper nicht tief genug in den Schnittbereich eindringen, in dem sich die Antigene befinden.

Mithilfe von fluoreszierenden Proteinen wird jedes Protein mit einem Fluorophor markiert. Heute wird also Shige Wbi diese Technik demonstrieren. Die folgende Vorgehensweise wird an transgenen Nematoden gezeigt, die mit dem fluoreszierenden Protein TDE os markierte Histone exprimieren.

Für diese Demonstration verwenden wir Bakterien als Kryoschutzmittel, aber Sie können auch 20 % BSA zum Einfrieren von *C. elegans* verwenden. Eine Stunde vor der Gefriertauschung füllen Sie die automatisierte Gefriertauschung oder ein FS-Gerät mit flüssigem Stickstoff. Bereiten Sie zudem im Voraus die benötigten Fixierungslösungen gemäß den Anweisungen im beigefügten Dokument vor, lagern Sie die Fixierungslösungen in Portionen zu je einem Milliliter in Kryoröhrchen und stellen Sie diese bis zur Verwendung in flüssigen Stickstoff.

Verwenden Sie einen Pinsel, um die Tiere von einem Bakterienrasen abzunehmen und sie in einen 100-Mikron-Probenbehälter zu überführen. Füllen Sie die Vertiefung leicht über, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen. Danach platzieren Sie den Probenbehälter in der Halterung eines Hochdruckgefriermikroskops, um die Probe einzufrieren. Anschließend überführen Sie die Probe unverzüglich in ein flüssiges Stickstoffbad neben der Gefrierkammer.

Als Nächstes das Probenmaterial mit einem Spatel und einer Pinzette in ein Kryoröhrchen mit Fixierungslösung überführen. Dabei sicherstellen, dass die Probe stets unter flüssigem Stickstoff bleibt. Diesen Vorgang für jede Probe wiederholen und anschließend alle Kryoröhrchen in eine FS-Einheit überführen.

Nachdem alle Kryoröhrchen in eine FS-Einheit eingebracht wurden, starten Sie das Programm. Der Gefrier- und Verarbeitungsprotokoll ist in diesem Diagramm dargestellt. Während der anfänglichen Inkubation bei minus 90 Grad Celsius wird das glasartige Eis durch das Fixativ in Aceton ersetzt.

Dann, wenn die Probentemperatur ansteigt, vernetzt das Fixativ im flüssigen Aceton die Probe, um die Struktur zu erhalten. Wenn die Temperatur in der FS-Einheit minus 60 Grad Celsius erreicht, stellen Sie Szintillationsgefäße mit 20 Milliliter 95 %igem Aceton in die FS, um sie abzukühlen. Sobald dann die Temperatur minus 50 Grad Celsius erreicht, entfernen Sie mit einer Pasteurpipette und einer P-200-Spitze das Fixativ und geben etwa ein Milliliter vorgekühltes 95 %iges Aceton zu jeder Probe hinzu. Galle.

Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 20 Minuten über einen Zeitraum von zwei Stunden. Außerdem stellen Sie während der Inkubation bei minus 50 Grad Celsius eine Szintillationsflasche, die 20 Milliliter 0,1 %iger Urinacetatlösung in 95 % Aceton enthält, in die FS-Kammer, um sie auf minus 50 Grad Celsius vorzukühlen. Fügen Sie danach, nach dem letzten Acetonwaschgang, etwa ein Milliliter Urinacetatlösung zu jeder Flasche hinzu, um die Probe anzufärben und den Membrankontrast zu verbessern.

Wenn das Programm unterbrochen wurde, starten Sie es erneut. Wenn die Temperatur minus 40 Grad Celsius erreicht hat, stellen Sie Szintillationsgefäße mit 95 % Ethanol in die FS-Kammer. Wenn die Temperatur minus 30 Grad Celsius erreicht hat, ersetzen Sie alle 20 Minuten über einen Zeitraum von zwei Stunden mithilfe einer Pasteurpipette das Urinacetat durch 95 % Ethanol.

Es ist wichtig, in diesem Schritt Ethanol zu verwenden, da das Harz in Gegenwart von Aceton nicht polymerisiert. Im nächsten Teil des Protokolls werden die Proben in Kunststoff eingebettet, während die Proben bei minus 30 Grad Celsius gehalten werden. In der a FS ersetzen Sie nach drei bis fünf Stunden das 95 % Ethanol durch vorab gekühltes 30 % Glykolsäuremethacrylatharz oder GMA in 95 % Ethanol; nach vier bis sechs Stunden ersetzen Sie das 30 % GMA durch 70 % GMA; danach entfernen Sie das 70 % GMA und inkubieren die Proben über Nacht in 97 % GMA.

Die schrittweise Erhöhung der GMA-Konzentration ermöglicht das Eindringen des Mediums in die Gewebe. Beachten Sie, dass da 3 % Wasser dem GMA-Harz zugesetzt wird, 97 % GMA nicht verdünnt ist. Mit Ethanol am nächsten Tag überführen Sie die Proben mithilfe einer Pasteur-Pipette in eine Einbettform in der A FS, stellen Sie die Proben in die Einbettform und tauschen dann das 97 % GMA dreimal innerhalb von sechs Stunden bei minus 30 Grad Celsius gegen frisch hergestelltes GMA aus.

Nach dem dritten Austauschschritt klopfen Sie leicht auf die Bakterienmatrix, um die Probe vom Kryoschutzmittel zu trennen. Geben Sie den Initiator nn-Dimethyl-Udin zum 97 %igen GMA in einem Belüftungsfläschchen hinzu. Die Menge des hinzugefügten Initiators beträgt 1,5 Mikroliter pro Milliliter GMA. Geben Sie die GMA-Lösung unverzüglich in jede Einbettform und positionieren Sie die Tiere so in der Form, dass sie gleichmäßig verteilt sind.

Starten Sie das Programm erneut, damit die Temperatur auf minus 20 Grad Celsius ansteigt. Obwohl das Harz innerhalb einer Stunde schnell polymerisiert, lassen Sie den Kunststoff über Nacht bei minus 20 Grad Celsius aushärten. Um sicherzustellen, dass die Polymerisation vollständig abgeschlossen ist.

Nachdem der Kunststoff ausgehärtet ist, das Präparat in einer mit Stickstoffgas gefüllten Vakuumtütte bei minus 20 Grad Celsius lagern. Das Schneiden von in GMA eingebetteten Präparaten sollte anschließend wie in der beigefügten Anleitung für die fotoaktivierbare Lokalisierungsmikroskopie oder PALM-Bildgebung beschrieben durchgeführt werden. Das Mikroskopsystem sollte mit der E-M-C-C-D-Kamera, die auf minus 70 Grad Celsius oder darunter eingestellt ist, eingerichtet werden.

Tragen Sie mithilfe einer Pipette etwa 50 µL 100 Nanometer großer Goldpartikel in einer Konzentration von 1×10¹⁰ Partikel pro Milliliter auf die zu bildende Probe auf. Legen Sie eine schwarze Abdeckung über die Proben und lassen Sie die Lösung 30 Sekunden lang auf dem Deckglas stehen. Um die Goldlösung zu entfernen, blasen Sie diese an den Rand des Deckglases und nehmen die Lösung mit einem Kim-Tuch auf.

Tragen Sie dann Vakuumfett auf einen runden Deckglas-Halter auf und setzen Sie das Deckglas ein. Geben Sie Immersionsöl auf die Unterseite des Decks. Setzen Sie es direkt unterhalb der Probe an.

Setzen Sie den Probenträger in den Schlitz am Mikroskoptisch ein und justieren Sie ihn so, dass er fest sitzt und die Schnitte über dem Objektiv zentriert sind. Achten Sie besonders darauf, die Objektive nicht zu berühren. Suchen Sie anschließend mithilfe der Hellfeldbeleuchtung die Schnitte mit einem 10×-Objektiv ein.

Danach auf das 100×-Objektiv wechseln und auf die Probe fokussieren. Gegebenenfalls auf Fluoreszenzanregung umschalten, wobei der 488 Nanometer Laser mit einer Intensität von 10 % verwendet wird. Fünf Minuten warten, damit sich die Probentemperatur einstellen kann. Anschließend die Bereiche mit der stärksten Fluoreszenz identifizieren und scharfstellen.

Schalten Sie die Laser auf 561 Nanometer um und erhöhen Sie die Intensität auf 100 %. Um die Hintergrundautofluoreszenz auszulöschen, belichten Sie die Probe etwa zwei Minuten lang. Falls sich die Fokussierung während des Auslöschens verändert, warten Sie fünf Minuten, bevor Sie die Fokussierung korrigieren und Bilder aufnehmen. Sobald das Auslöschen abgeschlossen ist, schalten Sie den 405 Nanometer Laser ein und stellen Sie ihn auf die niedrigste Intensität.

Beginnen Sie mit der Aufnahme der Bilder mit 20 Bildern pro Sekunde. Sammeln Sie genügend Bilder, um das Ziel des Experiments zu erreichen. Hier werden 5.000 bis 6.000 Bilder aufgenommen, um die Lokalisation von 584 Histonproteinen innerhalb eines Zellkerns zu bestimmen.

Nachdem 5.000 Einzelbilder aufgenommen wurden, werden alle Moleküle mithilfe der Bildverarbeitungssoftware identifiziert und kartiert. Das endgültige Fluoreszenzbild, auch sogenanntes „Sofortbild“, ist eine Zusammensetzung aller auf der Kamera detektierten Fluoreszenzsignale. Im Gegensatz dazu bildet das PALM-Bild die OID jeder fluoreszierenden Stelle ab und zeigt lediglich an, wo sich jedes Protein befindet.

Vor der REM-Bildgebung färben Sie die Schnitte vier Minuten lang mit 2,5 % Urinacetat in Wasser. Spülen Sie das Urinacetat gründlich mit filtriertem Milli-Q-Wasser ab. Nach dem Trocknen der Schnitte beschichten Sie die Deckgläser mit einer Kohlenstoffschicht mittels Sputtern, bis sie deutlich dunkel erscheinen.

Bringen Sie leitendes Kohlenstoffband an der Kante der Deckglasabdeckung an einem Ende und am Metallstummel am anderen Ende an, damit die sich auf der Oberfläche der Deckglasabdeckung ansammelnden Elektronen geerdet werden. Befestigen Sie die Deckglasabdeckung in der SEM-Kammer und lokalisieren Sie die Probe im Mikroskop. Erstellen Sie ein Bild mit niedriger Vergrößerung der Probe, zoomen Sie dann in den Bereich von Interesse und gewinnen Sie Aufnahmen mit hoher Vergrößerung.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem neuen Abschnitt, bis alle Abschnitte abgebildet wurden. Anschließend müssen die PALM- und EM-Aufnahmen ausgerichtet werden. Öffnen Sie dazu zunächst die aufgenommenen REM-Bilder in Photoshop.

Erstellen Sie ein neues Fenster mit den Abmessungen 5.000 × 5.000 Pixeln und einer Auflösung von 300 Pixeln pro Zoll. Kopieren Sie das geladene SEM-Vergrößerungsbild in das neue Fenster. Verwenden Sie den Befehl „Freies Transformieren“ im Bearbeiten-Menü, um das Bild so zu skalieren, dass es das gesamte Fenster ausfüllt.

Kopieren Sie anschließend die SEM-Aufnahmen mit höherer Vergrößerung und skalieren und transformieren Sie sie nach Bedarf. Wählen Sie die Bildrotation aus der Bild-Dropdown-Menüleiste und spiegeln Sie das Sum-Turf-Bild horizontal. Kopieren und fügen Sie das Sum-Turf-Bild in eine neue Ebene ein.

Verwenden Sie den Befehl „Freies Transformieren“ im Bearbeitungsmenü, um das Bild so zu skalieren, dass es ungefähr die gleiche Größe wie das Elektronenmikrograf mit niedriger Vergrößerung hat. Drehen Sie anschließend das Bild nach Bedarf, um die Fluoreszenz der Goldpartikel mit den entsprechenden in dem REM sichtbaren Strukturen abzugleichen. Kopieren Sie danach das Palmblattbild in eine neue Ebene und wenden Sie die gleiche Transformation an, um ein Bild mit höherer Vergrößerung zu extrahieren.

Heranzoomen auf den interessierenden Bereich und Kopieren des Palmenbildes aus diesem Bereich. Das Bild in ein SEM-Bild mit höherer Auflösung für die Präsentation einfügen. Auf das Palmenbild sollte eine Transparenzverlauf angewendet werden, sodass nur der schwarze Hintergrund, nicht jedoch die Palmen-Signale transparent werden.

Kopieren Sie das Transform-Palm-Bild in eine neue Ebene. Wählen Sie mithilfe der Farbbereichsfunktion im Auswahlmenü die Palmensignale, jedoch nicht den Hintergrund aus. Wählen Sie anschließend ein Hintergrundpixel als Referenz aus und aktivieren Sie die Invertierungsoption.

Schneiden Sie die gewünschten Palmensignale aus und fügen Sie sie in eine neue Ebene ein. Wenden Sie Transparenz auf die Hintergrundebene an und stellen Sie diese auf 10 % ein. Dies ermöglicht die Visualisierung der Palmensignale, indem der Hintergrund transparent gemacht wird, ohne die Intensität zu beeinträchtigen. Histonprotein.

Das mit His 11 markierte TD-Eos wurde stabil im Nematoden C. elegans exprimiert, und die transgenen Tiere wurden gemäß dem in diesem Video beschriebenen Protokoll aufgearbeitet und abgebildet. PALM- und Elektronenmikrografien wurden aus demselben Schnitt gewonnen. Die Goldnanopartikel, die sowohl in den Fluoreszenz- als auch in den Elektronenmikrografien sichtbar sind, wurden anschließend zur Ausrichtung der beiden Bilder verwendet.

Hier betrachten wir einen Bereich nahe dem oberen Ende des Mikrofotos vergrößert. Wie hier zu sehen ist, subzelluläre Strukturen wie ein Zellkern.

Ein Kern, nukleäre Poren und das endoplasmatische Retikulum können beobachtet werden. Die markierten Histonmoleküle sind jedoch ausschließlich im Kern lokalisiert, nicht aber im Kerninneren. Wie erwartet ermöglicht die korrelative PALM- und Elektronenmikroskopie somit die Proteinlokalisierung mit höchster Auflösung. Nach Durchführung dieses Verfahrens kann man diese Schnitte mit der Proteindistribution nehmen und mittels Array-Tomographie stapeln, um eine dreidimensionale Struktur zu erzeugen, die zeigt, wo die Proteine in der Zelle verteilt sind.

Und beachten Sie, dass Osmiumtetroxid eine sehr gefährliche Chemikalie ist, und Sie sollten immer Handschuhe tragen.