Name: Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Lernen Sie die Ernte und Kryo-Kühlung von Membranproteinkristallen in lipidischen Mesophasen für die Strukturaufklärung durch Röntgenkristallographie. Diese Methode sichert die Kristallintegrität für die Analyse.

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Es gibt viele, trugen zu dieser Arbeit und die meisten sind aus dem Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group, beide in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder. An alle, und vor allem Jingquan Tan und Joseph Lyons, erweitern wir unseren herzlichen Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), den National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 und U54GM094599) und FP7 COST und Marie Curie Actions (CM0902 und PIEF-GA-2009 unterstützt -235.612).

Ein. Laboratory Set-up Pre-Ernte <ol><li> In Vorbereitung für die Ernte, füllen Sie die trockenen Schaum Dewar mit flüssigem Stickstoff und platzieren Sie es neben dem Mikroskop, wo der Ernte stattfinden. </li><li> Tauchen Sie den Speicher Puck, open end up, in den flüssigen Stickstoff in der Schaum-Dewar und lassen Sie es vollständig abkühlen. </li><li> Sichern Sie sich eine micro-mount von einer Größe, die den Kristall auf einem Magnetstab (Abbildung 5) geerntet werden übereinstimmt. Es ist wichtig, zur Hand haben, eine Reihe von Ersatz-Metalldetektorstäbe mit Mikro-Halterungen vorgespannt, um für Situationen gerecht, wo es notwendig, mehrere Kristalle aus der ein Bolus ernten ist. Spare Zauberstäbe sollte jederzeit verfügbar sein. </li><li> Legen Sie eine Mikropipette, Tipps und das Fällmittel Lösung, die für das Kristallwachstum neben dem Ernte-Mikroskop verwendet wurde. Es kann erforderlich sein, um den Mesophasen-decken und ein Austrocknen zu vermeiden, wenn das Bohrloch geöffnet wird. </li><li> Haben ein Notizbuch und Stift auf der Bank in der Nähe und / oderder Computer zu öffnen. Diese werden verwendet, um Beobachtungen in Bezug auf die Qualität, Aussehen, Standort, Lagerung Puck Nummer, etc., von Kristallen, wie sie geerntet werden, Kryo-gekühlt und eingelagert aufzuzeichnen. </li><li> Wenn ein Assistent zur Verfügung, um mit der Ernte muss die Person klar zu verstehen, das Protokoll, die befolgt werden wird, in welcher Reihenfolge die verschiedenen Schritte stattfinden wird, und ihre Rolle im gesamten Prozess zu helfen. </li></ol> Mit all den Materialien und Geräte an Ort und Stelle unsere nächste Aufgabe ist es: 2. Identifizieren Platten und Wells, die Kristalle enthalten <ol><li> Die einfachste und direkteste Methode zum Auffinden erntefähige Kristalle in die Vertiefungen von Hand mit einem Mikroskop mit normalen und mit gekreuzten polarisierten Lichts zu inspizieren. Einstellen der Beleuchtung Lichtintensität am Mikroskop kann mit Ortung Kristalle helfen. </li><li> Alternativ, überquerte ein Imager, wo Platten werden automatisch mit normalen gesiebt und polarisierend light, können verwendet werden, um Kristalle zu suchen. </li><li> Bewerten von Auge aufgenommenen digitalen Bilder auf einem Computer-Monitor. </li><li> Kennzeichnen Sie diese Brunnen mit Kristallen für die Ernte und aufzeichnen Kommentare zu der Größe, Qualität und Lage der Kristalle in der Mesophase im Notebook oder auf einem Computer. </li><li> Entfernen Sie die Platte mit Kristallen für die Ernte aus dem Imager. </li></ol> 3. Öffnen einer gut mit kubischen Mesophase. Methode 1 Die Platten, in denen Kristalle wachsen durch die in meso-Methode sind Glas Sandwichplatten (Abbildung 2). Um die Mesophase und die Kristalle darin zuzugreifen, ist es notwendig, die ebenfalls öffnen. Dies wird durch Verwendung eines Glases Schneidwerkzeug um das obere Deckglas dass Dichtungen der Brunnen, kann dann entfernt werden geschnitten getan. Es gibt mehrere Ansätze für das Schneiden und Entfernen des Abdeckglases von über einer Kristallisation gut. Das man verwenden wird durch die Art o diktiertf Mesophase, bei dem der Kristall wachsen gefunden. Dies kann der hochviskose und klebrige kubischer Phase (3A) oder dessen flüssiger Variante der Schwamm Phase (3B) liegen. In diesem Video Artikel zeigen wir, wie man Brunnen zu öffnen und Kristalle aus diesen beiden Hosting-Materialien zu ernten. <ol><li> Legen Sie das Glas-Sandwich Kristallisationsplatte auf der Bühne eines Lichtmikroskops. </li><li> Verwendung eines Glases Schneidwerkzeug Punktzahl das Deckglas leicht mit zwei konzentrischen Kreisen über dem Abstandhalter und etwas außerhalb des Umfangs des Bohrlochs befindet. Mit einem neuen Schneidwerkzeug benötigt Scoring minimal angelegten Druck. Ersetzen Sie das Werkzeug mit einem neuen, wenn der Druck benötigt, um Gäste sogar noch geringfügig erhöht, dies tritt in der Regel nach dem Öffnen 10 Brunnen. </li><li> Aufbrechen des Glases in dem Raum zwischen den beiden Kreisen hat zum Zwecke der Freigabe der inneren Deckglas. Dieser generiert viele Glasscherben und Staub. Löschen Sie sie weg mit einem angefeuchtetenPapiertuch. </li><li> Entfernen Sie die befreiten Deckglas durch Greifen sie mit einer feinen Spitze Pinzette und kippen weg von und aus dem Brunnen. In diesem Fall bleibt der kubischen Phase stecken und an die Stelle auf der Grundplatte des Bohrlochs. </li><li> Vergrößern, um ein klareres Bild der kubischen Mesophase, die nun bereit ist für den Einsatz in crystal Ernte zu bekommen. </li></ol> 4. Öffnen einer Well mit Cubic Mesophase. Methode 2 <ol><li> Verwendung des Glases Schneidwerkzeug Punktzahl geraden parallelen Linien in dem Deckglas auf einer Seite des Bohrlochs und daß sich über die auch selber. Dies ermöglicht eine einfachere Pinzette Zugang zu und Entfernen des Abdeckglases. </li></ol> In diesem besonderen Demonstration, die Risse Deckglas bei der Befreiung der Deckglas von der klebrigen Abstandshalteroberfläche. In dem Verfahren, verschiebt sich das Deckglas in Position und das Fällungsmittel getrennt von der kubischen Phase. Wenn das Deckglas angehoben wird ein Teil des Fällungsmittels mit ihm geht. Wir sind mit einer exponierten b linksOlus der Mesophase ohne umgebende Fällungsmittel. Unmittelbar, fügen Sie ein ul frischem Fällungsmittel auf der Oberseite des Bolus mit einer Mikropipette, um die Mesophase vor dem Austrocknen und eine Phasenänderung, die die Kristalle beschädigen könnten verhindern. Der Bolus ist nun bereit, in Kristall Ernte eingesetzt werden. 5. Öffnen einer Well mit Schwamm Phase. Vergeblich Der Schwamm Phase weniger vergebende mit wegen seiner Fähigkeit zum Fließen zu arbeiten. Wenn dass Strömung führt zu dem Schwamm Phase Kontaktieren des Umfangs des Bohrlochs Kapillarität wird Ausziehen der Mesophase und die Kristalle gehen verloren. Ein Beispiel für dieses Ereignis wird in diesem Videoclip gezeigt. <ol><li> Zoom in auf dem Schwamm Phase und hin-und herschalten zwischen normalen und gekreuzten polarisiertes Licht Kristalle in der Schwamm-Phase zu finden. </li><li> In Vorbereitung für das Öffnen der auch Gäste und schneiden Sie das Deckglas, wie in Abschnitt 3 beschrieben. In dem Prozess, die Risse Deckglas. Im VersuchIng. zum Öffnen der Brunnen die Fällungsmittel Verschiebungen in Richtung des Risses, und schließlich kommt es in Kontakt mit dem Abstandhalter. Das Fällungsmittel mit einigen der Schwamm-Phase und seiner Ladung von Kristallen, die verloren geht. </li></ol> In dieser speziellen Sequenz werden die Polarisatoren auf dem Mikroskop nicht vollständig überquert, und die Kristalle als helle Objekte zur gleichen Zeit gesehen werden, dass die gut und dessen Inhalt sichtbar bleiben. 6. Öffnen einer Well mit Schwamm Phase. Erfolgreich <ol><li> Vergrößern Sie die Schwamm-Phase und identifizieren einen Kristall sowohl in Normal-und gekreuzten polarisiertem Licht. </li><li> Ergebnis, schneiden und entfernen einen Abschnitt Deckglas abdecken die auch, wie in Abschnitt 4,1. Unvollständig gekreuzt polarisiertes Licht verwendet wird, den Überblick über den Kristall zu halten. </li><li> Einführung eines Stück trockenen Tissue-Papier durch die Öffnung in dem Deckglas und in das Bohrloch, bis es gerade berührt die Fällungsmittellösung. Docht entfernt die Lösung vorsichtigly, bis sie fast alle weg und entfernen Sie dann das Gewebe. Dies bewirkt, dass der verbleibende Fällungsmittel und Schwamm-Phase, mit dem Kristall noch vorhanden ist, um unter dem Deckglas zurückzuziehen. </li><li> Ergebnis, schneiden und entfernen Sie mit einer Pinzette der Rest der Deckglas, wie in Abschnitt 4,1. In diesem Fall spaltet der Schwamm Phase; einige Überreste in dem Bohrloch und einigen klebt am Deckglas. Der Kristall ist im Bolus am Deckglas. Weil es sehr wenig Fällungsmittel, beginnt die Phase, um ein Schwamm Phasenübergang wahrscheinlich durch Austrocknung unterziehen. Dies kann als ein Ring von Doppelbrechung, die in Richtung der Mitte des Bolus wandert gesehen werden. Unmittelbar Fällungsmittel hinzufügen Bolus, um den Übergang zu stoppen. Der Bolus ist nun bereit für den Einsatz in crystal Ernte. </li></ol> 7. Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle aus der Cubic Phase <ol><li> Gehe hin und her zwischen normal und gekreuzten polarisiertes Licht Kristalle in den kubischen Phase Bolus im Freien gut zu lokalisieren. In tseinen Videosequenz bis zu vier doppelbrechende Kristalle in den kubischen Phase Bolus mit gekreuzten polarisierten Licht gesehen werden. </li><li> Verwenden Sie einen montiert Kryo-Schleife (Abbildung 5), um die frisch freigelegten Mesophase für Kristalle untersuchen, zu fischen Kristallen und sie dann stürzen, enthalten in der Kryo-Schleife, in flüssigen Stickstoff im Dewar sofort nach der Ernte. Idealerweise sollte die Ernte-und Schnappbefestigung Kühlung in einem kontinuierlichen und schnellen Bewegung passieren. So wenig haftende Mesophase wie möglich mit dem Kristall geerntet werden. Nach unserer Erfahrung ist Cryo-Schutzmittel nicht mit in meso-gezüchteten Kristalle benötigt. </li><li> Da es nicht möglich, für den Kristall in der Kryo-Schleife aussehen sofort nach der Ernte zu inspizieren die Mesophase Bolus zum Ernten zu verifizieren, dass der Kristall nicht mehr vorhanden ist darauf hindeutet, dass es erfolgreich wurde geerntet verwendet. </li></ol> 8. Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle aus der Sponge Phase <ol><li> Gehe hin und her zwischen normal und gekreuzten polarisiertes Licht Kristalle in der Schwamm-Phase Bolus im Freien gut zu lokalisieren. In dieser Videosequenz vielen doppelbrechende Kristalle kann im Bolus unter gekreuzten polarisierten Licht gesehen werden. </li><li> Verwenden einer montierten Kryo-Schleife (Abbildung 5) heraus zu fischen Kristalle aus dem Schwamm und diese Phase einzutauchen, enthalten in oder auf dem cryoloop, in flüssigen Stickstoff im Dewar sofort nach der Ernte. Wie bei der Ernte im kubischen Phase, idealerweise sollte die Kryo-Kühlung sofort geschehen der Kristall mit so wenig Zeit wie möglich vergeht zwischen der tatsächlichen Ernte Veranstaltung und das Eintauchen in flüssigen Stickstoff geerntet wird. So wenig haftende Schwamm-Phase sollten möglichst mit dem Kristall geerntet werden. Wie angemerkt, wird Kryo-Schutzmittel nicht mit in meso-gezüchteten Kristalle erforderlich. </li></ol> 9. Speichern Crystals in Dewars <ol><li> Nachdem stürzte die montiert Schleife in flüssigen nitrogen platzieren es in einem der Halteschlitze des Speichermediums Puck im Schaum Dewar. Alle Manipulationen mit der Schleife fertig sind, die Oberseite des magnetischen Zauberstab und den Puck in flüssigen Stickstoff eingetaucht. </li><li> Notieren Sie den Speicherort und die Einzelheiten der geernteten und Kryo-gekühlten Kristall im Notebook und / oder auf dem Computer. </li><li> Wenn der Puck im Schaum Dewar voll oder Ernten für den Tag Transfer der Puck in einer ad acta Puck Halter in einer Lagerung oder einem Transport Dewar abgeschlossen ist gefüllt mit flüssigem Stickstoff. Kristalle können in Verkehr Dewars der Synchrotron-Anlage für die Beugung der Datenerhebung versendet werden. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Die Ziele der Ernte und Kryo-Kühlung Übungen zu zeigen hier, um einen Kristall aus dem Hosting Mesophase in Kryo-Schleifen zu übertragen, um die Loop-Kristall verglasen und es bei der Lagerung in flüssigem Stickstoff in einem Dewar. Die ideale Situation ist, wo die Ernte und cryo-Kühlung sind in der Weise, dass die Beugung Qualität des Kristalls in dem Prozess erhalten wird getan. So wenig Mesophase wie möglich mit dem Kristall geerntet werden. Dies ist, um den Kristall Anordnen und Zentrieren in der Röntgenstrahl, dass viel weniger anspruchsvoll, um Kryo-Kühlung im Hinblick auf die Beschleunigung der Verglasung sowie zur Minimierung störender Tonerflecken aus dem Mesophasen während Beugungsdaten angesehen. Einige Beispiele von Kryo-gekühlten Proben bei der das Glas nicht und kann gesehen werden, sind in 6 gezeigt. Wobei der Kristall nicht von Auge erkennbar ist es normalerweise notwendig, um Beugungseffekte Rasterung greifen, um den Kristall zu finden und zu zentrieren im Strahlengang für die Datensammlung 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung einer biologischen Membran, die die Lipid-Doppelschicht in und auf welchem ​​are liegt eine Vielzahl von Proteinen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein voll beladen und verschlossen 96-well Glas-Sandwich Kristallisationsplatte. Jede Vertiefung enthält 50 nl kubischen Phase und 1 ul Fällmittellösung. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die kubische Phase mit dem Sudan Red angefärbt und die Fällmittellösung enthält Methylenblau. Von Reference 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Kristalle von Membranproteinen wächst in den Lipid-Mesophase. A. Die kubischen Phase mit einem Kristall von Bakteriorhodopsin aus H. halobium. B. Der Schwamm Phase, die einen Kristall des Vitamin-B12-Rezeptor / Transporter, btuB von E. coli. Von Reference 25. Die kubischen und Schwamm Phasen kontrastierenden Erscheirances wie durch den Vergleich Platten A offensichtlich und B. Die kubische Phase in A ist extrem zähflüssig und behält seine ursprüngliche Form zurück. Es fließt nicht. Dies zeigt sich insbesondere an den Rändern der Mesophase Bolus, die eine aufgerauhte Aussehen haben. Mit Vertrag ist das Schwamm-Phase deutlich weniger viskos und nicht fließt. Somit scheitert die Schwamm-Phase zu seiner ursprünglichen Form zu halten und seine Ränder sind charakteristischerweise glatt. Fällungsmitteln, die Jeffamine umfassen, PEG 400, 2-Methyl-2 ,4-Pentandiol, Pentaerythrit Propoxylat, Butandiol und Hexandiol, kann bei einem Übergang von der kubischen Phase auf den Schwamm 4,26 führen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Das Flussdiagramm fasst die Schritte bei der Herstellung, Ernte und Kryo-Kühlung in meso-grown Membranprotein Kristalle (A) involviert. Nur diese Schritte durch die gestrichelte rote umgebenLeitung, und im Detail beschrieben in (B), werden in diesem JoVE Artikel behandelt. Panel A ist von Reference 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Eine leere Kryo-Loop montiert auf einem Stift, der an Ort und Stelle auf einem Magnetstab gehalten wird. Expanded Ansichten des Stiftes (A) und Mikro-Halterung (B) dieser wichtigen Werkzeug für die Ernte und Kryo-Kühlung gezeigt. Der leere Schlaufe am Ende des Mikro-mount in B ist 30 um im Durchmesser. Während nachdem keine anderen Loop-Typen ausgiebig getestet, so finden wir, dass die MiTeGen gezeigten Arbeiten Schleifen auch mit den beiden kubischen und Schwamm Phasen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Harvested und Kryo-gekühlten Kristalle von Membranproteinen in Kryo-Schleifen, mit einem In-Line-Mikroskop auf einem Synchrotron Beamline angesehen. A, b. Beispiele geerntet Kristalle (Caa3 Cytochromoxidase 34 (A), Diacylglycerin Kinase, DgkA (B)), wobei die Kristalle (blauer Pfeil) sind durch die Kryo-gekühlten Mesophase auf einer Kryo-Schleife. C. Beispiel, wo das geerntete Kristall nicht in der Kryo-gekühlten Mesophase auf einer Kryo-Schleife sichtbar. Die Spitze der Schleife ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. Die anhaftende Kryo-gekühlten Mesophase mit einem blauen Pfeil gekennzeichnet.

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2%2FD3+selective+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li>
<li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li>
<li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li>
<li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li>
<li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li>
<li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li>
<li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li>
<li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal++structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta%282%29+adrenoceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li>
<li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li>
<li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+nociceptin%2Forphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li>
<li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid%27s+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li>
<li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein%2Fwater+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Ii%22%5BJournal%5D)">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li>
<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712(2010).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000(2012).</li>
<li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa%283%29-type+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikels wir demonstriert, wie Kristalle in einer lipidischen Mesophase wachsen geerntet und in Vorbereitung für die Verwendung in Beugung Datenerhebung und letztlich zur Strukturbestimmung Kryo-abgekühlt. Die Hosting-Mesophase kann der viskosen und klebrigen kubischen Phase oder mehr Flüssigkeit Schwamm-Phase 4 sein. Wie die Glas-Sandwich-Platten sind geöffnet und wie die Kristalle sehr viel geerntet hängt Mesophase Typ. Es ist daher wichtig zu wissen, welche der beiden ein mit sich vor der Zeit. Die Identität des Hosting-Lipid-und Fällungsmittel verwendet werden, sind in diesem Zusammenhang wichtig, und die physische Erscheinung der Mesophase Bolus bei der Kristallisation auch verwendet werden, um sie auseinander zu werden (Abbildung 3). Ernte von beiden Mesophase Typen wurde in diesem Artikel dargestellt. Harvesting kleine Kristalle aus einer Lipid-Mesophase in Glas-Sandwich-Platten ist ein mühsamer Prozess, der Zeit, Geschicklichkeit, exper benötigtience, Geduld und eine ruhige Hand. Es ist wichtig, beiseite stellen eine angemessene Menge an Zeit für die Ernte und die Einrichtung des Labors, so dass alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände zur Hand sind im Voraus. Eine zweite Person, die bei der Ernte zu helfen ist nicht unbedingt erforderlich, wird aber empfohlen. Diese Person kann mit der Lieferung vormarkierten Platten auf den einzelnen zu tun, die Ernte sowie Platzierung Kryo-gekühlten montiert Schleifen mit geernteten Kristalle in den Speicher Puck helfen. Der Assistent kann auch eine wichtige unterstützende Rolle bei der Dokumentation von Beobachtungen über die Kristalle während der Ernte das könnte entscheidend sein bei der Beugung der Datenerhebung gemacht. In Abwesenheit eines Helfers konnte ein sprachgesteuertes Audio-Aufzeichnungsvorrichtung, die Vorteile für die Dokumentation verwendet werden. Nach dem Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird Ihnen helfen, den Viewer und läuft mit Kristall Ernte. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass das Verfahren nicht einfach und daß practice wird vor dem Start in die Ernte wertvolle Membranprotein Kristalle benötigt. Es wird daher Testplatten mit Kristallen von Proteinen, die nicht besonders wertvoll sind mit ersten experimentiert werden empfohlen. Dadurch wird die neophyte wertvolle Erfahrung Schneiden von Glas bereitzustellen, Entfernen Glasscherben, Anheben des Abdeckglases von über der Mesophase, unter Verwendung der polarisierenden Funktion auf dem Mikroskop, um Kristalle zu sehen und sie während des Erntens zu verfolgen, und schließlich die Handhabung der verschiedenen Arten von Mesophasen und Ernte von ihnen. Die Textur der Mesophase, und durch Erweiterung der Leichtigkeit, mit welcher sich Kristalle geerntet werden können, ändert sich mit der Zeit während der Kristallisation. Es ist daher wichtig zu üben Ernte mit weniger wertvolle Kristalle, sondern mit denen, die unter den gleichen Bedingungen wie die weitere wertvollsten gewachsen. Es ist möglich, Kristalle von Lysozym und Thaumatin durch die in meso-oder lipidische kubischen Phase Methode 28 wachsen und diese sollten consid werdenEred mittels gewinnt sich mit den Materialien und dem Verfahren. Man sollte auch bedenken das Arbeiten mit Protein-freie Mesophase erste seiner Launen zu lernen. Die Verfahren nachgewiesen hier wurden alle bei einer komfortablen 20 ° C oder ungefähr getan. Es ist möglich, Kristalle durch die im meso Verfahren wachsen bei niedrigeren Temperaturen. Somit kann Monoolein als Hosting Lipid in einer metastabilen Phase Zustand bei 4 ° C 1,2,29,30 verwendet werden. Eine Alternative besteht darin, die rational entworfen 7,9 MAG für Tieftemperaturkristallisation 31 verwenden. Wir tun niedrigen Temperaturen crysallogenesis routinemäßig mit bestimmten Membranprotein Ziele. In diesem Fall wird das Kristallwachstum und die Ernte in einem begehbaren in 4 ° C Kühlschrank getan. Arbeiten unter solchen Bedingungen hat ihre eigenen Herausforderungen nicht zuletzt von denen die Notwendigkeit für einen warmen und bequeme Kleidung ist. Der nächste Schritt im gesamten Prozess der Strukturaufklärung mit makromolekularen crystallography ist Beugungsdaten auf Kristalle geerntet und Snap-gekühlt in diesem Artikel gezeigt sammeln. In meso-grown-Kristallen sind in der Regel klein. Allerdings hat nützlich Beugung Datensammlung gewesen mit Kristallen mit einer maximalen Abmessung von 20 um 9 möglich. Zu diesem Zweck wird micro-beam Synchrotron-Strahlung und ist der Mittelpunkt eines separaten JoVE Artikel dieser Serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Komponenten </td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Pipettenspitzen </td><td> Gilson </td><td> Verschiedene </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Foam Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Glas und Metall Abfallbehälter </td><td> Daniels Healthcare </td><td> DD479OL </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Harvesting Schleifen </td><td> MiTeGen </td><td> Verschiedene </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Harvesting-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Lab Notebook </td><td> Verschiedene </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Magnetic PushButton Probenbeladung Zauberstab </td><td> Hampton Research / Molecular Dimensions </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Original Puck (für die Verwendung mit ALS-Stil Roboter nur) </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 035 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Pipettiervorrichtungen </td><td> Gilson </td><td> Verschiedene </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Fällungsmittel Lösungen </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 030 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Puck Etagenwagen Versandkosten Cane (original ALS-Stil) mit Haken Griff und Verriegelungsstange </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 029 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Gereinigtes Wasser </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Schutzbrille </td><td&gt; Various </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Beispiel Pin Bases - Magnetic (non-Kupfer) </td><td> Kristall Positioning Systems </td><td> CP-111 bis 015 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Liefer-Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Tissues </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Hartmetall-Glasschneider (TCT Reißnadel) </td><td> Silverline Tools (Yeovil, UK) </td><td> 633657 </td><td> Werkzeug </td></tr></tbody></table>

ernte-und cryo-kühlung kristalle von membranproteinen in lipidische mesophasen zur strukturaufklärung von makromolekulare kristallographie grown

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Ein wichtiger Weg zum Verständnis, wie Proteine ​​bei einer mechanistischen Ebene funktionieren, ist die Struktur des Zielproteins zur Verfügung zu haben, idealerweise mit atomarer Auflösung. Gegenwärtig gibt es nur einen Weg, solche Informationen zu erfassen, um integrale Membranproteine ​​(Abbildung 1), und die Komplexe bilden sie aufgebracht wird, und diese Methode ist makromolekularen Röntgenkristallographie (MX). Tun MX Beugungsqualität Kristalle nötig sind, im Fall von Membranproteinen, nicht leicht zu bilden. Ein Verfahren zur Kristallisation von Membranproteinen, die die Verwendung von lipidischen Mesophasen, speziell die kubischen Phasen 1-5 und Schwamm, beinhaltet hat erhebliche Aufmerksamkeit der späten Aufgrund der Erfolge in der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Feld 6-21 gehabt hat gewonnen ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Jedoch ist das Verfahren, fortan als die in Meso-oder Lipid-kubischen Phase-Verfahren bezeichnet, kommt mit seiner eigenen technischenHerausforderungen. Diese ergeben sich zum Teil aufgrund der im Allgemeinen viskosen und klebrigen Natur der lipidischen Mesophase bei dem die Kristalle, die oft Mikrokristalle, wachsen. Manipulation Kristallen wird schwierig als Ergebnis und besonders so bei der Ernte 22,23. Probleme ergeben sich auch bei dem Schritt, das Ernten der verlangt, dass die Glas-Sandwich-Platten, in der die Kristalle wachsen (Abbildung 2) 24,25 geöffnet werden, um den Mesophasen-Bolus freizulegen vorangeht, und die Kristalle darin zum Ernten, Kryo-Kühlung und späteren X Röntgenbeugung Datensammlung. Die kubischen und Schwamm Mesophase-Varianten (Abbildung 3), von der Kristalle gewonnen werden muss tief verschieden Rheologien 4,26. Die kubische Phase ist zähflüssig und klebrig ähnlich einem dicken Zahnpasta. Im Gegensatz dazu ist der Schwamm Phase mehr Flüssigkeit mit ausgeprägter Neigung zur Strömungsrichtung. Dementsprechend werden verschiedene Ansätze für die Öffnung der Kristallisation Brunnen containing Kristalle wachsen in der kubischen und der Schwamm-Phase werden als tatsächlich verschiedene Methoden zur Gewinnung von Kristallen aus den beiden Mesophase Typen erforderlich bezeichnet. Protokolle für genau das zu tun verfeinert worden sind und in der Membrane Strukturelle und Funktionelle Biologie (MS &amp; FB)-Gruppe implementiert und werden im Detail in diesem JoVE Artikel (Abbildung 4) beschrieben. Beispiele sind Situationen, in denen Kristalle erfolgreich geerntet und Kryo-abgekühlt gegeben. Wir bieten auch Beispiele von Fällen, in denen Probleme auftreten sollten, die die unwiederbringlichen Verlust von Kristallen und beschreiben, wie diese Probleme vermieden werden können. In diesem Artikel wird der Betrachter mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Öffnung der Glas-Sandwich Kristallisation Brunnen, für die Ernte und für Kryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen wächst in kubischer und Schwamm Phasen vorgesehen.

Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

Ein wichtiger Weg zum Verständnis der Funktionsweise von Proteinen auf mechanistischer Ebene besteht darin, die Struktur des Zielproteins zur Verfügung zu haben, idealerweise in einer Auflösung von ...

Herzlich willkommen in der Arbeitsgruppe für membranäre Struktur- und Funktionsbiologie. Mein Name ist Martin Caffery. Dies ist ein weiterer Artikel aus einer Reihe von JOV-Artikeln zum Kristallisieren von Membranproteinen zur Strukturbestimmung mittels der in-meso- oder lipidischen kubischen Phasen-Methode.Im ersten Artikel von Jo aus dem Jahr 1 7 1 2 haben wir gezeigt, wie die proteinreiche kubische Phase hergestellt wird und wie die viskose und klebrige Mischphase manuell in Glas-Sandwich-Kristallisationsplatten für Kristallisationsversuche abgegeben wird. Dieser Videoartikel beschreibt die Methode zur Gewinnung und kryogenen Kühlung von Kristallen, die nach der In-Meso-Methode gezüchtet wurden. Die Materialien und Geräte, die zur Gewinnung und kryogenen Kühlung von in Meso gezüchteten Kristallen benötigt werden, sind hier dargestellt.Sie umfassen ein Laborprotokollbuch zur Dokumentation von Informationen über Kristalle und Erntedetails für zukünftige Referenzen, Schutzbrille, Behälter für Glas- und Metallabfall, die Glas-Sandwich-Kristallisationsplatte, von der die Kristalle entnommen werden. Vertiefungen mit Kristallen werden lesbar gekennzeichnet, ebenso ein Glaszuschneider zum Öffnen der Kristallisationsvertiefungen, Tücher und eine Wasserflasche, gebogene Pinzetten, eine Präzipitator-Screen-Lösung, eine Mikropipette und Spitzen, Kryoschleifen zum Ernten der Kristalle, einen magnetischen Stab, einen Behälter zur Aufbewahrung der mit Kristallen beladenen, kryogen gekühlten Schleifen, einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Schaumstoffbehälter zum Kryokühlen der Kristalle, Zangen, einen Transport- oder Lagerbehälter sowie ein Erntemikroskop.Als Vorbereitung auf die Ernte sollte der Dewar mit flüssigem Stickstoff gefüllt und rechtzeitig neben dem Mikroskop platziert werden, an dem die Ernte durchgeführt wird. Der Speicher-Puck mit der Öffnung nach oben sollte in den flüssigen Stickstoff im Dewar getaucht und abgekühlt werden. Eine Cryo-Schleife in einer Größe, die zum Kristall passt, der geerntet werden soll, sollte auf einem Mikromontagehalter am magnetischen Stab befestigt werden, wobei alle Materialien und Geräte bereitstehen. Als Nächstes müssen wir die Platten und Vertiefungen identifizieren, die Kristalle enthalten.Wir können dies auf zwei Arten durchführen. Die einfachste und direkteste Methode besteht darin, die Wells manuell mit einem Mikroskop im normalen und im polarisierten Licht zu untersuchen. Die zweite Methode nutzt ein Bildgebungsgerät, bei dem die Platten automatisch mit normalem und polarisiertem Licht durchmustert werden.Digitale Bilder werden durch das Bildgebungsgerät aufgezeichnet und auf einem Computermonitor ausgewertet. Wells mit Kristallen, die zur Ernte vorgesehen sind, sollten deutlich beschriftet werden. Anmerkungen zur Größe, Qualität und Position der Kristalle im Bild sollten im Laborbuch oder auf einem Computer festgehalten werden.Dies erleichtert den Ernteschritt. Hier wird eine Platte, die Kristalle zur Ernte enthält, aus dem Imager entfernt, wodurch die Vertiefung geöffnet wird. Die Platten, in denen die Kristalle am Ende der Meso-Methode wachsen, sind Glas-Sandwich-Platten des hier gezeigten Typs. Um Zugang zu der Meso-Flüssigkeit und den darin enthaltenen Kristallen zu erhalten, ist es notwendig, die Vertiefung zu öffnen.Dies geschieht, indem mit einem Glaszerspanungswerkzeug die obere Deckscheibe, die das Muldenobjektträger abdichtet, durchtrennt wird, woraufhin sie entfernt werden kann. Es gibt mehrere Ansätze, dies durchzuführen. Der jeweils anzuwendende Ansatz hängt von der Art der Mease ab, in der der Kristall wächst.Es kann sich um die sehr viskose und klebrige kubische Phase handeln oder um ihre flüssigere Variante, die als Schwammphase bezeichnet wird. In diesem Videoartikel zeigen wir, wie man die Vertiefungen öffnet und Kristalle aus beiden Wirtsmaterialien gewinnt. In dieser Videosequenz demonstrieren wir zwei Methoden, um das Deckglas einer Vertiefung mit der viskosen kubischen Phase einzuritzen.Die Punktion und das Schneiden werden im Lichtmikroskop detailliert dargestellt. Wir beginnen damit, eine einzelne Kristallisationsmulde zu untersuchen und ihre verschiedenen Bestandteile zu identifizieren. Der erste rote Pfeil zeigt auf den Measenklumpen, der Kristalle enthält.Zufälligerweise sind Kristalle in dieser speziellen Sequenz nicht sichtbar. Der zweite Pfeil zeigt auf die Fällungslösung, die das Präzipitat umgibt. Der dritte Pfeil zeigt auf den Rand des Wells.Der vierte Pfeil zeigt auf den Doppelstab-Abstandshalter, auf dem das Deckglas mithilfe des Glasstichers sitzt. Das Deckglas wird leicht mit zwei konzentrischen Kreisen angeritzt, die sich knapp außerhalb des Randes der Vertiefung befinden. Anschließend wird der Glassticher verwendet, um das Glas zwischen den beiden angeritzten Kreisen zu zerkleinern.Um das innere Deckglas freizugeben, entstehen zahlreiche Glassplitter und Staub, die mit einem angefeuchteten Papiertuch entfernt werden können. Das freigelegte Deckglas liegt entlang seiner kreisförmigen Kante auf dem Abstandshalter auf. Das Deckglas wird entfernt, indem es mit einer feinen Pinzette erfasst und schräg aus der Vertiefung herausgekippt wird. In diesem Fall bleibt die kubische Phase am Boden des Wells fest und an Ort und Stelle. Ein Teil des Fällungsmittels wird mit dem Deckglas entfernt, aber ein beträchtlicher Anteil des Fällungsmittels verbleibt weiterhin um den Mease-Klumpen herum. Bei einer Vergrößerung erhalten wir eine klarere Ansicht des kubischen Mease, der nun zur Kristallgewinnung bereit ist.In der nächsten Sequenz zeigen wir eine zweite Möglichkeit, eine Kristallisationsmulde mit der viskosen kubischen Phase zu öffnen. In diesem Fall werden zusätzliche gerade Ritze und eine Muldenlinie in das Deckglas auf einer Seite der Mulde angebracht, die sich über die Mulde selbst erstreckt. Dies ermöglicht einen einfacheren Zugang mit der Pinzette und die Entfernung des Deckglases.In dieser speziellen Demonstration bricht das Deckglas, und beim Lösen des Deckglases von der klebrigen Stelle oder Oberfläche bewegt sich das Deckglas selbst, wodurch das Präzipitat von der kubischen Phase abgetrennt wird. Wenn das Deckglas angehoben wird, bewegt sich ein Teil des Präzipitats mit ihm. Der Ausschnitt zeigt eine weiter herausgezoomte Ansicht des Vorgangs.Jetzt bleibt ein freiliegender Bolus aus Mease ohne umgebenden Präzipitant zurück, der verhindern könnte, dass die Mease austrocknet und einen Phasenwechsel durchläuft, was die Kristalle beschädigen könnte. Frischer Präzipitant wird mit einer Mikropipette auf den Bolus aufgetragen. Der Bolus ist nun bereit, für die Kristallgewinnung verwendet zu werden.Die Schwamphase ist aufgrund ihrer Fließfähigkeit etwas anspruchsvoller in der Handhabung. Wenn dieses Fließen dazu führt, dass die Schwamphase den Rand des Wells berührt, wird sie abgezogen und die Kristalle gehen verloren. Ein Beispiel für diesen Vorgang wird im nächsten Videoclip gezeigt.Es beginnt mit einer Vergrößerung der Schwammphase und anschließendem Wechsel zwischen normalem und gekreuztem polarisiertem Licht. Die Kristalle, die im normalen Licht nur mit etwas Mühe zu erkennen sind, werden zwischen gekreuzten Polarisatoren als helle Fasern vor schwarzem Hintergrund deutlich sichtbar. Zur Vorbereitung des Öffnens der Vertiefung wird das Deckglas wie oben beschrieben angeritzt und durchtrennt.Während des Vorgangs bricht das Deckglas jedoch an Stellen, an denen es nicht brechen sollte. Es werden einige Manipulationen vorgenommen, um den Prozess des Öffnens der Kammer fortzusetzen, doch das Präzipitat verlagert sich in Richtung des Risses und gelangt schließlich in Kontakt mit dem Abstandshalter, und wie es der Zufall will, gelangt zusammen mit dem Präzipitat auch etwas der Schwammphase – und natürlich deren Fracht – in diesen Bereich. In dieser speziellen Abfolge sind die Polarisatoren des Mikroskops natürlich nicht vollständig gekreuzt, sodass die Kristalle als helle Objekte sichtbar sind, während gleichzeitig die Kammer und ihr Inhalt weiterhin erkennbar bleiben.Im nächsten Clip zeigen wir, wie das Problem gelöst wird, indem zunächst überschüssiges Fällungsmittel entfernt wird. Wir beginnen damit, uns auf die Schwammphase zu vergrößern, und identifizieren einen Kristall sowohl im normalen Licht als auch zwischen gekreuzten Polarisatoren. Ein Abschnitt der Deckgläser wird angeritzt und ausgeschnitten und anschließend vorsichtig entfernt. Im Brunnchen wird erneut unvollständig polarisiertes Licht verwendet, um den Kristall im Auge zu behalten, der sich dabei schön hell abbildet.Ein Stück trockenes Filterpapier wird durch die Öffnung im Deckglas und in die Vertiefung eingeführt, bis es gerade die Präzipitanzlösung berührt. Die Lösung wird vorsichtig angezogen, bis sie fast vollständig verschwunden ist und sich die Schwammphase in Richtung des Dochts bewegt. Das Entfernen des Filterpapiers bewirkt, dass die verbleibende Präzipitanz und die Schwammphase mit den Kristallen an ihrer Position unter das Deckglas zurückgezogen werden. Ein Zeitlupen-Wiederholung dieser letzten Sequenz wird hier der Klarheit halber gezeigt. Der restliche Deckglaser wird angeschnitten und durchtrennt. Wie zuvor beschrieben, wird der Deckglaser nun mit der Pinzette abgehoben.Die Einlage zeigt eine Übersichtsdarstellung des Prozesses. In diesem speziellen Fall verteilt sich die Schwammphase teilweise im Bohrloch und teilweise bleibt sie am Deckglas haften. Es zeigt sich, dass sich der Kristall im Bolus auf dem Deckglas unter Verwendung von Kreuzpolarisatoren befindet.Der Kristall ist deutlich in der Schwammphase sichtbar, beginnt jedoch aufgrund der sehr geringen Menge an Fällungsmittel eine Phasentransition, vermutlich verursacht durch Austrocknung. Dies zeigt sich als Ring aus Bio-Interferenzen, der sich in Richtung Zentrum des Bolus bewegt. Durch Zugabe von Fällungsmittel zum Bolus kann der Vorgang gestoppt und umgekehrt werden, um auf den nächsten Schritt – das Sammeln der Kristalle – vorzubereiten.Nachdem das Gefäß geöffnet und die Wirt-Misa-Phase freigelegt wurde, besteht der nächste Schritt des Verfahrens in der Gewinnung von Kristallen. In den folgenden Clips zeigen wir Beispiele für die Gewinnung aus der kubischen Phase und aus der Schwammphase. Die Mea-Phase im frisch geöffneten Gefäß wird unter dem Mikroskop untersucht, um geeignete Kristalle zu finden.Der Wechsel zwischen normalem und polarisiertem Licht kann diesen Prozess erheblich unterstützen. Lösungen des Präzipitants sollten bereitstehen und zur Zugabe zum Bolus verfügbar sein, um das Austrocknen zu verlangsamen oder zu stoppen. Anschließend wird ein montierter Kryo-Loop verwendet, um die frisch freigelegte Visa-Phase nach Kristallen abzusuchen, diese herauszufischen und unmittelbar nach der Gewinnung den Kryo-Loop mit den Kristallen in flüssigen Stickstoff im Dur einzutauchen.Im Folgenden zeigen wir zunächst die Gewinnung aus der viskosen und klebrigen kubischen Phase in dieser Erntereihenfolge bis zu vier Biore-Fringes, wobei sich Kristalle im Bolus der kubischen Phase unter polarisiertem Licht sichtbar machen. Der Cryo-Loop wird von rechts eingeführt, nimmt den Kristall mit so wenig anhaftender Mease wie möglich auf, wird sofort kryogenisch abgekühlt und die Schleife wird unter flüssigem Stickstoff im Lagervorrat platziert. Der Ernteprozess wird in diesem Clip dreimal wiederholt.Jedes Mal, wenn der Polarisator verwendet wird, um die Position des Kristalls zu überprüfen. Da es nicht möglich ist, nach dem Ernten nach dem Kristall in der Kryoschleife zu suchen, ist es ratsam, die Mesaphase, aus der der Kristall gewonnen wurde, zu überprüfen, um sicherzustellen, dass er nicht mehr vorhanden ist, was darauf hindeutet, dass das Ernten erfolgreich war. In der nächsten Sequenz wird das Ernten aus der flüssigeren Schwammpase gezeigt, ebenso wie beim kubischen Phasenzustand sollte so wenig wie möglich von der Schwammpase mit dem Kristall entnommen werden.Je mehr Flüssigkeit sich im Cryo-Loop um den Kristall befindet, desto schwieriger wird es sein, den Kristall visuell zu lokalisieren. Für die Sammlung von Beugungsdaten bedeutet dies zudem eine stärkere Hintergrundstreuung während der Beugungsmessung. In der nächsten Sequenz zeigen wir den Cryo-Kühlprozess, der unmittelbar erfolgen sollte.Der Kristall wird so schnell wie möglich nach der Entnahme in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Nachdem die montierte Schleife in flüssigen Stickstoff getaucht wurde, wird sie in einem der Halteschlitze des Lagerpucks an der Tür platziert – in diesem Fall in Position Nummer eins – und von der magnetischen Pinzette freigegeben. Zu diesem Zeitpunkt sollten Ort und Details der gewonnenen und kryogen gekühlten Kristalle im Notizbuch und/oder am Computer dokumentiert werden.Wenn der Puck im Schauffach voll ist oder die Ernte für den Tag abgeschlossen wurde, überführen Sie den Puck in einen stapelbaren Puckhalter in einem Lager- oder Transportbehälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Die nächsten beiden Bilder zeigen kryogenisch gekühlte Kristalle in Kryoschleifen, die geerntet wurden. Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll sind die Kristalle deutlich innerhalb der Meza-Phase in der Schleife erkennbar.In diesem Fall ist der Kristall jedoch nicht sichtbar und müsste mittels Beugungssuche lokalisiert werden. Der nächste Schritt im Gesamtverfahren der Strukturaufklärung mittels makromolekularer Kristallographie besteht darin, Beugungsdaten von den in diesem Artikel demonstrierten geernteten Kristallen zu sammeln. Dies erfolgt üblicherweise mit Synchrotron-Röntgenstrahlung und ist der Schwerpunkt eines separaten JoVE-Artikels dieser Reihe.

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung,...

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Strukturstudien von Biomakromolekülen durch Kristallographie erfordern hochwertige Kristalle. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys (ein vollautomatisiertes Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde) und/oder Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle verwendet werden kann, basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.

Optimierung des Kristallwachstums für die Neutronenmakromolekulare Kristallographie

Das Ziel dieses Artikels ist es, dem Betrachter ein solides Verständnis dafür zu vermitteln, wie sein kleinvolumiges Dampfdiffusionsprotokoll für die Züchtung großer, einzelner Proteinkristalle in eine großvolumige Batch-Mikrokristallisationsmethode für die serielle Kristallographie umgewandelt werden kann.

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond.  Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.

Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle

Lernen Sie die Ernte und Kryo-Kühlung von Membranproteinkristallen in lipidischen Mesophasen für die Strukturaufklärung durch Röntgenkristallographie. Diese Methode sichert die Kristallintegrität für die Analyse.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown (Video) | JoVE Journal

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

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