Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, adulte Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder I PSCs durch tetraploide Embryokomplementierung zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem man zuerst ankommt. I PSCs aus embryonalen Fibroblasten der Maus unter Verwendung von Lentiviren, die OCT vier, SOX zwei, KLA vier und CMIC tragen und die Medien mit Valproinsäure oder VPA ergänzen.

Sobald die IPCs generiert sind, werden sie durch Immunfärbung, Chromosomenzählung und Embryokörperbildung charakterisiert. Der nächste Schritt besteht darin, durch Fusion und In-vitro-Kultur eine tetraploide Blastenunterstützung des Empfängers zu erzeugen. Anschließend werden die IPSC in den tetraploiden Blast-Assist injiziert und der komplementäre Blast-Assist wird den Empfängerinnen für die Trächtigkeit transplantiert.

Im letzten Schritt werden die ausgetragenen Tiere per Kaiserschnitt und an Leihmütter entbunden. So kann die postnatale Entwicklung überwacht werden. Letztlich, wenn lebensfähige Tiere erzeugt werden.

Die Assay-IPSC-Linie gilt als vollständig pluripotent. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Verfahren zur Erzeugung von I PSCs besteht darin, dass unser Verfahren reproduzierbar vollständig pluripotente IPS-Zelllinien erzeugt. IPS-Zelllinien, die mit diesen Methoden erzeugt werden, können für andere Forscher nützlich sein, die die Pluripotenz ihrer IPS-Zellen vergleichen oder die Äquivalenz anderer Reprogrammierungsmethoden feststellen möchten. Diese Methoden werden für Forscher nützlich sein, die vollständig pluripotente IPS-Zelllinien für spezifische nachgelagerte Anwendungen wie In-vitro-Differenzierungsassays generieren möchten.

Fördern Sie die Generierung aller IPSC-Mäuse. Die Verwendung der Telo-Komplementation kann als nützliches Mittel dienen, um die genetische und epigenetische Stabilität verschiedener Zelllinien zu bestimmen. Die Mikrom-Manipulationen, die an der Komplementation tetraploider Embryonen beteiligt sind, sind technisch anspruchsvoll.

Es kann mehrere Monate dauern, bis jemand geübt ist. Bei den Techniken, nach denen IPSC entwickelt wird, erfordert diese Technik ähnliche Kulturbedingungen wie bei herkömmlichen ESL-Gen-Targeting-Experimenten. 24 Stunden nach der Transfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen mit Lentivirus. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 25 Milliliter frische Vorwärmtechnik.

Das Medium bringt das transfizierte Hex für 24 Stunden in den Inkubator zurück, 48 Stunden nach der Transfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen mit Lentivirus sammeln Wachstumsmedium mit lentiviralen Partikeln aus den transfizierten Zellen. Entfernen Sie partikelförmige Rückstände aus dem virushaltigen Medium durch Zentrifugation bei 3000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Als nächstes wird das Virus durch Ultrazentrifugation durch ein 20%iges Saccharosekissen für zwei Stunden bei 112.000 g bei vier Grad Celsius konzentriert.

Dekantieren Sie es vorsichtig in einen Abfallbehälter zur Dekontamination, ohne das Viruspellet zu stören. Resuspendieren Sie das Viruspellet in 0,4 Millilitern embryonalem Fibroblastenmedium der Maus und verschließen Sie das Röhrchen. Dann bei vier Grad Celsius 15 bis 30 Minuten sanft schaukeln.

Lagern Sie Viruspartikel und Einmal-Aliquots bei minus 80 Grad Celsius.IPSC. Die Linien stammen aus embryonalen Fibroblasten der Maus oder Meth-Zellen. Sobald IPSC-Kolonien einen hellen, refraktiven, gut definierten Rand besitzen und 30 bis 50 Zellen enthalten, können sie manuell entnommen und als unabhängige IPSC-Linien erweitert werden.

Entnehmen Sie einzelne Kolonien mit einer Pipettenspitze zum Laden mit Gel und übertragen Sie jede Kolonie direkt in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte mit U-Boden, die 20 Mikroliter 0,25 %Trypsin-EDTA enthält, inkubieren Sie die ausgewählten Kolonien und Trypsin etwa acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius oder bis die Kolonien in einzelne Zellen dissoziiert sind. Überwachen Sie den Fortschritt der Dissoziation durch Lichtmikroskopie. Eine sanfte Behandlung kann erforderlich sein.

Übertragen Sie die dissoziierte Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte, die eine Feeder-Schicht und 150 Mikroliter ESC-Medium enthält, das mit Doxycyclin und VPA ergänzt ist. Wenn IPSC-Kolonien in jeder Vertiefung wieder erscheinen, werden sie in größere Vertiefungen aufgeteilt, um sie zu analysieren und zu zellbankieren, wobei Standard-ESC-Ableitungs- und Zellkulturverfahren verwendet werden, um das Verfahren zur Erzeugung von tetraploider Blast-Unterstützung zu beginnen. Einzellige Embryonen, die von weiblichen Mäusen entnommen wurden, werden über Nacht in KSOM bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am nächsten Tag zu zwei Zellembryonen kultiviert. Legen Sie einen BTX-Objektträger in eine 10 Zentimeter große Petrischale.

Gießen Sie genügend Elektroschweißmedium bei Raumtemperatur, um den Objektträger in die Lösung einzutauchen, aber nicht so viel, dass die Pole der Elektrode vollständig eingetaucht sind. Schalten Sie den BTX-Elektrozellenmanipulator ECM 2001 und den BTX-Enhancer 400 ein. Verbinden Sie die ECM-Kabel mit der Elektrode des Mikroobjektträgers und befestigen Sie die Kabel an der Seite der Petrischale, um eine unbeabsichtigte Bewegung des Objektträgers zu verhindern.

Führen Sie einen manuellen Impuls aus, um einen Messwert am BTX-Verstärker zu erhalten, und notieren Sie die Spannung der angelegten Gleichströme. Der Wechselstrom steuert die Geschwindigkeit, mit der sich die Embryonen zwischen den Elektroden ausrichten. Der Gleichstrom verschmilzt die Gotteslästerer und die Impulszeit stellt die Länge des Gleichstromimpulses ein.

Ein guter Ausgangspunkt ist Wechselstrom drei Volt Gleichstrom 100 Volt und mal 0,05 Millisekunden. Der optimale Gleichstrom variiert im Bereich von 90 bis 150 Volt. Mit einer Mundpipette.

Nehmen Sie 30 bis 42 Zellembryonen aus der KSOM-Kultur und übertragen Sie sie in einen Tropfen Elektrofusion. Medium durch mehrere Tropfen Elektroschweißmedium waschen. Ziehen Sie anschließend frisches Elektroschweißmedium aus der Mikroschiebeschale in die Mundpipette.

Nehmen Sie gewaschene Embryonen und platzieren Sie sie in den ein Millimeter großen Abstand zwischen den Elektroden auf dem Objektträger. Achten Sie darauf, dass die Embryonen in der Mitte des Spaltes ausgerichtet sind und nicht miteinander in Berührung kommen. Wenden Sie Wechselstrom an, indem Sie die manuelle Starttaste drücken.

Die Embryonen rotieren im Wechselfeld, bis die Ebene des blasierteren Kontakts parallel zu den Elektroden verläuft. Wenn die Embryonen innerhalb weniger Sekunden nicht ausgerichtet sind, erhöhen Sie die AC-Einstellung. Nachdem sich die Embryonen ausgerichtet haben, drücken Sie die manuelle Starttaste erneut, um den Gleichstromimpuls mit Elektrofusionsmedium in der Pipette zu platzieren.

Sammeln Sie die Embryonen aus dem Mikroobjektträger, waschen Sie sie durch mehrere Tropfen KSOM-Medium und kultivieren Sie die Embryonen dann in KSOM unter Mineralöl bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Die Blasterfusion sollte in weniger als 30 Minuten abgeschlossen sein. Überwachen und selektieren Sie in Kultur erfolgreich Embryonen mit fusionierten Blastomeren.

Fusionierte Embryonen scheinen in einem Zellstadium verworfen zu werden, lysiert und zweizellige Embryonen nach 30 Minuten in Kultur, fahren Sie fort, fusionierte Embryonen in Mikrotropfen KSOM unter Mineralöl bei 37 Grad Celsius zu kultivieren. 5% Kohlendioxid zur Vorbereitung von IPCs für die Blastinjektion tauen Sie zuvor gelagerte IPCs auf und plattieren Sie sie auf Feedern im ESC-Medium Passage zu den Zellen mindestens einmal auf Feedern. Nach dem Auftauen vor der Anwendung zur Injektion.

Eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, die 70 bis 80 % konfluente IPCs enthält, liefert mehr als eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Injektion, aspiriert das Wachstumsmedium und wäscht die Zellen mit drei Millilitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium bei 0,5 Millilitern Vorwärmen, 0,05 % Trips in EDTA zu den Zellen und inkubiert bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten mit gelegentlichem Schaukeln bei 3,0 Millilitern ESC-Medium und iteriert, um ein einzelnes zu erhalten Zellsuspension. Beobachten Sie die Zellen durch Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass eine einzelne Zellsuspension, Kolonien oder Zellaggregate die Injektionspipette verstopfen. Sobald eine Einzelzellsuspension erreicht wurde, geben Sie einen Milliliter ESC-Medium in die Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den 37-Grad-Inkubator.

Inkubieren Sie etwa 15 Minuten lang oder bis die Mehrheit der Feederzellen zu adhäsieren begonnen hat, und entfernen Sie vorsichtig das Medium, das die IPCs enthält. Achten Sie darauf, die wöchentlich anhaftenden Feederzellen nicht zu verdrängen. Die IPCs werden fünf Minuten lang in ein konisches 15-Liter-Röhrchen mit fünf Millilitern ESC-Medium gegeben, eine Zentrifuge bei 200 G.

Der Überstand wird abgesaugt und der Rest des ESC-Mediums mit einer Mikropipette entfernt. Klopfen Sie auf das Rohr, um das Pellet zu lösen, und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 0,2 bis 0,5 Millilitern vorgekühltem FHM-Medium. Lagern Sie die Zellen bis und während der Injektion in tetraploide Blast-Assists auf Eis. Für das Protokoll für die Blast-Assist-Injektion verweisen wir auf das Manuskript zu diesem Artikel und auf einen zuvor veröffentlichten Strove-Artikel, von dem ein Auszug hier auf dem Bildschirm gezeigt wird.

Beispiele für die morphologische Progression von Fibroblasten zu IPSC-Kolonien im Verlauf eines Reprogrammierungsexperiments sind in diesen Bildern zu sehen. Die morphologische Heterogenität und die teilweise reprogrammierte Bildung von IPSC-Kolonien sollten ab vier bis fünf Tagen nach der VPA-Ausgabe von Doxycyclin beobachtet werden, wie in den Panels B bis EWSA gezeigt. Wie bei IPSC sollten Kolonien zwischen sieben und 10 Tagen erscheinen, wie in Panel F gezeigt. Die Produktion von einzelligen Telo-Embryonen durch Elektrofusion von diploiden zweizelligen Embryonen ist hocheffizient.

Es ist Routine, bis zu 95 % der behandelten zweizelligen Embryonen zu beobachten, die erfolgreich fusioniert wurden, um tetraploide einzellige Embryonen zu erzeugen. Das Protokoll, das in diesem Experiment für die Injektion von IPSC in den tetraploiden Blastenassistenten verwendet wird, ähnelt dem Protokoll für die Injektion von E SES in den diploiden Blastenassistenten, um chimäre Mäuse zu erzeugen, um die Entstehung diploider Chimären leicht auszuschließen. Die Pigmentierung der Mausstämme, die zur Erzeugung von IPSes und tetraploiden Embryonen verwendet werden, wird nach Möglichkeit sorgfältig ausgewählt. In diesem Beispiel werden tetraploide Embryonen aus einem Albino-Stamm und IPSC aus einem pigmentierten Stamm erzeugt.

So zeigen neugeborene IPSC-Mäuse im Erwachsenenalter pigmentierte Augen und eine gleichmäßig pigmentierte Fellfarbe, während diploide Kyras eine gemischte Albino- und Pigmentfärbung aufweisen. Die Anzahl der geborenen lebenden Jungtiere hängt von der Zelllinie ab, wie in dieser Tabelle gezeigt. Für eine durchschnittlich gute IPSC-Linie sollten Experimentatoren damit rechnen, dass zwischen 1 % und 10 % der injizierten Blast-Unterstützung lebende neugeborene Welpen hervorbringt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vollständig pluripotente IPS-Zellen ableitet und wie man ihr Entwicklungspotenzial validiert. Mit dem tetraploiden Komplementationsassay Sobald diese Technik von der Ableitung des MES bis zur IPSC für Neugeborene beherrscht wird, können Mäuse innerhalb von zwei bis drei Monaten abgeschlossen werden. Die Entwicklung und Pflege von I PSCs erfordert ein hohes Maß an Zellkulturtechnik.

Vorkenntnisse mit der ESL-Kultur sind unerlässlich. Vergessen Sie nicht, mit Lentiviren zu arbeiten, insbesondere konzentrierte Lentiviren können äußerst gefährlich sein. Man sollte immer die von Ihrer Institution vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung tragen und darauf achten, alles, was mit dem Virus in Berührung gekommen ist, mindestens 20 Minuten lang mit 10 % Bleichmittel zu behandeln.

Alle IPSC-Mäuse und ihre Gewebe können auf physiologische, pathologische und verhaltensbezogene Phänotypen analysiert werden.