Name: Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung adulter Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Tetraploider Embryo-Komplementation. Dieses Protokoll validiert die volle Pluripotenz von iPSC-Linien für die Stammzellbiologie.

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Unterstützung für KKB wurde MJB, JLH und KLN vom California Institute for Regenerative Medicine, der Pew Charitable Trusts Biomedical Scholars Program, das Esther B. O&#39;Keeffe Family Foundation und der Shapiro Family Foundation zur Verfügung gestellt. KKB ist ein Donald E. und Delia B. Baxter Foundation Faculty Scholar.

Diese Methode wurde in der Forschung in Boland et al. Nature berichtet werden. 461, 91-96 (2009). 1 Ein. Herstellung von Lentivirus Dieses Protokoll arbeitet Doxycyclin-induzierbaren lentiviralen Shuttle-Vektoren, die für Oct4 codieren, Sox2, Klf4, und c-Myc unter Steuerung eines tetO Antwortelement. Transgene werden durch die umgekehrte Tetracyclin trans-aktivierendes Protein, rtTAM2.2 16, die Umprogrammierung Faktor-Expression in Gegenwart von Doxycyclin induziert aktiviert. Dieses System ermöglicht streng kontrollierten, hohe Expression von Umprogrammierung Faktoren. Die lentiviralen Vektoren werden dabei selbst inaktivierende und kann somit nicht replizieren folgenden genomische Integration. Allerdings ist Vorsicht geboten beim Umgang mit Lentiviren und sollten in Labors kompatibel mit BSL2 (USA) und S2 (Europe) Standards durchgeführt werden. <ol><li> HEK293T-Zellen aufgetaut und Passage mindestens einmal vor transfection. Zellen sollten subkonfluente HEK Dichte im Medium bei 37 ° C gehalten werden, 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. Routinemäßig Durchlaßzellen alle 2 Tage mit einem Split-Verhältnis von 1.06 bis 01.10 Uhr. </li><li> Saatgut ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 mit 25 ml HEK Medium. Verwenden Sie ein T150 für jeden Lentivirus Vorbereitung. </li><li> Die folgenden Tag transfizieren HEK293T-Zellen durch Calciumphosphat-Präzipitation. (Anmerkung: in unseren Händen Calciumphosphatpräzipitation routinemäßig 80-90% ergibt Transfektionseffizienz, doch, kationische Lipid Transfektionsreagenzien wie Lipofectamin 2000 ebenfalls verwendet werden können). Bereiten Sie zwei 15 ml konischen Röhrchen für jeden Virus vorbereitet werden. Beschriften Sie die Röhrchen &quot;A&quot; und &quot;B&quot;. Röhre A, 10 ug von jeder der: die lentivirale Shuttlevektor Codierung Reprogrammierungsfaktoren (oder rtTAM2.2), die virale Verpackungssignal Vektoren und Plasmid kodierend das Virushüllprotein, VSVG. Fügen Sie 186 ul 2 M CaCl 2 bis Rohr A, und bringe das Volumen auf 1,5 ml mit sterilem H 2 O. Tube B: 1,5 ml 2x HBS (auf Raumtemperatur vorgewärmt). </li><li> Pipettieren der Mischung im Rohr A, bis es eine homogene Lösung ist. Fügen Lösung A zu Lösung B tropfenweise und stehen lassen bei Raumtemperatur für 2-3 min. </li><li> Absaugen Wachstumsmedium HEK293T Zellen und ersetzen mit 22 ml vorgewärmten HEK-Medium ohne Penicillin und Streptomycin. </li><li> Pipette kombinierten Lösungen AB (Calciumphosphat-Niederschlag) direkt an HEK293T Zellen und gleichmäßig verteilen durch sanftes Schaukeln. </li><li> 24 Stunden nach Transfektion von HEK-293T-Zellen mit Lentivirus, entfernen Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 25 ml frisch, vorgewärmten HEK Medium. Zurück transfizierten HEKS in den Inkubator. </li><li> 48 Stunden nach Transfektion von HEK-293T-Zellen mit Lentivirus, sammeln Nährmedien mit lentivirale Partikel aus den transfizierten HEKS. Entfernen Partikelteilchen aus der geernteten viralen Lösung durch Zentrifugieren bei 3000 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Konzentrieren Virus durch Ultrazentrifugation through eine 20% Saccharose-Kissen (2 ml sucrose/25 ml viralen Überstand) für 2 Stunden bei 112.000 × g bei 4 ° C. Suspend virale Pellet in 0,4 ml MEF Medium bei 4 ° C für 15-30 min unter leichtem Schütteln. Bewahren Viruspartikel im einzelnen Aliquots (dh 50 ul) bei -80 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung der embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) für Reprogrammierung Hinweis: Das Protokoll hier skizzierten bezieht sich auf die Ableitung von iPS von E 13,5 embryonale Maus-Fibroblasten für den Einsatz in TEC-Assays. Während andere Gruppen all-iPSC Mäuse von erwachsenen Spenders Zellquellen generiert haben, haben wir nicht diese Methode auf andere Zelltypen nicht getestet und kann sicher sein, dass Spender Zelltyp nicht ein Faktor. <ol><li> Richten Sie mit der Maus timed Paarungen. An embryonalen Tag 13,5 (E13.5), einschläfern die schwangere Frau und sezieren die Embryonen aus den Uterushörner. Ort und Shop Embryonen in 1x PBS (vorgekühlt auf 4 ° C) auf Eis. </li><li> Entfernen Sie die extraembryonalen Gewebe (dhChorion, Amnion und Plazenta). Enthaupten den Embryo und entfernen Sie den Schwanz (optional - wenn für die Genotypisierung erforderlich) und Gliedmaßen. Scoop aus der inneren Organe, mit einer Pinzette oder einer Schaufel geformten Spachtel und zerkleinern die restlichen Karkasse mit der Klinge eines Skalpells oder einer scharfen Schere. </li><li> Waschen Sie das Hackfleisch Karkasse in 5 ml vorgekühlte 1x PBS. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. </li><li> Überstand. Suspend Pellet in 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln für 20-30 min. </li><li> 5 ml MEF Medium (vorgewärmt auf 37 ° C), mischen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in vorgewärmten MEF Medium. </li><li> Platte dissoziierten MEFs in 2-3 Wells einer 6-Well-Platte vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. Dies wird als ein Durchgang. </li><li> Passage MEFs bei einer Verdünnung von 1.04 Uhr bis 01.05 Uhr alle 48 Stunden. MEFs in Passage 3 sind bereit für lentivirale Transduktion. </li></ol> 3. Ableitung von iPSC Linien <ol><li> Am Tag vor lentivirale Transduktion; seed ~ 3 x 10 5 primäre MEFs in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. </li><li> Tag 1: Primäre MEFs sollte 80-90% konfluent für lentivirale Transduktion sein. Fügen lentivirale Partikel direkt an MEF Medien und inkubieren mit MEFs über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. </li><li> Am folgenden Tag (Tag 2) Saugen Sie das Medium und waschen zweimal mit 3 ml 1x PBS, um virale Partikel zu entfernen. </li><li> 0,5 ml vorgewärmtes 0,25% Trypsin-EDTA zu den Zellen und bei 37 ° C für 3-5 min mit gelegentlichen rocking. </li><li> Verreiben eine Einzelzell-Suspension zu erzielen. Beobachten Zellen lichtmikroskopisch um eine Einzelzellen-Suspension zu gewährleisten. </li><li> Übertragen MEFs in einem 15 ml konischen Röhrchen, das 5 ml MEF Medien. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand und sanft resuspendieren Zellen in MEF Medium. </li><li> Gleichmäßig aufgeteilt die Zellsuspension zwischen zwei Vertiefungen einer 6-Loch-pspäten vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. </li><li> Rocken die Platte hin und her, hin und her, und einmal in einer kreisförmigen Bewegung um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen gut zu erreichen. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. </li><li> Tag 3: Wiederholen Sie die Schritte 4-9, außer spalten die Zellen gleichmäßig von einem gut 3 Vertiefungen einer 6-Well-Platte vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. Das ergibt 6 Vertiefungen von primären Fibroblasten transduziert. </li><li> Tag 4: Add Doxycyclin (Dox) bei einer Konzentration von 10 ug / ml bis 5/6 Brunnen. Ein gut sollte unbehandelt bleiben, um als Kontrolle dienen. </li><li> Hinzufügen VPA bei 1,9 mM bis 3 der 5 Vertiefungen mit dox behandelt. VPA reduziert die Proliferationsrate von MEFs. Dense Kulturen MEFs tolerieren längerer VPA während subkonfluenten Kulturen innerhalb von 2-5 Tagen senesce neigen. Daher sollte MEFs 100% konfluent wenn VPA hinzugefügt wird. Hinweis: Wir verwenden VPA in unserem Reprogrammierung Versuche, weil es eine bekannte epigenetische Modifikator, und wurde shEigene, die Effizienz der Erzeugung iPSC 17 obwohl die Wirkungen und Mechanismen von VPA Wirkung gegenüber Herstellung vollständig pluripotenten iPSC Linien sind nicht bekannt erhöhen. </li><li> Tag 5: Saugen Sie das Medium, waschen und trypsinieren die Zellen wie zuvor. Passage die Zellen mit dox / VPA zu einer 15 cm 2 Gewebekulturschale vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine und jeder der anderen Bedingungen vor, beschichtete 10 cm 2 Gerichte in ES-Zell-Medium mit frischem dox und VPA ergänzt behandelt. </li><li> Tanken Zellen jeden Tag mit ESC Medium mit frischem dox und VPA ergänzt. ESC-ähnliche Kolonien beginnt nach ca. 7 Tagen in der dox / VPA-Behandlung und nach ~ 10 Tage in der dox eigenständige Behandlung erscheinen. Keine Kolonien in Abwesenheit von dox Behandlung erscheinen. </li><li> Sobald Kolonien ein helles refraktiven besitzen, gut definierte Grenze und enthalten 30-50 Zellen manuell isolieren die Kolonien mit einem Gelbeladung Pipettenspitze und Transfer zu einem U-Boden 96 Well-Platte mit 20 ul von 00,25% Trypsin-EDTA. Trypsinieren, um einzelne Zellen und Transfer zum Abzweigen in einem flachen Boden 96 Well-Platte in 150 ul ESC-Medium mit dox / VPA oder dox allein. </li><li> Weiter zu klonal expandieren die isolierten iPSC Linien auf Feeder ESC Medium. Entfernen dox und VPA am Tag 19 nach Zugabe (post-Transduktion Tag 23). Entsorgen iPSC Linien, die nicht pflegen Selbst-Erneuerung oder Proliferation ähnlich ESC Kontrollen. </li></ol> Es kann hilfreich sein, um Ihre iPSC Linien in Bezug auf ESCs charakterisieren bevor TEC durchzuführen. Wir haben unsere Linien durch 1) die Expression von endogenen Pluripotenz Marker (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) Immunzytochemie, 2) Karyotypanalyse durch Chromosomenzählung und 3) Embryoidkörper Bildung. Man kann auch durchführen lentiviralen-spezifische RT-qPCR, um zu bestätigen, dass die provirale Transgene nicht in den iPSCs ausgedrückt. Allerdings haben wir voll pluripotente iPS identifiziert mit nur Morphologie, Immunfärbung und karyotyping. In unseren Experimenten Auswahl iPSC Linien auf ESC-artige Morphologie und Wachstumseigenschaften Ergebnisse in der Mehrzahl der Linien exprimieren Pluripotenz Marker basiert, während wir typischerweise identifizieren mehrere Linien mit potentiell anormale Karyotypen. 4. Vorbereitung der iPS in Blastozysten injiziert Passage Nummer eines PSC Linie hat sich gezeigt, ihre Pluripotenz 18 beeinträchtigen, obwohl dies abhängig Linie 19 sein kann. Wir haben iPSCs von Passagen 8-14 zur Behandlung von erwachsenen all-iPSC Mäuse produzieren. <ol><li> Thaw iPSCs und Platte auf Feeder ESC Medium. Passage der Zellen mindestens einmal auf Zubringer vor dem Einsatz zur Injektion. </li><li> Einem Well einer 6-Well-Platte, enthaltend 70-80% konfluenten IPSCs wird mehr als eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Injektion. Absaugen Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit ~ 3 ml 1x PBS (ohne Ca 2 + / Mg 2 +). </li><li> 0,5 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTAdie Zellen und bei 37 ° C für 10 min mit gelegentlichen rocking. </li><li> Verreiben eine Einzelzell-Suspension zu erzielen. Beobachten Zellen lichtmikroskopisch um eine Einzelzellen-Suspension zu gewährleisten. Die iPSCs müssen in einzelne Zellsuspension so Kolonien / Zellaggregate die Injektionspipette verstopfen. </li><li> Sobald eine Einzelzellsuspension ben erreicht hat, 1,0 ml ESC Medien zum Brunnen und gibt die Platte an dem 37 ° C Inkubator. Inkubieren ~ 15 min oder bis die Mehrheit der Anleger haben damit begonnen, haften. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium mit den iPS dabei nicht die schwach haftende Anleger zu vertreiben. </li><li> Legen Sie die iPS in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml ESC Medium. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand und entfernen Sie den Rest der ES-Zell-Medium mit einer Mikropipette. Tippen Sie auf das Rohr, um das Pellet und sanft resuspendieren Zellen in 0,2-0,5 ml vorgekühlte FHM Medium zu vertreiben. Shop-Zellen auf Eis, bis und während der Injektion in tetraploide blastocysts. </li></ol> 5. Generation tetraploide Blastozysten Verfahren in diesem Abschnitt ausgeführt haben an anderer Stelle ausführlich 5,6,20 beschrieben worden. Hier beschreiben wir unsere Technik für die BTX Electro Zellmanipulators ECM 2001 optimiert. <ol><li> Richten Sie Embryos Spender Mäusen durch Grundierung 23-28 Tage alte weibliche Mäuse (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) mit PMS und HCG. Verwalten 5 IU von PMS am 02.00 und 5 IU HCG 47 Stunden später. Nach HCG Injektion einzurichten weibliche Mäuse mit C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 Deckrüden. Überprüfen Sie die folgenden Tage für vaginale Stecker. </li><li> Euthanize eingesteckt weiblichen Mäusen und sammeln Eileiter. Sammle 1-Zell-Embryonen, indem Eileiter in FHM mit Hyaluronidase und sanft reißen die ampulae. Lassen Sie die cumulus Massen in FHM / Hyaluronidase für 5-7 min sitzen. </li><li> Sammle 1-Zell-Embryonen mit dem Mund ansaugen und waschen durch Tropfen FHM Medien, bevor sie in KSOM-AA Kultur. Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 unter Mineralöl Nacht, und wählen Sie 2-Zell-Embryonen am Tag der Elektrofusion, verwirft alle anderen Embryonen. </li><li> Legen Sie eine BTX MicroSlide in einer 10 cm Petrischale. Gießen Sie genug Raumtemperatur Elektrofusion Medien tauchen die Folie in der Lösung, aber nicht so viel, dass die Pole der Elektrode vollständig untergetaucht. </li><li> Schalten Sie ECM 2001 und BTX Enhancer 400. Verbinden Sie den ECM-Kabel an den MicroSlide der Elektrode und fixieren Sie die Kabel an der Seite der Petrischale zu unbeabsichtigten Bewegung des Schlittens zu verhindern. </li><li> Führen Sie einen manuellen Impuls an eine Lesung auf dem BTX-Enhancer erhalten und beachten Sie die Spannung der AC / DC-Ströme angewandt werden. Wechselstrom wird die Geschwindigkeit, mit welcher die Embryonen zwischen den Elektroden ausgerichtet werden wird, wird die Gleichstrom verschmelzen Blastomeren und Pulszeit wird die Länge des DC-Impuls eingestellt. Ein guter Ausgangspunkt ist AC 3V, DC 100V und Zeit 0,05 ms. Die optimale DC variiert im Bereich von 90-150 Volt. </li&gt; <li> Mit einem Mund Pipette ca. 30-40 Zwei-Zell-Embryonen entnehmen KSOM-AA Kultur und waschen Sie sie durch mehrere Tropfen Elektrofusion Medium. Zeichnen frischen Elektrofusion Medien aus dem MicroSlide Teller in den Mund Pipette und nehmen Embryonen aus der Wäsche. Sie in den 1 mm Spalt zwischen den Elektroden auf dem MicroSlide. Vorsichtig sein, dass sie in der Mitte des Spaltes, und dass sie nicht in Kontakt miteinander ausgerichtet sind. </li><li> Mit Wechselstrom durch Drücken des manuellen Impuls-Taste. Die Embryonen werden in der Wechselstromfeld drehen, bis die Ebene der Blastomere Kontakt ist parallel zu den Elektroden. Wenn Embryonen nicht in ein paar Sekunden ausgerichtet sind, erhöhen AC Einstellung. </li><li> Nach Embryonen ausgerichtet haben, drücken Sie die Handrad-Taste erneut, um die DC Impuls anzulegen. </li><li> Mit Elektrofusion Medium in der Pipette, sammeln die Embryonen aus dem MicroSlide. Waschen Embryonen durch einige Tropfen KSOM-AA und legen Sie sie in KSOM-AA Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. Die Blastomeren Fusion shoULD in weniger als 30 min in Kultur abgeschlossen sein. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7-11 für die verbleibenden 2-Zell-Embryonen. Nach anschließender Fusion Gruppen, zu überwachen und wählen Embryonen mit geschmolzenem Blastomeren. Erfolgreich fusionierten Embryonen erscheint, um in 1-Zell-Stadium sein. Entsorgen lysiert und 2-Zell-Embryonen nach 30 min in der Kultur. Wenn Fusion liegt unter 80%, Erhöhung von Spannung und / oder die Zeit in Schritten von 5V und 0,01 msec. Wenn Lyse über 20%, verringern Gleichspannung und / oder der Zeit entsprechend. Die optimalen Einstellungen in unseren Experimenten wurden AC 4V DC 146v und 0,07 msec. Diese Einstellungen konsequent ergab 90% oder höher Fusionsraten mit wenig oder keiner Lyse. </li><li> Weiterhin Kultur kondensierten Embryonen in Mikrotropfen KSOM-AA unter Mineralöl bei 37 ° C, 5% CO 2. Sie sollten erwarten, 85-95% des fusionierten Embryonen tetraploiden (4n) Blastozysten nach 48 Std. Inkubation bilden. </li></ol> 6. Mikroinjektion von iPS in tetraploide Blastozysten Wir verwenden eine Nikon TE-2000Uinverse Mikroskop mit DIC Optik und Narishige Mikromanipulatoren in Blastozysten injiziert ausgestattet. Jeder tetraploide Blastozysten mit 10-12 iPSCs mit einem Standard-Protokoll für die ESC-Injektion in Maus-Blastozysten, die in einer früheren JoVE Veröffentlichung 5,20,21 nachgewiesen wurde injiziert <ol><li> Legen Sie eine 20 ul Tropfen FHM in der Mitte eines konkaven Objektträger und bedecken Sie es mit 150 ul Mineralöl. </li><li> Senken Sie die Haltepipette und Mikroinjektion Nadel in die FHM Tropfen. Lassen Sie 2-3 min für beide Nadeln teilweise mit FHM füllen. </li><li> Waschen 20-30 tetraploide Blastozysten durch Tropfen FHM und Transfer zum FHM Tropfen auf dem Objektträger. </li><li> Mouth Pipette iPSC Mischung in den Tropfen. Es kann notwendig sein, um die Zellmischung in einem Tropfen FHM vorher, wenn Zellen zu konzentrieren oder aggregiert verdünnen. </li><li> Pick-up 100-200 Zellen mit der Injektionsnadel. </li><li> Halten Sie die Blastozyste mit der inneren Zellmasse in der 9-Uhr postulierenIon. Inject Zellen in blastocoel durch Durchdringen der Zona pellucida und Trophoblasten in der 3-Uhr-Position. Inject 16-18 Zellen pro Blastozyste. </li><li> Zurück iPSC ergänzt Blastozysten zu KSOM-AA Kultur. </li></ol> 7. Transfer von Ergänzt tetraploide Blastozysten in die Gebärmutter Horns des Empfängers Mäuse Ergänzt tetraploide Blastozysten werden chirurgisch zu den Uterushörner der weiblichen Empfängermäuse nach den Richtlinien des Forschers Instituts übertragen, mit der Standard-Technik 20, die wir kurz zusammenfassen soll. Wählen weiblichen CD-1-Mäuse an der pro-Östrus Bühne und stellte sie zur Paarung mit vasektomierten Männchen. Überprüfen Sie für die vaginale Stecker am nächsten Morgen. Frauen sind bereit für uterine Embryotransfer zwei Tage nach dem Plug erkannt wurde (2,5 dpc). Einen Tag vor Empfänger Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart, Einrichten zusätzlicher CD-1 Weibchen mit nicht-vasektomierten Männchenals Ammen für die all-iPSC Mäusen durch Kaiserschnitt abgerufen werden. 8. Kaiserschnitt und Förderung der iPSC-derived Pups Der Transfer der Embryonen TC resultiert typischerweise in mehreren Resorptionen nach der Implantation, auch wenn der iPSC oder ESC-Linie hat eine hohe Entwicklungsfähigkeit. Als Ergebnis kann man erwarten, nicht mehr als 4 lebensfähige Jungtiere (in der Regel 1-2) pro Empfänger. Diese kleinen Würfe sind in der Regel von den Empfängern vernachlässigt. Um das Niveau der Neonatologie und die Überlebensrate zu erhöhen, führen wir C-Profile und die Förderung nach dem Standard-Protokolle 20. Um den Kaiserschnitt durchzuführen, einschläfern Empfängermäuse 16 Tage nach dem Embryotransfer bei 7-08.00 (Empfänger 18,5 dpc) und sezieren Welpen aus den Uterushörner. Foster lebensfähige Jungtiere zur CD-1 Müttern, dass die gelieferten Würfe am selben Tag.

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<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Generieren Mäuse aus iPS-Linien mit TEC-Assays stellt eine strenge funktionale Test für die Pluripotenz einer iPSC Linie. Dieser Test kann nützlich sein, um die relative Wirksamkeit der verschiedenen Verfahren der Reprogrammierung beurteilen oder iPSC Linien, die am nützlichsten sein kann zum Erzeugen bestimmter Zelltypen in vitro zu identifizieren. Mäuse aus iPS erzeugt werden, können verwendet werden, um stringent testen die langfristige Stabilität und Tumorigenität von iPSC abgeleiteten Geweben werden. Dieses Protokoll wird nützlich sein, um Ermittler wollen voll pluripotente iPS Linien oder iPSC Mäuse zu generieren oder die relative Nutzen der verschiedenen Verfahren der Reprogrammierung zu vergleichen. Die Mechanismen, die Erzeugung und Identifizierung von vollständig pluripotente iPS Kontrolle bleiben schlecht verstanden und es ist möglich, dass einige iPSC Linien unter Verwendung dieser Methode wird nicht durch den TEC-Test. Viele Faktoren können zwischen Experimenten einschließlich der genetischen Hintergründe, lentiviralen Titer, Muster von lentiviralen i variierennsertion, Zell-Zyklus-Parameter des Spenders Bevölkerung, Inter-Labor-Unterschiede in den verschiedenen Stufen des TEC Verfahren und variable Neigungen iPSCs beherbergen genetischer oder epigenetischer Aberrationen. Die besten Voraussetzungen dafür Erfolg, wir kümmern uns um angemessenen Niveaus des lentiviralen Genexpression in iPSC Ableitung Experimenten testen viralen Verdünnungen zur Kontrolle MEFs um sicherzustellen, dass jeder Virus ausreichend konzentriert zu nachweisbaren Genexpression mindestens 80% und idealerweise 100% der Erzeugung zu etablieren MEFs. Dies ermöglicht es uns, um Linien mit mehreren Kopien verschiedener Lentiviren zu identifizieren, während limitierenden Toxizität der MEFs und produziert Kolonien ohne Überbelegung der Brunnen. Es sollte beachtet werden, dass mehrere andere Protokolle erwiesen haben IPSCs mit voller Entwicklungspotential erzeugen, unter Verwendung mehrerer Verfahren und Donorzelle Quellen nahe legt, dass mehrere Pfade zu allen Pluripotenz kann 1,8-13,15 existieren. Derzeit jedoch keine definitive Biomarker voll pluripotent iPSCidentifiziert wurde und daher die TEC Assay bleibt der Goldstandard Test, ob eine Linie iPSC können alle Zelllinien in einem Organismus zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>DMEM (hoher Glukosegehalt)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ES-Zell-qualifiziertes FBS</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;Ethanol</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>0,1 % Gelatine</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (murines LIF)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Valproinsäure</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; kostenlos</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin, zur Superovulation, gefriergetrocknet, 2.000 IE</td><td>Harbor-UCLA-Forschungsinstitut</td><td>n. a.</td><td></td></tr><tr><td>Choriongonadotropin, humanes</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>FHM-Medium mit Hyaluronidase</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-1/2 AA-Medium</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, für Embryotransfer, Embryo getestet</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl, embryonal getestet</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannit</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), für Embryonen getestet</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>nicht bestrahlte embryonale Fibroblasten von Mäusen</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;stark&gt;Medien und Puffer, die in diesem Protokoll verwendet werden&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;HEK293T-Wachstumsmedium. 90 % DMEM, 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin. Penicillin und Streptomycin aus dem HEK-Medium ausschließen, das am Tag der Transfektion verwendet wird. Das HEK-Medium kann bei 4 °C gelagert werden. &amp;deg;C bis zu 1 Monat lang.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM Dextrose. pH auf 7,1 ± 0,1 einstellen. Der pH-Wert ist kritisch! Steril filtrieren und bei 4 °C lagern. &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Wachstumsmedium für murine embryonale Fibroblasten (MEF) (auch für die Verwendung mit Fütterungszellen geeignet). 70 % DMEM, 20 % Medium 199, 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin. Bei 4 °C lagern. &amp;deg;C bis zu 1 Monat lang.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;ESC-Wachstumsmedium. 85 % DMEM, 15 % für ES-Zellen geeignetes FBS, 1x Glutamax, 0,1 mM nicht essentielle Aminosäuren, 0,1 mM &amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;Ethanol, 1.000 U/ml ESGRO, 100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin. ESC-Medien können bei 4 &amp;deg;C bis zu drei Wochen.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Elektrofusionsmedium. 0,3 M Mannit, 0,1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;und 3 % BSA in Embryotestwasser. Bei 4 °C lagern &amp;deg;C bis zu 3 Monate lang.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

generation der mäuse aus induzierten pluripotenten stammzellen

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSCs) aus somatischen Zellen liefert ein Mittel, um wertvolle Werkzeuge für Grundlagenforschung erstellen und kann zusätzlich auch eine Quelle von auf den Patienten abgestimmte Zellen für regenerative Therapien. iPSCs können unter Verwendung mehrerer Protokolle und abgeleitet aus mehreren Quellen gefahndet. Einmal erzeugt werden IPSCs getestet unter Verwendung einer Vielzahl von Assays, einschließlich Immunfärbung für Pluripotenz Markern Generation drei Keimblätter in embryoid bodies und Teratome, Vergleichen der Genexpression mit embryonalen Stammzellen (WSR) und Produktion von chimären Mäusen mit oder ohne Beteiligung Keimbahn 2 . Wichtig ist, dass iPSC Linien, die diese Tests bestehen noch variieren in ihrer Fähigkeit, produzieren verschiedene differenzierte Zelltypen 2. Dadurch wurde es schwierig, festzustellen, welche iPSC Ableitung Protokolle Donorzelle Quellen oder Auswahlmethoden am nützlichsten sind für verschiedene Anwendungen. Die strengste Testob eine Stammzell-Linie hat genügend Entwicklungspotenzial, alle Gewebe für das Überleben eines Organismus benötigt generieren (sog. volle Pluripotenz) ist tetraploide Embryos Ergänzung (TEC) 3-5. Technisch beinhaltet TEC Elektrofusion von Zwei-Zell-Embryonen tetraploiden (4n) ein-Zell-Embryonen, die in vitro in das Blastozystenstadium 6 kultiviert werden können erzeugen. Diploiden (2n) pluripotente Stammzellen (zB WSR bzw. iPSCs) werden dann in die blastocoel Hohlraum der tetraploide Blastozysten injiziert und an einen Empfänger Buchse für Schwangerschaft (siehe Abbildung 1). Die Komponente der tetraploiden Embryo ergänzt trägt fast ausschließlich den extraembryonale Gewebe (Plazenta, Dottersack), während die diploiden Zellen der Embryo ordnungsgemäße bilden, was zu einem Fötus vollständig aus dem injizierten Stammzelllinie abgeleitet. Kürzlich berichteten wir über die Ableitung von iPSC Linien, die reproduzierbar erzeugen erwachsenen Mäusenüber TEC 1. Diese iPS-Linien ergeben sich lebensfähige Jungtiere mit Wirkungsgraden von 5-13%, vergleichbar mit WSR 3,4,7 und höher als das für die meisten anderen iPSC Zeilen 8-12 gemeldet wird. Diese Berichte zeigen, dass die direkte Reprogrammierung voll pluripotente iPS, die WSR entsprechen in ihrem Entwicklungspotential und die Effizienz der Erzeugung von Welpen in TEC Tests produzieren. Derzeit ist nicht klar, was unterscheidet zwischen vollständig pluripotenten iPS und weniger potent Zeilen 13-15. Auch ist es nicht klar, welche durch Verfahren der Reprogrammierung wird diese Zeilen mit dem höchsten Wirkungsgrad zu produzieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die vollständig pluripotente iPS und &quot;all-iPSC&quot; Mäuse, die hilfreich sein für die Ermittler wollen die Pluripotenz von iPS-Linien zu vergleichen oder zu etablieren, die Gleichwertigkeit der verschiedenen Verfahren der Reprogrammierung kann produziert.

In Schritt 3, „Herleitung von iPSCs aus MEFs“, sollte man ab 4–5 Tagen nach Zugabe von Doxycyclin/VPA eine morphologische Heterogenität und die Bildung unreifer iPSC-Kolonien beobachten, während reife Kolonien zwischen 7 und 10 Tagen erscheinen (Abbildung 2). Die Herstellung von einzelligen tetraploiden Embryonen in Schritt 5 ist äußerst effizient (Abbildung 3). Üblicherweise beobachten wir, dass bis zu 95 % der behandelten zweizelligen Embryonen erfolgreich fusionieren und tetraploide Einzelzell-Embryonen bilden. Das Protokoll zur Injektion von iPSCs in tetraploide Blastozysten (Schritt 6, Abbildung 4) ähnelt dem Verfahren zur Injektion von ESCs in diploide Blastozysten zur Erzeugung chimärer Mäuse und kann von einem erfahrenen Mikroinjektionisten durchgeführt werden. Die Anzahl der lebend geborenen Welpen hängt von der Zelllinie ab (Tabelle 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Effizienz der MEF-Vorprogrammierung 0,01–0,03 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Effizienz der iPSC-Maus-Erzeugung mittels TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Name</td>
			<td>Beschreibung</td>
			<td>Injizierte Blastozysten</td>
			<td>Lebendgeborene</td>
			<td>Lebende Erwachsene</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6,1 %)</td>
			<td>19 (2,2 %)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3,6 %)</td>
			<td>4 (2,1 %)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1 (0,3 %)</td>
			<td>0 (0 %)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Vertretende Ergebnisse.
<img alt="Schema der tetraploiden Blastozysten-Komplementation; Erzeugung von iPSC-Mäusen aus diploiden Embryonen vom Tag E13." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Designs. Oben links: Erzeugung von tetraploiden Blastozysten. Zweizellige befruchtete Embryonen von albino Mäusen werden elektrofusioniert, um tetraploide Einzelzell-Embryonen zu erzeugen, die anschließend in vitro bis zum Blastozystenstadium kultiviert werden. Unten links: Reprogrammierung. Mausembryonale Fibroblasten werden mit Lentiviren transduziert, die Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc sowie das umgekehrte Tetracyclin-Transaktivatorprotein rtTAM2.2 kodieren. Die Zugabe von Doxycyclin führt zur Expression der Transgene und initiiert die Reprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Rechts: Erzeugung von iPSC-Mäusen. iPSCs, die von pigmentierten Mäusen stammen, werden in den Blastozystenhohlraum tetraploider Blastozysten injiziert und anschließend operativ in pseudo-graviden Empfängermäusen implantiert. Neugeborene iPSC-Mäuse werden per Kaiserschnitt entbunden und fremd aufgezogen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen</a>.
<img alt="Prozess der Zellreprogrammierung; Mikroskopiebilder; Umwandlung von MEFs in iPSCs bei 10x- und 20facher Vergrößerung." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Mit der Reprogrammierung verbundene morphologische Veränderungen. Von links nach rechts: Beispiele für den morphologischen Fortschritt von Fibroblasten zu iPSC-Kolonien im Verlauf eines Reprogrammierungsversuchs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Ansicht anzusehen</a>.
<img alt="Stadien der Embryonalentwicklung: 2-Zell-(2n)-, Blastomerfusion-, 1-Zell-(4n)-Stadium; Mikroskopiebilder." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Herstellung von tetraploiden Embryonen. Diploide Zweizell-Embryonen werden einem elektrischen Impuls ausgesetzt, wodurch die Fusion der Blastomeren und die Bildung einkerniger tetraploider Embryonen erfolgt.
<img alt="iPSC-Injektion in Blastozyste, Ergebnis: iPSC-Neugeborenes und dreiwöchige Maus; Ergebnisse der Zellstudie" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Erzeugung von iPSC-Mäusen. Links: iPSCs werden in den Blastozystenraum einer tetraploiden Blastozyste injiziert. Mitte: Neugeborene iPSC-Mäuse sind an pigmentierten Augen erkennbar. Rechts: iPSC-Maus drei Wochen nach der Geburt.

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet produzieren<sup&gt; 1</sup&gt;.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Die Gewinnung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus somatischen Zellen stellt ein Mittel zur Erzeugung wertvoller Instrumente für die Grundlagenforschung dar und kann zudem ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, erwachsene Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen, oder iPSCs, durch Tetraploid-Embryo-Komplementation zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst iPSCs aus murinen embryonalen Fibroblasten unter Verwendung von Lentiviren, die OCT4, SOX2, KLF4 und c-Myc tragen, gewonnen werden und das Kulturmedium mit Valproinsäure oder VPA ergänzt wird.Nach der Erzeugung der IPCs werden diese durch Immunfärbung, Chromosomenzählung und Embryoidkörperbildung charakterisiert. Im nächsten Schritt erfolgt die Erzeugung von tetraploiden Blastozystenhilfszellen als Empfänger mittels Fusion und Kultur in vitro. Anschließend werden die iPSCs in tetraploide Blastozystenhilfszellen injiziert, und die komplementierten Blastozystenhilfszellen werden in Empfängerweibchen zur Trächtigkeit transplantiert.Im letzten Schritt werden voll ausgetragene Tiere per Kaiserschnitt entbunden und an Pflegemütter übergeben, sodass die postnatale Entwicklung überwacht werden kann. Letztendlich, falls lebensfähige voll ausgetragene Tiere erzeugt werden.Die Test-IPSC-Linie gilt als vollständig pluripotent. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden zur Erzeugung von IPSCs besteht darin, dass unsere Methode reproduzierbar vollständig pluripotente IPS-Zelllinien erzeugt. Mit diesen Methoden erzeugte IPS-Zelllinien könnten für andere Forscher nützlich sein, die die Pluripotenz ihrer IPS-Zellen vergleichen möchten oder die Äquivalenz anderer Reprogrammierungsverfahren etablieren wollen. Diese Methoden werden für Forscher hilfreich sein, die vollständig pluripotente IPS-Zelllinien für bestimmte nachgeschaltete Anwendungen wie In-vitro-Differenzierungsassays erzeugen möchten.Weiterhin die Erzeugung aller IPSC-Mäuse. Die Verwendung der Telomer-Komplementation kann als nützliches Mittel zur Bestimmung der genetischen und epigenetischen Stabilität verschiedener Zelllinien dienen. Die mikroskopischen Manipulationen, die bei der Tetraploid-Embryo-Komplementation erforderlich sind, stellen technisch anspruchsvolle Verfahren dar.Es kann mehrere Monate dauern, bis eine Person die Techniken beherrscht. Die durch diese Technik entwickelten iPSCs erfordern ähnliche Kulturbedingungen wie jene, die in traditionellen ESL-Gen-Targeting-Experimenten verwendet werden. 24 Stunden nach der Transfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen mit Lentivirus das Wachstumsmedium entfernen und durch 25 Milliliter frisches, vorgewärmtes Tech ersetzen.Bringen Sie das Medium zurück, TRANSFECTED hex für 24 Stunden in den Inkubator. 48 Stunden nach der Transfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen mit Lentivirus sammeln Sie das Wachstumsmedium, das Lentivirus-Partikel aus den transfizierten Zellen enthält. Entfernen Sie partikuläre Rückstände aus dem virushaltigen Medium durch Zentrifugation bei 3000 Gs für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Konzentrieren Sie anschließend das Virus durch Ultrazentrifugation durch ein 20%-igen Saccharose-Polster für zwei Stunden bei 112.000 Gs bei vier Grad Celsius. Das Überstand entnehmen Sie vorsichtig in einen Abfallbehälter zur Dekontamination, ohne das virale Pellet zu stören. Lösen Sie das virale Pellet in 0,4 Milliliter Maus-embryonalem Fibroblasten-Medium auf und verschließen Sie das Röhrchen. Danach schwenken Sie es sanft bei vier Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten. Lagern Sie virale Partikel und Einmalaliquote bei minus 80 Grad Celsius. IPSC-Linien werden aus murinen embryonalen Fibroblasten oder Meth-Zellen gewonnen. Sobald IPSC-Kolonien einen hellen, refraktären, klar abgegrenzten Rand aufweisen und 30 bis 50 Zellen enthalten, können sie manuell ausgewählt und als unabhängige IPSC-Linien weiterkultiviert werden.Einzelne Kolonien mit einer Gelpipettenspitze aufnehmen und jede Kolonie direkt in eine einzelne Vertiefung einer U-förmigen 96-Well-Platte überführen, die 20 Mikroliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung enthält. Die aufgenommenen Kolonien und das Trypsin etwa acht Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, oder bis sich die Kolonien in Einzelzellen aufgelöst haben. Den Fortschritt der Dissoziation mittels Lichtmikroskopie überwachen. Gegebenenfalls vorsichtiges Schütteln erforderlich.Überführen Sie die dissoziierte Zellsuspension in eine 96-Well-Platte, die eine Fütterungsschicht und 150 Mikroliter ESC-Medium, ergänzt mit Doxycyclin und VPA, enthält. Wenn iPSC-Kolonien in jedem Well erneut erscheinen, überführen Sie sie in größere Wells zur Analyse und Zellbankierung unter Verwendung standardmäßiger Verfahren zur Ableitung und Kultur von ESCs, um das Verfahren zur Erzeugung tetraploider Blastozysten-assistierter Embryonen zu beginnen. Am Tag danach werden aus weiblichen Mäusen gewonnene Einzelzell-Embryonen über Nacht in KSOM bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu Zweizell-Embryonen kultiviert. Stellen Sie einen BTX-Mikroschlitten in eine 10 cm große Petrischale.Geben Sie so viel elektrofusionsfähiges Medium mit Raumtemperatur hinzu, dass der Objektträger in der Lösung eingetaucht ist, jedoch nicht so viel, dass die Pole der Elektrode vollständig untergetaucht sind. Schalten Sie den BTX Elektrozellenmanipulator ECM 2001 und den BTX Enhancer 400 ein. Verbinden Sie die Kabel des ECM mit der Elektrode des Mikroobjektträgers und befestigen Sie die Kabel an der Seite der Petrischale, um unbeabsichtigte Bewegungen des Objektträgers zu verhindern.Führen Sie einen manuellen Impuls durch, um eine Messung am BTX-Verstärker zu erhalten, und notieren Sie die Spannung der angelegten Gleichstromströme. Der Wechselstrom steuert die Geschwindigkeit, mit der sich die Embryonen zwischen den Elektroden ausrichten. Der Gleichstrom verschmilzt die Blastomere, und die Impulsdauer legt die Länge des Gleichstromimpulses fest.Ein guter Ausgangspunkt ist Wechselstrom (AC) drei Volt Gleichstrom (DC) 100 Volt und 0,05 Millisekunden. Der optimale Gleichstrom variiert im Bereich von 90 bis 150 Volt. Unter Verwendung einer Mundpipette.Entnehmen Sie 30 bis 42 Zellen enthaltende Embryonen aus der KSOM-Kultur und überführen Sie sie in einen Tropfen Elektrofusionsmedium. Waschen Sie sie durch mehrere Tropfen Elektrofusionsmedium. Ziehen Sie danach frisches Elektrofusionsmedium aus der Mikroschlitten-Schale in die Mundpipette.Nehmen Sie gewaschene Embryonen und platzieren Sie sie in dem einen Millimeter breiten Spalt zwischen den Elektroden auf dem Mikroschlitten. Achten Sie darauf, dass die Embryonen mittig im Spalt ausgerichtet sind und nicht miteinander in Kontakt stehen. Geben Sie Wechselstrom an, indem Sie die manuelle Starttaste drücken.Die Embryonen werden sich im Wechselfeld drehen, bis die Ebene des Blastomer-Kontakts parallel zu den Elektroden liegt. Falls sich die Embryonen innerhalb weniger Sekunden nicht ausrichten, erhöhen Sie die Wechselstrom-Einstellung. Sobald sich die Embryonen ausgerichtet haben, drücken Sie erneut die manuelle Starttaste, um den Gleichstromimpuls mit elektrofusionsfähigem Medium in der Pipette anzuwenden.Sammeln Sie die Embryonen von der Mikroschiebe, waschen Sie die Embryonen durch mehrere Tropfen KSOM-Medium und kultivieren Sie die Embryonen anschließend in KSOM unter Mineröl bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Die Blastomerienfusion sollte innerhalb von weniger als 30 Minuten abgeschlossen sein. Überwachen und selektieren Sie im Kulturverlauf Embryonen mit erfolgreich fusionierten Blastomeren.Verschmolzene Embryonen erscheinen im Ein-Zell-Stadium; verwerfen Sie lysierte und Zweizell-Embryonen nach 30 Minuten Kultur. Fahren Sie mit der Kultur der verschmolzenen Embryonen in Mikrotropfen aus KSOM unter Mineröl bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid fort, um IPCs für die Blastozysteninjektion vorzubereiten. Tauen Sie zuvor eingelagerte IPCs auf und plattieren Sie sie auf Fütterungszellen in ESC-Medium. Passagieren Sie die Zellen mindestens einmal auf Fütterungszellen, nach dem Auftauen und vor der Verwendung für die Injektion.Eine Vertiefung einer 6-Loch-Platte mit 70 bis 80 % konfluenten IPCs liefert mehr als ausreichend Zellen für die Injektion. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit drei Millilitern PBS ohne Calcium oder Magnesium. Geben Sie 0,5 Milliliter vorgewärmtes 0,05 %iges Trypsin-EDTA zu den Zellen und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 °C mit gelegentlichem Schwenken. Fügen Sie 3,0 Milliliter ESC-Medium hinzu und pipettieren Sie, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Überprüfen Sie die Zellen mittels Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension vorliegt; Kolonien oder Zellaggregate könnten die Injektionspipette verstopfen. Sobald eine Einzelzell-Suspension erreicht ist, geben Sie ein Milliliter ESC-Medium in die Vertiefung und stellen Sie die Platte zurück in den 37 °C-Inkubator.Inkubieren Sie etwa 15 Minuten lang oder bis die Mehrheit der Futterzellen begonnen hat, anzuhängen; entfernen Sie vorsichtig das Medium, das die IPCs enthält, wobei Sie darauf achten, die wöchentlich anhaftenden Futterzellen nicht zu lösen. Geben Sie die IPCs in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter ESC-Medium enthält, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 G.Aspirieren Sie den Überstand und entfernen Sie den Rest des ESC-Mediums mit einer Mikropipette. Klopfen Sie das Röhrchen leicht an, um das Pellet zu lösen, und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 0,2 bis 0,5 Milliliter vorab gekühltem FHM-Medium. Lagern Sie die Zellen bis zur Injektion und während der Injektion auf Eis. Für die Injektion in tetraploide Blastozysten-Hilfszellen finden Sie den entsprechenden Protokollablauf in der vorliegenden Manuskriptbeilage sowie in einem zuvor veröffentlichten strove-Artikel, von dem hier ein Auszug auf dem Bildschirm angezeigt wird.Beispiele für die morphologische Progression von Fibroblasten zu iPSC-Kolonien im Verlauf eines Reprogrammierungsversuchs sind in diesen Bildern dargestellt. Ab vier bis fünf Tagen nach der Zugabe von Doxycyclin und VPA sollte eine morphologische Heterogenität und die Bildung teilweise reprogrammierter iPSC-Kolonien beobachtet werden, wie in den Abbildungen B bis EESC gezeigt. Ausgereifte iPSC-Kolonien sollten zwischen sieben und zehn Tagen erscheinen, wie in Abbildung F dargestellt. Die Herstellung von Einzelzell-Terato-Embryonen durch elektrofusionsgestützte Fusion von diploiden Zweizell-Embryonen ist äußerst effizient.Es ist üblich, dass bis zu 95 % der behandelten Zweizell-Embryonen erfolgreich zu tetraploiden Einzell-Embryonen fusionieren. Das in diesem Experiment verwendete Protokoll zur Injektion von iPSCs in tetraploide Blastozysten ähnelt dem Protokoll zur Injektion von ES-Zellen in diploide Blastozysten zur Erzeugung chimärer Mäuse. Um die Bildung diploider Chimären leicht auszuschließen, werden die Pigmentierungen der Mausstämme, die zur Erzeugung der iPSCs und tetraploiden Embryonen verwendet werden, nach Möglichkeit sorgfältig ausgewählt. In diesem Beispiel werden tetraploide Embryonen aus einem albino Stamm erzeugt und die iPSCs stammen von einem pigmentierten Stamm.Daher weisen neugeborene IPSC-Mäuse pigmentierte Augen und im Erwachsenenalter eine einheitliche pigmentierte Fellfarbe auf, während diploide Kyras eine Mischung aus albino- und pigmentierter Färbung zeigen würden. Die Anzahl der lebend geborenen Welpen hängt von der Zelllinie ab, wie in dieser Tabelle dargestellt. Für eine durchschnittlich gute IPSC-Linie sollten Experimentatoren erwarten, dass zwischen 1 % und 10 % der injizierten Blastozysten lebend geborene Welpen hervorbringen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vollständig pluripotente iPS-Zellen gewinnt und wie man ihr Entwicklungspotential überprüft. Mithilfe des Tetraploid-Komplementationsassays kann, einmal beherrscht, die Technik von der Ableitung der MES bis hin zu neugeborenen iPSC-Mäusen innerhalb von zwei bis drei Monaten abgeschlossen werden. Die Entwicklung und Pflege von iPSCs erfordert ein hohes Maß an Zellkulturtechnik.Frühere Erfahrungen mit der ESL-Kultur sind unerlässlich. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren, insbesondere mit konzentrierten Lentiviren, äußerst gefährlich sein kann. Man sollte stets die von Ihrer Institution vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung tragen und sicherstellen, dass alle Materialien, die mit dem Virus in Kontakt gekommen sind, mindestens 20 Minuten lang mit 10 % Bleichmittel behandelt werden, gemäß diesem Verfahren.Alle IPSC-Mäuse und ihre Gewebe können auf physiologische, pathologische und verhaltensbezogene Phänotypen untersucht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelheiten des Verfahrens zur Kryokonservierung humanen iPS-Zellen in KnockOut SR Kryokonservierungsmedium und Gewinnung dieser Zellen in völliger KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) mittel-oder Feeder-basierte KnockOut SR Medium.

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

In dieser Studie erzeugen wir induzierte pluripotente Stammzellen aus Fruchtwasserzellen der Maus unter Verwendung eines nicht-viralen Transposon-Systems.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.

Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin

Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung adulter Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Tetraploider Embryo-Komplementation. Dieses Protokoll validiert die volle Pluripotenz von iPSC-Linien für die Stammzellbiologie.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

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