Name: Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T23:37:26.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Lernen Sie die Transplantation von Pankreas-Inseln unter die Nierenkapsel bei diabetischen Mäusen. Diese Methode minimiert Stress für Zellen und Tiere und verbessert die Erfolgsrate bei Diabetes-Forschung.

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UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson &amp; Johnson Company.

Vorbereitung der Inseln für die Transplant (Tx) <ol><li> Unter einem inversen Mikroskop, hand-pick Inselchen mit einem P200 Pipetman und gerade Pipettenspitze aus den kultivierten Inseln in einem 100mm Platte. </li><li> Graf Inselchen 100 pro und Transfer in jede Mikrozentrifugenröhrchen (~ 500 Inseln / Rohr / Maus). </li><li> Lassen Inseln auf den Grund des Mikrozentrifugenröhrchen begleichen. </li><li> Zeichnen Sie eine kleine Insel Pellets in ein P200 Pipetman (eingestellt auf 130ul) mit einer geraden dünnwandigen Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie einen Silikonschlauch-Adapter über die Spitze der Spritze. Legen Sie eine Länge von PE50 Rohr in die Silikon-Adapter. </li><li> Hängen Sie die Pipetman auf die Seite der Motorhaube und Band der PE50 Schlauch an der Haube Wand höher als die Inseln in der Spitze. Damit können die kleinen Inseln, nur in der Spitze der Pipette zu begleichen. </li><li> Übertragen Sie die Inseln in den PE50 Rohr durch langsames Wahl der Pipetman und Bewegung der kleinen Inseln in der PE50 Rohre, darauf achten, daß die Inseln aus dem Ende zu vertreiben. </li><li> Machen Sie einen Knick in das abgeschrägte Ende des PE50 Schlauch. Unter Beibehaltung der Knick, trennen Sie das Silikon-Adapter Schlauch von der Pipetman und sichern Sie den Knick mit dem Silikon-Adapter. </li><li> Legen Sie die kleinen Inseln in der PE50 Schläuche, geknickt Silikon-Adapter Schlauch nach unten in ein konisches 15 ml mit einem Schnitt 5 mL Pipette und Band der PE50 Schlauch über die Seite der 5 ml Pipette zu verhindern, Eisstockschießen des PE50 Schlauch während Zentrifugieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die PE50/15mL konische zu 1000 Umdrehungen pro Minute, und schalten Sie Zentrifuge. (Never bereiten mehr als 10 Inselchen Vorbereitungen auf einmal). </li><li> Das Röhrchen auf Eis. </li></ol> Vorbereitung der Mouse for Transplant <ol><li> Anesthetize die Mäuse mit Isofluoran oder mit Ketamin / Xylexene (siehe Vorbereitung Protokoll). </li><li> Nach Betäubung entnommen beeinflussen, rasieren die linke Flanke der Maus. </li><li> Swab Haut von Mäusen, Center-out, mit Povidon Jod Tupfer und wischen Sie dann mit einem ETOH Tupfer. </li><li> Suchen Sie die linke Niere (knapp rechts von der Milz). Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut, Aussetzen des Bauchfells. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in das Bauchfell Freilegung der Niere. Keeping the Schnitt kleiner wird im Sinne der Niere erhöht und ausgesetzt zu helfen. </li><li> Tragen Sie einen leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, erhöhen oder Pop die Niere aus die Maus. </li><li> Halten Sie die Niere feucht durch die Anwendung physiologischer Kochsalzlösung mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen. </li><li> Mit einer Spritze 23 oder 25 Gauge-Nadel, einen kleinen Kratzer auf der rechten Flanke der Niere, die Schaffung eines nick in die Nierenkapsel; nicht zu tief oder zu groß. </li></ol> Transplantation von Inselzellen Hinweis: Während sich die Maus für Tx vorbereitet wird, die zweite Person sollte die Hamilton Schraub-Laufwerk Inseltransplantats Spritze vorzubereiten. <ol><li> Entfernen Sie langsam die Silikon-Adapter Schlauch vom PE50 Rohr unter Beibehaltung der Knick im Schlauch. </li><li> Platzieren Sie das andere Ende des PE50 Rohr in die Silikon-Adapter Schlauch und platzieren Sie den Silikon-Adapter Schlauch an der Pipettenspitze an der &quot;Schraube-drive&quot; Glas Hamilton-Spritze. Langsam loslassen Knick in der PE50 Rohre darauf achten, dass die Inseln nicht austreten. </li><li> Schieben Sie die Inseln langsam an die Spitze des PE50-Schlauch mit der &quot;Schraube&quot;-Mechanismus, aber halten Sie eine kleine Luftblase in der Vorderseite des kleinen Inseln in der PE50-Schlauch. </li><li> Into the nick gemacht in der Niere, vorsichtig die PE50 Rohre unter der Kapsel, so dass eine kleine Tasche. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht auf die Nieren-oder Punktion durch die Kapsel Beitel. </li><li> Es hilft, die Fläche und Kapsel feucht mit normaler Kochsalzlösung getränkt Gentamycin Wattestäbchen Wattestäbchen zu halten; einem trockenen Kapsel leicht reißen. </li><li> Bewegen Sie den Schlauch in alle Richtungen, wodurch ein &quot;Taschengeld&quot; für die transplantierten Inseln zur Ruhe. Denken Sie daran, zusätzliche physiologische Kochsalzlösung erneut, damit die Fläche feucht. </li><li> Unter der Leitung von der Person, die mit der Maus geöffnet hat und wer hat die PE50 Schlauch unter die Nierenkapsel platziert, die zweite Person, die die Maus und Hamilton Transplantation Spritze vorbereitet, wird langsam voran Inseln unter der Kapsel, in der &quot;Tasche&quot;, hinter einer kleinen Luftblase durch den PE50 Schläuche geliefert werden, bis alle Inseln verpflanzt. </li><li> Entfernen Sie langsam den PE50 Schläuche, trocknen Sie den Bereich mit einem trockenen Wattestäbchen und vorsichtig cauterize den nick mit geringer Wärmeentwicklung. </li><li> Mit einem trockenen Wattestäbchen Wattestäbchen, sicherzustellen, dass alle Blutung aufgehört hat. Sobald Blutung aufgehört hat, wieder befeuchten die Niere mit steriler Kochsalzlösung, und sanft ersetzen die Niere in die Bauchhöhle vor dem Schließen der Maus mit Naht und die Haut Heftklammern. </li></ol> Closing / Revival der Maus <ol><li> Schließen Sie das Bauchfell mit einer laufenden Stich mit 5-0 Seidenfäden w / a C-6 19mm Nadel. </li><li> Mit einer Pinzette ziehen beide Seiten der Hautschnitt zusammen. </li><li> Staple die Haut zusammen mit 2 oder 3 Klammern. </li><li> Reinigen Sie die Haut der Maus von Blut, mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen und Saline. </li><li> Unmittelbar behandeln die Maus mit einer subkutanen Injektion von Flunixin und Buprenorphin. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einen Käfig, der auf einem Heizkissen oder unter eine Wärmelampe gelegt wird, bis die Maus ist vollständig aktiv. </li><li> Entfernen Sie die Haut Heftklammern in 2 Wochen. </li></ol>

<ol><li>Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+to+induce+tolerance+through+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Inability to induce tolerance through direct antigen presentation.</a> Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+transplant+rejection+following+treatment+with+anti-B7-2+and+anti-B7-1+antibodies.+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation.</a> Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+xenogeneic+pancreatic+islet+grafts+induced+by+CTLA4lg%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg.</a> Science. 257, 789-792 (1992).</li>
</ol>

Dieses Protokoll bietet eine praktische und effiziente Möglichkeit für die sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel diabetischer oder normalen Mäusen. Die Technik der Konzentration und Pelletierung der Inseln oder Zellen in den letzten Förderschlauch (PE50) verwendet werden, um die Zellen unter die Nierenkapsel Transplantation bietet eine einfache und effektive Methode der Transplantation von Zellen bei gleichzeitiger Verringerung unnötigen Stress auf die Zellen oder die Maus.

<table><tbody><tr><td>Chirurgische Handschuhe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-95(sz)</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Desinfektionsschwämme</td><td>Moore Medical</td><td>42940AK</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Miltex Inc.</td><td>6-114 und 6-26</td><td>2 mit Zähnen, 2 gerade</td></tr><tr><td>Präzisionsschere n=2</td><td>Miltex Inc.</td><td>5-290</td><td></td></tr><tr><td>Oster-Rasierer (Größe 40 Klinge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-305-10B</td><td></td></tr><tr><td>4x4 sterile Mullkompressen</td><td>Moore Medical</td><td>08252AK</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Kompressen</td><td>Moore Medical</td><td>08486AK</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-819-2</td><td></td></tr><tr><td>Wärmekissen</td><td>Moore Medical</td><td>42508AK</td><td></td></tr><tr><td>23G- oder 25G-Nadeln</td><td></td><td></td><td>1&quot; lang</td></tr><tr><td>Cidex-Lösung</td><td>Moore Medical</td><td>07535AK</td><td>zur Reinigung/Desinfektion von Instrumenten</td></tr><tr><td>PE50-Polyäthylenschläuche</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td>PE50, 0,965 mm Außendurchmesser × 0,58 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Cidex + 28-Tage-Lösung</td><td>Moore Medical</td><td>35625AK</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>Spectrum Chromat.</td><td>123732</td><td>5/32&amp;#8221; Außendurchmesser × 1/32&amp;#8221; Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Instrumenten-Sterilisationsbehälter</td><td>Moore Medical</td><td>39074AK</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Pipettenspitzen</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0810</td><td>steril</td></tr><tr><td>Glasspritze mit Schneckenantrieb</td><td>Hamilton Co</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Kauterisiergerät</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS230</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Moore Medical</td><td>41-067</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Seide</td><td>LOOK Surgical</td><td>754B</td><td>für Naht (6-C)</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Moore Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-mm-Autoclip-Stapler</td><td>BD Biosciences</td><td>7630</td><td></td></tr><tr><td>9-mm-Heftklammern</td><td>BD Biosciences</td><td>7631</td><td></td></tr><tr><td>9-mm-Heftklammerentferner</td><td>BD Biosciences</td><td>7637</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation von pankreas-inseln in die niere capsule von diabetischen mäusen

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel diabetischer oder normalen Mäusen. Wir fanden, dass es leichter war, die kleinen Inseln oder Zellen in Pellets in den letzten Förderschlauch (PE50) verwendet werden, um die Zellen unter die Nierenkapsel Transplantation zu konzentrieren. Diese Technik bietet sowohl Geschwindigkeit und Leichtigkeit bei gleichzeitiger Verringerung unnötigen Stress auf die Zellen oder die Maus. Loading: Settled, hob die Hand, Inseln oder pelletierten Zellen werden sorgfältig aus dem Boden eines 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem p200 pipetteman und eine gerade, dünnwandige Pipettenspitze aufgenommen. Eine Länge von PE50 Schlauch wird die Pipettenspitze mit einem kleinen Silikon-Adapter Schlauch befestigt. Die Zellen sind absitzen, in die Spitze, und dann sind die PE50 Rohr durch langsames Wahl der pipetteman übertragen. Sobald die Zellen in der Nähe des Ende des PE50 Schläuche sind, ist ein Knick machte und die Silikon-Adapter Schlauch wird über den Knick gestellt. Der PE50 Schlauch wird in ein 15 ml konische mit einem Schnitt 5 ml Pipette übertragen, und die PE50 Schlauch wird über die Seite der 5 ml-Pipette mit Klebeband zu verhindern Eisstockschießen beim Zentrifugieren. Die Zellen sind erlaubt bis 1.000 Umdrehungen pro Minute erreichen und blieb stehen. Transplantation: Empfänger Mäuse betäubt, rasiert und gereinigt. Durch einen kleinen Schnitt an der linken Flanke der Maus gemacht und die Niere freigelegt. Die Niere, Fett und Gewebe feucht gehalten mit physiologischer Kochsalzlösung Tupfer. Das distale Ende des PE50 ist ein Hamilton Schneckenantrieb Spritze befestigt ist, mit einer Pipettenspitze, mit dem Silikon-Adapter Schlauch. Eine kleine nick ist auf der rechten Flanke Seite der Nieren gemacht, nicht zu groß noch zu tief. Die abgeschrägte Ende des PE50-Schlauch, am nächsten die Zellen, wird sorgfältig unter der Kapsel wird der Schlauch um sanft bewegt, um Platz zu machen, während swabbing physiologischer Kochsalzlösung; einem trockenen Kapsel kann leicht reißen. Eine kleine Luftblase unter der Kapsel durch langsames Wählen Sie die Spritze Schneckenantrieb geliefert. Inseln sind dann langsam hinter die Luftblase geliefert. Sobald die Inseln geliefert worden Nieren Homöostase erhalten bleibt und die knick ist bei niedriger Hitze verödet. Die Niere ist zurück in die Höhle gebracht und das Bauchfell und Haut werden vernäht und geheftet. Mäuse sind sofort mit Flunixin und Buprenorphin sq behandelt und in einem Käfig auf einem Heizkissen.

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Unser Protokoll wurde entwickelt, um Inselzellen oder Zellen sauber und einfach unter die Nierenkapsel von diabetischen oder gesunden Mäusen zu transplantieren. Wir haben festgestellt, dass es einfacher war ...

Hallo, mein Name ist Greg Zod. Ich arbeite am UCSF Diabetes Center im Bluestone Laboratory, und heute zeige ich Ihnen, wie man Inseln unter die Nierenkapsel von diabetischen Mäusen transplantiert. Dieses Verfahren beinhaltet die Gewinnung von Inseln, die aus entweder syngenenen oder allogenen Mausstämmen gereinigt wurden, ihre Aufreinigung und anschließende Transplantation unter die Nierenkapsel diabetischer Mäuse.Mäuse, die von Natur aus diabetisch sein können, wie die NOD-Mäuse, oder Mäuse, denen durch Injektion von Streptozotocin künstlich Diabetes induziert wurde. Nun sind wir bereit, die Inseln manuell auszuwählen. Ich werde die Inseln manuell auswählen und gleichzeitig zählen, während ich sie mit einer Pasteurpipette aufsaugte.Ich werde jegliches a in unserem Gewebe zurücklassen, und Sie können allein anhand der Art und Weise, wie das Licht im Gewebe gebrochen wird, erkennen, was eine Öse ist und was nicht. Anschließend zähle ich die Ösen. Ich werde sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben, und wir werden sie für die Transplantation sammeln.Die Augen weisen ein dichteres, fast rötliches Aussehen auf, und das A in R ist heller und flauschiger. Es hat außerdem ein weißliches Aussehen. Sie erhalten also etwas A-in-R-Gewebe, während Sie die Augen bearbeiten, aber solange Sie überwiegend Augen entnehmen, ist das in Ordnung.Sie können sehen, dass sich ein großes Stück a in R-Gewebe befindet. Und hier ist eine gut sichtbare Öse mit einer weiteren Öse darüber. Dazwischen befindet sich jedoch etwas Ace in r, sodass man die Dinge etwas verschieben und die einzelnen Ösen erfassen kann.Und wenn Sie bemerken, verwende ich eine nicht konische Pipettenspitze. Diese Spitze hat sehr dünne Wände und ist gerade. Dies ermöglicht ein leichteres Ein- und Ausführen der Ösen in bzw. aus der Spitze.Achten Sie darauf, nicht versehentlich einen Lymphknoten zu greifen. Dies sind exotische Lymphknoten, nämlich Pankreas-Lymphknoten, die verdaut und gereinigt werden. Ich versuche nur, die Ösen zu greifen, falls möglich, und lasse die Lymphknoten zurück.Nachdem ich die Ösen sorgfältig per Hand ausgewählt habe, befinden sich 500 freie Ösen am Boden dieses Mikrozentrifugenröhrchens. Nun werde ich diese Ösen in unser P150-Schlauchmaterial für die Transplantation überführen. Dazu nehme ich eine Pipettenspitze und saugte die Ösen langsam vom Boden des Röhrchens auf.Wenn die Ösen sich erst einmal in der Pipettenspitze befinden, nehme ich meinen Silikon-Schlauch, der an dem B 50-Schlauch befestigt ist, und lasse sie nun in der Spitze der Pipette absetzen, indem ich sie an der Seitenwand des Gehäuses befestige. Sobald sich die Pellets innerhalb der Pipettenspitze abgesetzt haben, entfernen wir die Pipette und schieben das Pellet langsam in den Schlauch hinein, indem wir am Drehregler der Pipette drehen, nicht am Kolben. Und während ich an der Pipette drehe, bewege ich den Schlauch.Sie lassen die Pellets in das P 50-Schlauchmaterial eintreten. Wenn sich die Pellets etwa einen Zoll vom Ende des Schlauchs entfernt hatten, knickte ich den Schlauch, um die Pellets darin festzuhalten. Ich entfernte das Silikonschlauchmaterial und übertrug es auf die Knicke.Dies wird dann mit einer abgeschnittenen 5-mill-Pipette in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Anschließend falte ich die Schläuche um und klebe sie an die 5-mill-Pipette. Nun ist es bereit für die Zentrifusion.Die Maus wurde rasiert und anästhesiert, und wir werden überprüfen, ob sie nicht auf eine Zehenquetschung reagiert. Ich werde die Maus mit Propyljod-Swabs säubern. Die Operation wird aseptisch durchgeführt, aber alle Spitzen meiner Instrumente sind steril.Etwas rechts neben der Milz an der linken Flanke der Maus werde ich einen kleinen Schnitt anlegen. Die Idee besteht nun darin, diesen Schnitt klein zu halten, damit er die Niere nach oben hält. Wenn Sie die Niere isolieren, schneiden Sie nun durch die Peritonealwand direkt über dieser Niere und machen einen kleinen Schnitt.Und mit einer Bewegung hebe ich die Haut nach links und schiebe nach oben, drücke nach unten auf die Niere und löse sie einfach so heraus. Ich halte die Niere feucht, mit etwas physiologischer Kochsalzlösung und Gentamycin, einem Antibiotikum. Mit einer 25-Gauge-Nadel werde ich eine kleine Einritzung in die Niere machen, an der Stelle, an der mein Schlauch platziert wird.Sie sollten die Niere nicht ausstechen, sondern nur einen kleinen Einschnitt machen. Sie werden eine dünne Blutlinie sehen. Dann wissen Sie, dass Sie in die Kapsel eingedrungen sind.Ich nehme mein P 50-Schlauchstück, das schräg abgeschnitten wurde, und setze es unter die Kante des Schnitts an, den ich gemacht habe, um den Schlauch langsam unter die Kapsel zu führen. Pavel hält die Niere während dieses Vorgangs feucht, da eine trockene Kapsel leicht reißen kann. Sobald sich das P 50-Schlauchstück unter der Kapsel befindet, wird Pavo das Pellet mit einer Hamilton-Spritze mit Schraubantrieb voranschieben.Sie können hier sehen, wie der Pellet langsam eingebracht wird. Die Abgabe der Ösen erfolgt gezielt über den Schraubantrieb. Sobald die Ösen platziert sind, nehme ich eine trockene Mullkompresse, tupfe die Stelle ab und verschließe mithilfe eines Kauterisierungseisens den Einschnitt und die Niere.Mit fünf Null Seide ergriff ich das Peritoneum und nähte es zu. Ich führte einen Dauernäht durch, um die Maus zu verschließen. Wir verschließen die Haut mit Hautklammern.Bevor ich die Maus aufwecke, verabreiche ich ihr eine subkutane Injektion mit bpro, Amin und Flu Nixon, entzündungshemmenden Mitteln und einem Schmerzmittel. Anschließend wird die Maus in ihren Käfig auf eine Heizplatte zurückgebracht. Soeben habe ich Ihnen gezeigt, wie man Augenlinsen unter die Nierenkapsel von Mäusen transplantiert.Dieses Modell eignet sich hervorragend, um Transplantationstoleranz oder Methoden zur Behandlung von Diabetes zu untersuchen. Insbesondere in unserem Labor nutzen wir dieses Modell, um die Auswirkungen von Tregs auf die Inselzelltransplantation oder die Induktion von Toleranz mittels verschiedener kostimulatorischer Blockademoleküle zu analysieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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