Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die funktionellen Zusammenhänge zwischen bakteriellen Genen und Stoffwechselwegen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array von ceia coli-Einzelmutantenstämmen hergestellt wird, die konjugiert oder gepaart werden sollen. Der zweite Schritt besteht darin, die Einzelmutanten in einem Array-Format auf Platten zu konjugieren.

Anschließend werden die Doppelmutanten ausgewählt. Der letzte Schritt besteht darin, die Platten mit Doppelmutanten abzubilden und die Kolonien der Doppelmutanten zu quantifizieren, um die Fitness der Stämme zu bestimmen. Letztendlich werden die Daten zur Koloniengröße analysiert, um genetische Interaktionsscores zu berechnen und funktionell miteinander interagierende Gene, Signalwege und Prozesse zu identifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der zufälligen Mutagenese besteht darin, dass zahlreiche individuelle Doppelmutanten-Stämme erzeugt werden können. Darüber hinaus können die Wechselwirkungen zwischen vielen Genen unabhängig von der Genlänge, Essentiellität oder der Fitness einzelner Genmutanten gleichzeitig untersucht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Systembiologie zu beantworten, beispielsweise solche bezüglich Genfunktionen und funktioneller Wechselwirkungen zwischen Signalwegen und biologischen Prozessen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie bakterieller Infektionen, da die Kenntnis der funktionell zentralen Gene und Prozesse sowie das Verständnis darüber, welche Kombinationen bakterieller Gene, Signalwege und Prozesse, wenn sie gestört werden, die bakterielle Fitness verbessern oder verringern, dabei helfen wird, die effektivsten Interventionsstrategien zu entwickeln. Um dieses Protokoll zu beginnen, wird eine zweistufige, geschachtelte PCR-Amplifikation eingesetzt, um den Ziel-Open-Reading-Frame durch ein Chloramphenicol-Resistenz-Marker aus dem PKD3-Plasmid zu ersetzen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben.

Bestätigen Sie das erwartete Produkt und reinigen Sie das erhaltene Fragment mittels PCR gemäß der Herstelleranleitung. Nach dem Eluieren des PCR-Produkts in 30 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser verdünnen Sie es auf eine Konzentration von etwa 50 Milligramm pro Mikroliter. Das gereinigte Produkt wird vor der Transformation bei minus 20 Grad Celsius gelagert.

Bereiten Sie anschließend die kompetenten Zellen mit hoher Rekombinationsfrequenz oder HFR Caval für die Donorkonstruktion vor. Inokulieren Sie zunächst ein Milliliter einer gesättigten Übernachtkultur des HFR-Cavalli-Stamms in 70 Milliliter frisches LB-Medium mit 35 Mikrolitern einer 50 Milligramm pro Milliliter Ampicillin-Lösung in einem 250-Milliliter-Kolben.

Inkubieren Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius unter leichtem Schütteln bei 220 U/min, bis eine optische Dichte von etwa 0,5 bis 0,6 erreicht ist. Überführen Sie die Kultur anschließend für 15 Minuten in ein Wasserbad zur Wärmeinduktion des Lambda-Red-Rekombinationssystems bei 42 Grad Celsius mit Schütteln bei 160 U/min, um die Induktion zu beenden. Überführen Sie die Kultur dann für 10 bis 20 Minuten in ein gekühltes Eis-Wasser-Gemisch bei 160 U/min.

Stellen Sie sicher, dass die Zellen bis nach der Transformation kalt gehalten werden. Nach dem Waschen und Sammeln der Zellen durch Zentrifugation gemäß dem schriftlichen Protokoll, gießen Sie das Überstandmedium ab und resuspendieren das Pellet in 500 Mikrolitern eiskaltem, 10 % Glycerol enthaltendem Eloqua. Verteilen Sie die Zellen in 50-Mikroliter-Mengen auf einzelne vorab gekühlte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und führen Sie unverzüglich die Transformation durch.

Fügen Sie 100 Nanogramm des gereinigten Gendeletionskassetten zu den kompetenten Zellen hinzu. Schlagen Sie leicht auf das Röhrchen und lassen Sie die Suspension fünf Minuten auf Eis stehen. Überführen Sie anschließend die Suspension in eine vorab gekühlte Elektroporationskuvette und führen Sie unverzüglich die Elektroporation des Zellgemischs durch.

Geben Sie ein Milliliter SOC-Medium mit Raumtemperatur hinzu und überführen Sie die elektroporierten Zellen in Medium in ein 15-Milliliter-Kulturgefäß. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 32 Grad Celsius mit rotationsschütteln bei 220 U/min. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Zellen mit 4.400 × g fünf Minuten lang.

Entfernen Sie bei Raumtemperatur etwa 850 Mikroliter des Überstandes und resuspendieren Sie das Zellpellet in der verbleibenden Flüssigkeit. Verteilen Sie die Zellen auf LB-Platten, die 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthalten, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 32 Grad Celsius. Am folgenden Tag streichen Sie zwei einzelne Transformanten auf LB-Chloramphenicol-Platten zur Mutantenbestätigung ab und streichen dieselben Transformanten auf LB-Camycin-Platten ab, um zu bestätigen, dass die Stämme nicht Camycin-resistent sind.

Anschließend wird die DNA mit drei verschiedenen Sätzen von Knockout-Bestätigungsprimern wie im schriftlichen Protokoll beschrieben amplifiziert. Der erste Primer-Satz besteht aus einem 20 Nukleotide langen flankierenden Vorwärtsprimer, der 200 Basenpaare upstream des Zielbereichs liegt, und einem Rückwärtsprimer, der komplementär zur Chloramphenicol-Resistenzkassette ist. Diese Amplifikation sollte ein 445 Nukleotide langes Amplikon ergeben.

Der zweite Satz umfasst einen Vorwärtsprimer, der an die Sequenz der Chloramphenicol-Resistenzkassette annealt, und einen rückwärts gerichteten flankierenden Bestätigungsprimer, der so konzipiert ist, dass er 200 Basenpaare stromabwärts des 3'-Endes des gelöschten Gens bindet. Diese Amplifikationsreaktion sollte ein 309 Nukleotide langes Amplikon erzeugen. Die dritte PCR enthält sowohl den upstream als auch den downstream flankierenden Primer.

Diese Reaktion ist erforderlich, um zu bestätigen, dass der ausgewählte Stamm kein mütterlicher Diploid ist, bei dem ein Genlocus durch die Kassette ersetzt wurde und ein weiterer duplizierter, ansonsten aber wildtypischer Gencopy noch vorhanden ist. Bei dieser Amplifikation wird ein 1,4 KB großes Produkt erwartet. Die e coli ke io Sammlung von Einzel-Gen-Deletionsmutanten in nicht-essentiellen Genen wird robotisch als Replikat auf 24 384 übertragen.

Nun, Mikroplatte, die pro Vertiefung 80 Mikroliter flüssiges LB-Medium enthält. Ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin, um Platz für den Grenzkontrollstamm zu schaffen, der als positiver Kontrollstamm dient und bei der Platten-Normalisierung sowie bei der automatisierten Kolonienquantifizierung hilft. Entfernen Sie das inoculierte Medium aus den äußersten Vertiefungen jeder Platte und übertragen Sie es auf neue Platten, sodass die äußersten Vertiefungen leer bleiben.

Erstellen Sie auf ähnliche Weise Negativkontrollpunkte, indem Sie jeweils zwei Stämme von einer anderen Position innerhalb jeder Platte entfernen und diese Stämme auf eine neue Platte übertragen. Füllen Sie anschließend die leeren Vertiefungen, einschließlich der Randkontrollvertiefungen und der Negativkontrollvertiefungen, mit LV-Medium, das 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthält. Diese Negativkontrollpunkte sollten im Rezipienten und damit in den Doppelmutantenplatten leer sein.

Sie dienen dazu sicherzustellen, dass beim Nummerieren der Abbildungen oder beim Bestücken der Platten keine Bearbeitungs- oder Handhabungsfehler aufgetreten sind. Nach der Herstellung des Rand-positiven Stammes gemäß der schriftlichen Anleitung werden die Array-Stämme sowie der Rand-positiv-Stamm über Nacht bei 32 Grad Celsius mit 190 U/min orbitaler Schüttelbewegung inkubiert; am folgenden Tag füllen Sie die Randgefäße mit etwa 80 Mikrolitern der Übernachtkultur. Die zusammengestellten Platten können wie im nächsten Abschnitt beschrieben für die Paarung verwendet werden.

Alternativ wird für die Langzeitlagerung jedes Loch in den Empfängerplatten mit 15 % Glycerin versetzt und das Medium mit dem Glycerin vermischt. Die Platten werden anschließend bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Beginnen Sie das Kopplungsverfahren, indem Sie den HFR-Spenderstamm, der die abgefragte Genlöschung trägt, die mit einem Chloramphenicol-Resistenzkassette markiert ist, über Nacht bei 32 Grad Celsius in reichem flüssigem LB-Medium mit 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol-Pin kultivieren.

Die TH-bestellte Empfänger-Mutanten-Sammlung in 3 84-Koloniedichte auf feste LB-Platten. Ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin. Parallel dazu den Donor-Frage-Mutantenstamm in 3 84-Koloniedichte auf die gleiche Anzahl LB-Platten übertragen.

Angereichert mit 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 32 Grad Celsius, um die Stämme zu konjugieren. Übertragen Sie den Donor von den drei 84-Kolonien-Übernacht-Donorplatten mittels Pin auf feste LB-Platten.

Dann pieksen Sie die Stämme von einer einzelnen 384-Kolonien-Übernachtkulturplatte als Rezipienten über die frisch gepieksten Donoren. Inkubieren Sie die gepieksten Konjugationsplatten bei 32 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Danach pieksen Sie jede Konjugationsplatte im 384-Dichte-Format auf eine einzelne feste LB-Platte, die Chloramphenicol enthält.

Kann Mycin diesen Prozess so oft wiederholen, bis alle Konjugationsplatten beimpft wurden? Inkubieren Sie die frisch beimpften Platten der ersten Selektion 16 bis 36 Stunden bei 32 Grad Celsius. Nach der Inkubation übertragen Sie jede Kolonie von der ersten Selektionsplatte mittels erneutem Beimpfen auf eine zweite Doppelantibiotikaselektionsplatte im 1536-SPOT-Format, sodass jede Kolonie der ersten Selektion durch vier Kolonien repräsentiert wird.

Auf der zweiten Selektionsplatte inkubieren Sie die Platten 16 bis 36 Stunden. Bei 32 Grad fotografieren Sie die endgültigen Doppelmutanten-Selektionsplatten, um die Wachstumsfitness der Mutanten quantitativ zu messen und die Wechselwirkungen zwischen Genpaaren zu analysieren. Da Gene desselben Signalwegs eng korrelierte GI-Muster aufweisen, können funktionell verwandte Gene durch Gruppierung entsprechend der Gesamtähnlichkeit ihrer S-Score-Profile zusammengefasst werden.

Die Ähnlichkeit des GI-Profils stellt die Kongruenz der Phänotypen bei Mutation zweier Gene dar und sollte darauf hinweisen, ob die beiden Gene in demselben oder überlappenden Signalweg wirken. Dargestellt ist hier die Verteilung der Korrelationskoeffizienten zwischen den GI-Profilen von Genpaaren, die physisch wechselwirkende Proteine kodieren, im Vergleich zu zufällig ausgewählten Genpaaren. Ein Beispiel eines Streudiagramms korrelierter genetischer Profile für zwei Transporter, die einen heterotrimeren Komplex bilden, der für die Spermienausscheidung erforderlich ist, wird gezeigt, ebenso wie ein Hefe-Ecolin-Gen.

Erleichternde Wechselwirkungen mit stark korrelierten GI-Profilen neigen dazu, Stoffwechselwege zu kodieren, die physisch assoziiert sind oder kohärent in einem gemeinsamen biochemischen Weg zusammenwirken. Hier wird ein repräsentatives Beispiel gezeigt, bei dem die Komponenten der funktionell redundanten ISC- und SUF-Eisenschwefel-Biosynthese-Wege, die gemeinsam an einem essentiellen Prozess beteiligt sind, separate Cluster bilden, die durch umfangreiche verschärfende Wechselwirkungen miteinander verbunden sind. Ein statistisches Maß kann verwendet werden, um eine signifikante Anreicherung von Wechselwirkungen zwischen bestimmten Kombinationen von Wegen zu identifizieren, sowie zur Integration von GI-Netzwerken mit physikalischen Wechselwirkungen und anderen funktionellen Assoziationsdaten, wie zum Beispiel genomischem Kontext.

Beziehungen können die Organisation höherer funktioneller Module offenbaren, die zentrale biologische Systeme bei Bakterien definieren. Die Clusteranalyse kann ebenfalls auf GI-Netzwerke angewendet werden, um die Funktionen annotierter Gene vorherzusagen. Da sich Clustering-Algorithmen unterscheiden.

Jedoch erfordern putative funktionelle Zuordnungen, die durch Klassifizierung ermittelt wurden, eine unabhängige experimentelle Verifizierung. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, stets alle notwendigen positiven und negativen Kontrollen einzuschließen. Andere Methoden wie Proteomik, biochemische Nachfolgeexperimente und chemische Genomik können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich spezifischer Genfunktionen sowie der Art funktioneller Beziehungen zwischen Genen und Signalwegen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie doppelte Mutantenstämme konstruiert, Rezeptorarrays zusammengestellt und ESGA-Screens durchgeführt werden, um die funktionellen Beziehungen zwischen Genen und Prozessen in e coli zu untersuchen.