Name: Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in Escherichia Coli Verwendung von Synthetic Genetic Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Erfahren Sie die eSGA-Technologie zur Kartierung funktionaler genetischer Netzwerke in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die systematische Analyse epistatischer Interaktionen zwischen bakteriellen Genen und Pathways.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Genome Kanada, Ontario Genomics Institute und der Canadian Institutes of Health Research gewährt JG und AE AG unterstützt wird, ist ein Empfänger von Vanier Canada Graduate Scholarship.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine stufenweise Protokoll für die Verwendung robotischen ESGA Screening, um bakterielles Gen Funktionen auf einen Stoffwechselweg Ebene durch Abfragen GI untersuchen skizziert. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um einzelne Gene als auch ganzer biologischer Systeme in E. studieren coli. Sorgfältig Ausführung der experimentellen oben beschriebenen Schritte, einschließlich aller geeigneten Kontrollen und konsequent analysieren und unabhängig validiert die GI-Daten sind wesentliche Aspekte fü...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;I. Antibiotika&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Bioshop</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;2. Luria-Bertani-Medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LB-Pulver</td><td>Bioshop</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;3. Bakterielle Stämme und Plasmide&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hfr-Cavalli-Stamm &amp;#955;&lt;sub&gt;rot&lt;/sub&gt; System (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Genetisches Bestandzentrum, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; F- Empfängersammlung</td><td>Nationales Bioressourcenprojekt (NBRP) von Japan&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypomorph &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;F-SPA-Tag-Stämme</td><td>Offene Biosysteme; Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;4. Primer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pKD3-basierte entsalzte konstante Primer</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>entsalzte kundenspezifische Primer</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>entsalzte kundenspezifische Primer</td><td></td><td></td><td>F2 und R2: 20 nt konstante Bereiche basierend auf der pKD3-Sequenz und 45 nt individuelle Homologiebereiche&lt;br/&gt; F2-Konstante Region:&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; R2-Konstantbereich:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 und S2: 27 nt lange konstante Bereiche zur Anlagerung für die Amplifikation der SPA-Cm-Kassette und 45 nt lange benutzerdefinierte Homologiebereiche&lt;br/&gt; S1-Konstante Region:&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG-3'&#039;&lt;br/&gt; S2-Konstante Region:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F und KOCO-C: 20-nt-Primer, die 200 bp entfernt von der Stelle der Deletion eines nicht essentiellen Gens oder des essentiellen Gens liegen&lt;br/&gt; Einfügestelle für das Gen-SPA-Tag</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;5. PCR- und Elektrophorese-Reagenzien&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq-DNA-Polymerase</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10X PCR-Puffer</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ladefarbstoff</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE-Puffer</td><td>Bioshop</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Bioshop</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Größenstandard</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;6. DNA-Isolations- und Reinigungs-Kits&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit zur Isolierung und Reinigung von genomischer DNA</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Midi-Kit</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Purifikationskit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;7. Ausrüstung für PCR, Transformation und Replica-Pinning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose-Gelelektrophorese</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette, 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C-Wasserbad-Schüttler</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C-Schüttler</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C-Platten-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDA-Benchtop-Roboter</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96, 384 und 1.536 Pin-Dichte-Pads</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oder 384 lange Stifte</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;8. Bildgebende Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kamerastativ</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera, 10 Megapixel</td><td>Ein beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtboxen, Testrite 16&quot; x 24&quot; Einheiten</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;9. Wiederverwendung von Pads oder Platten &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10 % Bleichmittel</td><td>Ein beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td>Ein beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriles destilliertes Wasser</td><td>Ein beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzhaube</td><td>Ein beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;stark&gt;10. Laborbedarf&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50-ml-Polypropylenröhrchen</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250-ml-Konischkolben</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-sterile Kulturröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige Platten</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well- und 384-Well-Mikrotiterplatten</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Plattenroller zum Versiegeln von Mehrfachbrunnen</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>Platten</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Klebende Plattenverschlüsse</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C-Gefrierschrank</td><td>Ein beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping bakterielle functional netzwerke und pathways in<em&gt; escherichia coli</em&gt; verwendung von synthetic genetic arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phänotypen durch eine komplexe Reihe von physikalischen (zB Protein-Protein) und funktionelle (zB Gen-Gen oder genetisches) Wechselwirkungen (GI) 1 bestimmt. Während körperliche Interaktionen können angeben, welche bakterielle Proteine ​​als Komplexe verbunden sind, müssen sie nicht unbedingt enthüllen Weg-level funktionalen Beziehungen1. GI Bildschirmen, in denen das Wachstum der Doppelmutanten, die zwei gelöschte oder inaktivierte Gene gemessen und verglichen mit den entsprechenden einzelnen Mutanten, beleuchten kann epistatischen Abhängigkeiten zwischen Loci und somit ein Mittel zum Abfragen und entdecken neuartigen funktionalen Beziehungen 2. Large-scale GI Karten für eukaryotische Organismen wie Hefe 3-7 berichtet worden, aber GI Informationen bleiben spärlich für Prokaryoten 8, die die funktionellen Annotation von bakteriellen Genome behindert. Zu diesem Zweck haben wir und andere Hochdurchsatz-quantitative bakteriellen GI Screeningverfahren 9, 10 entwickelten </sup&gt;. Hier präsentieren wir die wichtigsten Schritte erforderlich, um quantitative E. durchführen coli Genetic Synthetische Array (ESGA) Screening-Verfahren auf einem genomweite 9, mit natürlichen bakteriellen Konjugation und homologe Rekombination, um systemisch zu erzeugen und zu messen, das die Eignung einer großen Anzahl von Doppel-Mutanten in einer Kolonie Anordnungsformat. Kurz gesagt, wird ein Roboter verwendet, um zu übertragen durch Konjugation, Chloramphenicol (Cm) - F-markierten Rezipientenstämme - Mutante Allele aus engineered Hfr (High Häufigkeit der Rekombination) &#39;Donorstämme&#39; in eine geordnete Anordnung von Kanamycin (Kan) markiert. Normalerweise verwenden wir loss-of-function einzelnen Mutanten tragen nicht wesentlicher Deletionen (zB die &quot;Keio&quot; Sammlung 11) und essentielles Gen hypomorphen Mutationen (dh Allele verleihen reduzierte Protein Expression, die Stabilität oder Aktivität 9, 12, 13) fragen die funktionalen Zusammenhänge der nicht-essentielle und essentielle Gene, resziehungsweise. Nach Konjugation und anschließenden genetischen Austausch durch homologe Rekombination vermittelten werden die resultierenden Doppelmutanten auf festem Medium, das sowohl Antibiotika ausgewählt ist. Nach Auswachsen werden die Platten digital bebildert und Koloniegrößen quantitativ erzielt unter Verwendung einer in-house automatisierten Bildverarbeitungssystem 14. GIs enthüllt werden, wenn die Wachstumsrate einer Doppelmutante entweder signifikant besser oder schlechter als erwarteten 9 ist. Erschwerende (oder negative) GIs oft zwischen loss-of-function Mutationen in Paaren von Genen aus kompensatorischen Wege, die auf der gleichen grundlegenden Prozess 2 auftrifft führen. Hier wird der Verlust eines einzelnen Gens gepuffert, so dass entweder einzelne Mutante lebensfähig ist. Allerdings ist der Verlust der beiden Signalwege schädlichen und resultiert in synthetischen Letalität oder Krankheit (dh langsame Wachstum). Umgekehrt kann Linderung (oder positiven) Wechselwirkungen zwischen Genen in der gleichen Weg oder Proteinkomplexes 2 als der auftretenDeletion von entweder Gen allein oft ausreicht, um die normale Funktion des Weges oder komplexer, so dass zusätzliche Störungen nicht verringern Aktivität und damit Wachstum, weiter stören. Insgesamt lassen sich systematisch identifiziert und analysiert GI-Netzwerke bieten unvoreingenommene, globale Karten der funktionalen Zusammenhänge zwischen einer großen Anzahl von Genen, von denen Signalweg-Level-Informationen durch andere Ansätze verpasst 9 entnommen werden kann.

GIs zeigen funktionelle Beziehungen zwischen Genen auf. Ebenso können funktionell verwandte Gene durch das Gruppieren ihrer GI-Profile in Signalwege eingeteilt werden, da Gene desselben Weges ähnliche GI-Muster aufweisen und die Ähnlichkeit der GI-Profile die Kongruenz der Phänotypen widerspiegelt. Die Integration von GI- und GI-Korrelationsnetzwerken mit physikalischen Interaktionsdaten oder anderen Assoziationsdaten, wie genomischen Kontextbeziehungen (GC), kann ebenfalls die Organisation höherer funktionaler Module au...

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den entwickelten<em&gt; Escherichia coli</em&gt;.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phänotypen werden durch eine komplexe Reihe physischer (z. B. Protein-Protein-) und funktioneller (z. B. Gen-Gen- oder genetischer) Interaktionen (GI) bestimmt1. Während ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die funktionellen Zusammenhänge zwischen bakteriellen Genen und Stoffwechselwegen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array von ceia coli-Einzelmutantenstämmen hergestellt wird, die konjugiert oder gepaart werden sollen. Der zweite Schritt besteht darin, die Einzelmutanten in einem Array-Format auf Platten zu konjugieren.Anschließend werden die Doppelmutanten ausgewählt. Der letzte Schritt besteht darin, die Platten mit Doppelmutanten abzubilden und die Kolonien der Doppelmutanten zu quantifizieren, um die Fitness der Stämme zu bestimmen. Letztendlich werden die Daten zur Koloniengröße analysiert, um genetische Interaktionsscores zu berechnen und funktionell miteinander interagierende Gene, Signalwege und Prozesse zu identifizieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der zufälligen Mutagenese besteht darin, dass zahlreiche individuelle Doppelmutanten-Stämme erzeugt werden können. Darüber hinaus können die Wechselwirkungen zwischen vielen Genen unabhängig von der Genlänge, Essentiellität oder der Fitness einzelner Genmutanten gleichzeitig untersucht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Das Design eines synthetischen Operon kodiert sowohl den sekretorischen Apparat und den strukturellen Monomere Curli Fasern beschrieben. Überproduktion dieser Amyloide und Anhänger Polymere ermöglicht einen messbaren Gewinn der Einhaltung...

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Hier präsentieren wir phänomische Ansätze zur funktionellen Charakterisierung von mutmaßlichen Phagengenen. Zu den Techniken gehören ein entwickelter Assay, der in der Lage ist, den anabolen Metabolismus des Wirts zu überwachen, die Multi-Phenotype Assay Plates (MAPs), zusätzlich zu der etablierten Methode der Metabolomik, die in der Lage ist, Auswirkungen auf den katabolen Metabolismus zu messen.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Dieser Beitrag stellt eine Reihe von Protokollen für die gentechnisch veränderten Zellen entwickeln und funktionalisierte Oberflächen , die synthetisch konstruierte E. coli steuern können , und programmierbare Materialoberflächen zu manipulieren.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Erfahren Sie die eSGA-Technologie zur Kartierung funktionaler genetischer Netzwerke in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die systematische Analyse epistatischer Interaktionen zwischen bakteriellen Genen und Pathways.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in

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