Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in Escherichia Coli Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Ziel dieses Verfahrens ist es, die funktionellen Zusammenhänge zwischen bakteriellen Genen und Signalwegen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array von Ceia coli vorbereitet wird, einzelnen mutierten Stämmen, die konjugiert oder gepaart werden. Der zweite Schritt besteht darin, die einzelnen Mutanten in einem Array-Format auf Platten zu konjugieren.

Als nächstes werden die Doppelmutanten ausgewählt. Der letzte Schritt besteht darin, die Doppelmutantenplatten abzubilden und die Doppelmutantenkolonien zu quantisieren, um die Fitness des Stammes zu bestimmen. Letztendlich werden die Daten zur Koloniegröße analysiert, um genetische Interaktionswerte zu berechnen und funktionell interagierende Gene, Signalwege und Prozesse zu identifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zufallsmutagenese besteht darin, dass viele einzelne Doppelmutantenstämme erzeugt werden können. Darüber hinaus können die Wechselwirkungen zwischen vielen Genen gleichzeitig beurteilt werden, unabhängig von der Gengröße, der Wesentlichkeit oder der Fitness der Einzelgenmutante. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Systembiologie zu beantworten, z. B. in Bezug auf Genfunktionen und funktionelle Wechselwirkungen zwischen Signalwegen und Prozessen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie bakterieller Infektionen, da das Wissen über die funktionell zentralsten Gene und Prozesse sowie das Verständnis, welche Kombinationen von bakteriellen Genen, Signalwegen und Prozessen bei Störungen die bakterielle Fitness verbessern oder verringern, dazu beitragen werden, die effektivsten Interventionsstrategien zu entwickeln, um dieses Protokoll zu beginnen. Zweistufig verschachtelt. Die PCR-Amplifikation wird eingesetzt, um den offenen Zielleserahmen durch einen Chloramphenicol-Resistenzmarker aus dem PKD-3-Plasmid zu ersetzen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben.

Bestätigen Sie das erwartete Produkt und reinigen Sie das erhaltene Fragment gemäß dem Protokoll des Herstellers durch PCR. Nach der Eluierung des PCR-Produkts in 30 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser auf eine Konzentration von etwa 50 Milligramm pro Mikroliter verdünnen. Das gereinigte Produkt wird vor der Umwandlung bei minus 20 Grad Celsius gelagert.

Bereiten Sie als Nächstes die hochfrequenten Rekombinations- oder HFR-Caval-kompetenten Zellen für die Spenderkonstruktion vor. Zuerst wird ein Milliliter einer gesättigten Übernachtkultur des HFR Cavalli-Stammes in 70 Milliliter frisches LB-Medium mit 35 Mikrolitern à 50 Milligramm pro Milliliter inokuliert. Ampicillin in einem 250-Milliliter-Kolben.

Die Kultur wird bei 32 Grad Celsius durch leichtes Schütteln bei 220 U/min inkubiert, bis eine optische Dichte von etwa 0,5 bis 0,6 erreicht ist. Dann überführen Sie die Kultur in ein Wasserbad zur Hitzeinduktion des Lambda-Rot-Rekombinationssystems bei 42 Grad Celsius für 15 Minuten mit Schütteln bei 160 U/min, um die Induktion zu stoppen. Übertragen Sie die Kultur für 10 bis 20 Minuten bei 160 U/min in ein gekühltes Eisbrei-Wasserbad.

Achten Sie darauf, die Zellen bis nach der Umwandlung kalt zu halten. Nach dem Waschen und Ernten der Zellen durch Zentrifugation, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, dekantieren Sie die Senna und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern eiskaltem, 10%igem Glycerin Eloqua. Die Zellen werden in einem Volumen von 50 Mikrolitern in einzelne vorgekühlte 1,5-Milliliter-Mikrozentri-Röhrchen gefüllt und sofort mit der Umwandlung fortgeführt.

Geben Sie 100 Nanogramm gereinigte Gendeletionskassette zu den zuständigen Zellen. Schnippen Sie den Schlauch und lassen Sie die Suspension fünf Minuten lang auf Eis liegen. Übertragen Sie dann die Suspension in eine vorgekühlte Elektroporation und betreiben Sie das Zellgemisch sofort.

Fügen Sie einen Milliliter SOC-Medium bei Raumtemperatur hinzu und überführen Sie die elektroporierten Zellen im Medium in ein 15-Milliliter-Kulturröhrchen. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 32 Grad Celsius mit orbitalem Schütteln bei 220 U/min. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen mit 4.400 G für fünf Minuten.

Bei Raumtemperatur werden ca. 850 Mikroliter des Supinats entfernt und das Zellpellet in der restlichen Flüssigkeit wieder suspendiert. Verteilen Sie die Zellen auf LB-Platten mit 17 Mikrogramm pro Milliliter, Chloramphenicol und inkubieren Sie sie über Nacht bei 32 Grad Celsius. Am nächsten Tag streichen Sie zwei einzelne Transformanten auf LB-Chloramphenicol-Platten zur Mutantenbestätigung aus, streichen Sie die gleichen Transformanten auf LB-Dosen-Mycin-Platten aus, um zu bestätigen, dass die Stämme nicht can-mycin-resistent sind.

Als nächstes wird die DNA mit drei verschiedenen Sätzen von Knockout-Bestätigungsprimern amplifiziert, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Das erste Primer-Set besteht aus einem 20-Nukleotid-flankierenden Forward-Primer, der sich 200 Basenpaare stromaufwärts der Zielregion befindet, und einem Reverse-Primer, der komplementär zur Chloramphenicol-Resistenzkassette ist. Es wird erwartet, dass diese Amplifikation ein Amplikon mit 445 Nukleotiden erzeugt.

Der zweite Satz umfasst einen Vorwärtsprimer, einen Knien zur Chloramphenicol-Resistenzkassettensequenz und einen umgekehrt flankierenden Bestätigungsprimer, der für eine Achse von 200 Basenpaaren stromabwärts der drei Primzahlen des deletierten Gens ausgelegt ist. Es wird erwartet, dass diese Amplifikationsreaktion ein 309-Nukleotid-Amplikon erzeugt. Die dritte PCR enthält sowohl vor- als auch nachgeschaltete flankierende Primer.

Diese Reaktion ist erforderlich, um zu bestätigen, dass es sich bei dem ausgewählten Stamm nicht um einen knochenmarkdiploiden Stamm handelt, bei dem ein Genort durch die Kassette ersetzt wurde und ein anderer dupliziert wurde, ansonsten aber noch eine Wildtyp-Genkopie vorhanden ist. Es wird erwartet, dass diese Amplifikation ein 1,4 KB großes Produkt erzeugt. Die e coli ke io einzelne nicht-essentielle Gendeletions-Mutantensammlung ist repliziert pind robotisch zu 24 384.

Nun, Mikrotiterplatte mit 80 Mikrolitern flüssigem LB-Medium pro Vertiefung. Ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter kann Mycin Platz für den Grenzkontrollstamm geschaffen werden, der als Positivkontrolle fehlte und sowohl bei der Plattennormalisierung als auch bei der automatisierten Koloniequantisierung half. Entfernen Sie das inokulierte Medium aus den äußersten Vertiefungen jeder Platte und geben Sie es auf neue Platten, wobei Sie die äußersten Vertiefungen leer lassen.

Schaffen Sie ebenfalls negative Kontrollpunkte, indem Sie zwei beliebige Stämme von einer anderen Stelle innerhalb jeder Platte entfernen und die Stämme auf eine neue Platte übertragen. Als nächstes werden die leeren Vertiefungen, einschließlich der Grenzkontrollvertiefungen und der negativen Kontrollvertiefungen, mit LV-Medien gefüllt, die 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthalten. Es wird erwartet, dass diese negativen Kontrollpunkte im Empfänger leer sind und daher Doppelmutantenplatten sind.

Sie dienen dazu, sicherzustellen, dass es bei der Nummerierung, der Abbildung oder dem Anheften der Platten zu keinen Verarbeitungs- oder Plattenhandhabungsfehlern kam. Nach der Herstellung des Grenzpositivstammes, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, werden die Array-Stämme sowie der Grenzpositivstamm über Nacht bei 32 Grad Celsius mit 190 U/min Orbitalschütteln am Folgetag gezüchtet und die Grenzvertiefungen mit ca. 80 Mikrolitern der Nachtkultur gefüllt. Die zusammengebauten Platten können zum Zusammenstecken verwendet werden, wie im nächsten Abschnitt beschrieben.

Alternativ wird für die Langzeitlagerung jede Vertiefung in den Empfängerplatten mit 15 % Glycerin ergänzt und das Medium und das Glycerin werden gemischt. Anschließend werden die Platten bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Beginnen Sie den Paarungsvorgang, indem Sie den HFR-Donorstamm mit der Abfrage Gendeletion markiert mit Chloramphenicol-Resistenzkassette über Nacht bei 32 Grad Celsius in einem reichhaltigen LB-Flüssigmedium mit 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol-Pin züchten.

Die TH ordnete die Entnahme von Empfängermutanten in 3 84 Kolonien Dichte auf festen LB-Platten an. Ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Dose Mycin. Parallel dazu wird der Mutantenstamm der Donorabfrage in 3 84 Kolonien auf die gleiche Anzahl von LB-Platten gepinnt.

Ergänzt mit 17 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 32 Grad Celsius, um die Stämme zu konjugieren. Stecken Sie den Spender aus den 3 84 Kolonie-Spenderplatten über Nacht auf feste LB-Platten.

Stecken Sie dann die Stämme von einer einzigen 3 84 Kolonie-Empfängerplatte über Nacht über die frisch angehefteten Spender. Inkubieren Sie die gepinnten Konjugationsplatten bei 32 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Als nächstes stecken Sie jede Konjugationsplatte mit einer Dichte von 384 auf eine einzelne feste LB-Platte, die Chloramphenicol enthält.

Und kann Mycin diesen Vorgang so lange wiederholen, bis alle Konjugationsplatten fixiert sind? Inkubieren Sie die frisch gepinnten ersten Auswahlplatten für 16 bis 36 Stunden bei 32 Grad Celsius. Nach der Inkubation heften Sie jede erste Selektionsplatte wieder auf eine zweite doppelte Arzneimittelauswahlplatte im 1536 SPOT-Format, so dass jede erste Selektionskolonie durch vier Kolonien repräsentiert wird.

Auf der zweiten Auswahlplatte die Platten 16 bis 36 Stunden inkubieren. Bei 32 Grad oss die finalen Doppelmutanten-Selektionsplatten fotografieren, um die Wachstumsfitness der Mutanten quantitativ zu messen und die Wechselwirkungen zwischen den Genpaaren zu analysieren. Da Gene im selben Signalweg eng korrelierte GI-Muster aufweisen, können funktionell verwandte Gene gruppiert werden, indem sie nach der Gesamtähnlichkeit ihrer S-Score-Profile gruppiert werden.

Die Ähnlichkeit des GI-Profils stellt die Kongruenz der Phänotypen bei Mutation zweier Gene dar und sollte ein Hinweis darauf sein, ob die beiden Gene auf demselben oder einem überlappenden Weg wirken. Hier ist die Verteilung der Korrelationskoeffizienten zwischen den GI-Profilen von Genpaaren, die für physikalisch interagierende Proteine kodieren, im Vergleich zu zufällig gezogenen Genpaaren dargestellt. Ein Beispiel für ein Streudiagramm korrelierter genetischer Profile für zwei Transporter, die einen heterotrimeren Komplex bilden, der für die Spermienausscheidung erforderlich ist, ist gezeigt, wie bei dem Hefe-Ecolin-Gen, das ausstellt.

Die Linderung von Wechselwirkungen mit hochkorrelierten GI-Profilen neigt dazu, Signalwege zu kodieren, die physikalisch assoziiert sind oder kohärent in einem gemeinsamen biochemischen Signalweg agieren. Hier wird ein repräsentatives Beispiel gezeigt, bei dem die Komponenten der funktionell redundanten ISC- und SUF-Eisen-Schwefel-Biosynthesewege, die gemeinsam an einem essentiellen Prozess beteiligt sind, unterschiedliche Cluster bilden, die durch umfangreiche erschwerende Wechselwirkungen miteinander verbunden sind. Ein statistisches Maß kann verwendet werden, um eine signifikante Anreicherung für Wechselwirkungen zwischen spezifischen Kombinationen von Signalwegen, die Integration von GI-Netzwerken mit physikalischen Interaktionen und andere funktionelle Assoziationsdaten, wie z. B. den genomischen Kontext, zu finden.

Beziehungen können die Organisation von Funktionsmodulen höherer Ordnung aufzeigen, die die biologischen Kernsysteme in Bakterien definieren. Die Clusteranalyse kann auch auf GI-Netzwerke angewendet werden, um die Funktionen annotierter Gene vorherzusagen. Da Clustering-Algorithmen variieren.

Mutmaßliche funktionale Zuordnungen, die durch Clustering bestimmt werden, bedürfen jedoch einer unabhängigen experimentellen Verifizierung. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle notwendigen positiven und negativen Ergebnisse nach diesem Verfahren einzubeziehen. Andere Methoden wie Proteomik, biochemische Folgeexperimente und chemische Genomik können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu spezifischen Genfunktionen sowie zur Art der funktionellen Beziehungen zwischen Genen und Signalwegen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man doppelmutierte Stämme konstruiert, Empfänger-Arrays zusammensetzt und ESGA-Screenings durchführt, um die funktionellen Beziehungen zwischen Genen und Prozessen in E-coli zu untersuchen.