The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Stämme von Hefe zu erzeugen, die mehrere Deletionen aufweisen, die mit einem Reporter-Gen für grün fluoreszierendes Protein markiert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst haploide Einzelmutanten, sogenannte Pro-Monster, hergestellt werden, von denen jede ein GFP-Deletionskassette anstelle eines der Zielgene enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die Deletionen durch Konjugation und Sporulation von Hefestämmen zu kombinieren, wobei zwei Sätze von diploiden und haploiden Selektionsmarkern, das sogenannte GM-Toolkit A und das GM-Toolkit alpha, verwendet werden, die ebenfalls in den Pro-Monster-Stämmen vorhanden sind.

Anschließend werden aus der myotischen Population mittels Durchflusszytometrie stark fluoreszierende Zellen ausgewählt, um Stämme mit zwei Deletionen anzureichern. Der letzte Schritt besteht in der Bestätigung der Genotypen der sortierten Stämme. Letztendlich führen wiederholte Runden von Zellfusion und zytometrischer Anreicherung, ausgehend von den resultierenden Stämmen, zur Erzeugung von höheren multideletierten Stämmen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der G-Methode zur Markerverwendung und sequenziellen Genlöschung besteht darin, dass mehrere Deletionen pro Zyklus erzielt werden können, was zu einer schnelleren Erzeugung von Multimutanten führt. Nach der Erzeugung von Pro-Monstern, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, das diesem Video beiliegt, beginnt der sexuelle Zyklus mit der Vorbereitung von Kulturen der etablierten Pro-Monster-GFP-Deletionsstämme in einem 1,6-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Bereiten Sie den Deletionsstamm vom Kopplungstyp A in 100 Mikrolitern synthetischem komplettem Medium, das Histidin fehlt (als „minus His“-Medium bezeichnet), vor. Bereiten Sie außerdem den Deletionsstamm vom Kopplungstyp Alpha in 100 Mikrolitern synthetischem komplettem Medium, das Leucin fehlt (oder „minus Leu“-Medium), in einem 1,6-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen für den Gasaustausch vor.

Bohren Sie Löcher in die Verschlüsse der Röhrchen mit einer mit 70 % Ethanol behandelten Nadel. Drehen Sie die Röhrchen horizontal bei 30 Grad Celsius über Nacht. Die Drehachse muss parallel zur Längsachse des Röhrchens verlaufen.

Basierend auf der optischen Dichte wurden etwa 250.000 a-haploide Zellen und 250.000 α-haploide Zellen von GFP-Deletionsstämmen in einem 1,6-Milliliter-Einhorntestgefäß gemischt. Diese Zellzahl entspricht gewöhnlich sieben Mikrolitern jeder Übernachtkultur, die vortexiert wurde. Die Zellen werden weiterverarbeitet, indem man zunächst zwei Minuten bei 800 ×g zentrifugiert.

Nachdem Sie das Supinat entfernt haben, bohren Sie mit einer mit 70 % Ethanol behandelten Nadel ein Loch in den Deckel. Um den Luftaustausch zu ermöglichen, geben Sie 50 µL YPDA-Medium hinzu und zentrifugieren Sie Ihre Kultur kurz im Vortex bei 800 ×g für fünf Minuten. Anschließend stellen Sie das Gefäß in eine feuchte Kammer, die aus einer leeren Pipettenspitzenbox, einem kleinen Spitzenhalter und einem nassen Papiertuch besteht.

Die Box über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. 10 Mikroliter der Kopplungsmischung in 500 Mikroliter GNA-Medium ohne Agar, das die Antibiotika G 4 1 8 und nat enthält, in ein fünf Milliliter fassendes Kulturrohr mit gelöstem Deckel überführen; die Start-Optische Dichte bei 600 Nanometern beträgt etwa 0,1. Die Kultur 24 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rühren inkubieren.

Dies ermöglicht die Selektion von Diploiden, da nur Diploide, die sowohl MX vier im GM-Toolkit A als auch nat MX vier enthalten, in Gegenwart von G vier 18 und Nat wachsen können. Übertragen Sie 20 Mikroliter der ein Tage alten Kultur auf 500 Mikroliter frisches GN-Medium, das G vier 18 und Nat enthält. Die Ausgangs-Extinktion bei 600 Nanometern beträgt ungefähr 0,2.

Schwenken Sie das Reagenzglas bei 30 Grad Celsius fünf Stunden lang, um die Zellen in die exponentielle Wachstumsphase zu bringen. Danach korrelieren Sie die Diploide und isolieren die Sporen. Befolgen Sie das in der schriftlichen Anleitung beschriebene Verfahren.

Teilen Sie die Suspension von SPO-bezogenen Zellen in zwei Portionen zu je 300 Mikroliter auf und geben Sie jede Portion in ein separates 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 G für fünf Minuten. Nach dem Absaugen des überstehenden Überstandes bohren Sie ein Loch in den Deckel jedes Röhrchens.

Unter Verwendung eines Stecknadel, geben Sie 100 Mikroliter Minus-His-Medium zum Pellet eines Reaktionsgefäßes hinzu. Um Haploiden des PT des anderen Reaktionsgefäßes auszuwählen, geben Sie 100 Mikroliter Minus-Loo-Medium hinzu. Zur Auswahl von Alpha-Haploiden.

Schwenken Sie die Röhrchen über Nacht bei 30 Grad Celsius. Die endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern sollte unter 0,5 liegen. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern dazu neigt, zu hoch zu sein, versuchen Sie es bei Raumtemperatur.

Um die GFP-Expression zu induzieren, geben Sie 100 Mikroliter frisches Medium ohne Hiss oder ohne LU, das 20 Mikrogramm Doxycyclin pro Milliliter enthält, zu den verschiedenen Stämmen hinzu. Die Endkonzentration von Doxycyclin beträgt 10 Mikrogramm pro Milliliter. Vortexen Sie das Gefäß und inkubieren Sie es unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für zwei Tage.

Um die Durchflusszytometrie zu beginnen, geben Sie 900 Mikroliter vorfiltriertes TE-Puffer in ein fünf Milliliter fassendes Polypropylenrohr, dessen Verschluss durch eine Zellfilterkappe von einem fünf Milliliter fassenden Polystyrolrohr ersetzt wurde. Polypropylenröhrchen eignen sich für die Durchflusszytometrie. Die Filterkappe dient der Entfernung großer Partikel.

Platzieren Sie vorsichtig 75 µL des Puffers auf der Zellfilterkappe. Geben Sie 25 µL der induzierten Zellen zur Lösung auf der Kappe, während Sie die Spitze der Pipette gegen das Netz drücken. Drücken Sie die gesamte kombinierte Lösung durch den Filter.

Drücken Sie die Siebkappe herunter und wirbeln Sie das Gefäß. Bereiten Sie die Sammelgefäße vor: 1,6-Milliliter-Fendor-Gefäße, die mit 200 Mikrolitern Minus-Hiss- oder Minus-Lube-Medium gefüllt sind. Starten Sie den Zellsortierer und stellen Sie die Einstellungen gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers ein.

Vortexen Sie die Sammelgefäße, um die Wand mit dem Medium zu benetzen. Vortexen Sie außerdem das Gefäß mit den Zellen, bevor Sie sie in den Zellsortierer geben. Erfassen Sie die Durchflusszytometriedaten der Probe.

Ein Stamm ohne GFP kann als Negativkontrolle dienen. Zeichnen Sie Tore für die Sortierung, um Zellaggregate zu vermeiden, die eine hohe GFP-Intensität aufweisen könnten. Verwerfen Sie Ausreißer mit unverhältnismäßig großer Pulsbreite oder -fläche für den Vorwärtsstreulicht (abgekürzt FSC), indem Sie eine Darstellung der Pulsbreite gegenüber der Pulsamplitude oder eine Darstellung der FSC-Fläche gegenüber der FSC-Amplitude verwenden.

Da eine hohe FSC nur bei Zellaggregaten zu erwarten ist, sollten nur Zellen im unteren 20 %-Bereich der FSC ausgewählt werden. Bereiche mit den niedrigsten Werten für FSC und Seitenstreuung (SSC), wo sich häufig Zelltrümmer befinden, sollten vermieden werden. SSC- und GFP-Signal sind oft positiv korreliert.

Um eine Anreicherung der Zellen mit einem höheren SSC-Wert zu vermeiden, zeichnen Sie ein Tor entlang des Randes der Population unter Verwendung einer Darstellung der GFP-Intensität und des SSC, um insgesamt einen ähnlichen Prozentsatz der hellsten Zellen aus jedem Punkt entlang der SSC-Achse zu erfassen. 0,1 bis 1 % der Teilpopulation, die zuvor mithilfe der FSC- und SSC-Tore ausgewählt wurde, sollten zur Sortierung markiert werden, um 200 Zellen in das Sammelröhrchen zu sortieren. Vortexen Sie das Sammelröhrchen, um die sortierten Zellen vollständig mit Medium zu bedecken.

Untergruppe von Zellen auf A-Y-P-D-A-Platte zur Genotypisierung. Inkubieren Sie die Platte nach der Inkubation zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius. Bereiten Sie ein Lysat von ungefähr 12 Kolonien zu.

Nach den Schritten des schriftlichen Protokolls für die Genotypisierung vorgehen. Ein Mikroliter eines verdünnten Lysats mittels einer 10-Mikroliter-PCR-Reaktion mit einem Vorwärtsprimer analysieren. Dieser 10 kniet in den upstream flankierenden Bereich jedes deletierten Gens, gepaart mit einem gemeinsamen Primer, der 10 in allen Deletionsloki kniet.

Die PCR kann in einem 96- oder 384-Loch-Format nach der Amplifikation durchgeführt werden. Analysieren Sie die PCR-Produkte mittels Elektrophorese.

Identifizieren Sie Haploide, die wahrscheinlich die gewünschten Genotypen aufweisen. Stellen Sie diese Stämme auf einer neuen Platte her. Gefrieren Sie sie außerdem in 25 % Glycerin bei minus 80 Grad Celsius ein.

Zusätzliche Tests, wie die Bestätigung des Fehlens von Wildtyp-Sequenzen für gelöschte Gene und die Gelelektrophorese nach dem Feld, werden empfohlen. Wiederholen Sie den sexuellen Zyklus mit geeigneten Stämmen. Haploide Nachkommen aus einer Kreuzung zweier Stämme wurden zur Expression von GFP induziert.

Jede Genlöschung wies eine GFP-Kassette auf, wobei Tore mit einem Durchflusszytometer verwendet wurden, um eine Population der resultierenden Zellen auszuwählen. Diese Population enthält wahrscheinlich keine Trümmer oder Zellaggregate. Die hellsten 1 % der Zellen wurden sortiert und durch Gating der Zellen basierend auf dem Bereich der Vorwärtsstreuung und der Höhe der Vorwärtsstreuung beibehalten.

Zellaggregate, die tendenziell eine überproportional große Vorwärtsstreufläche aufweisen, wurden ausgeschlossen, indem Zellen anhand von Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung selektiert wurden; Zellen in den unteren 20 % der Vorwärtsstreuung wurden akzeptiert, während totes Zelltrümmermaterial mit der niedrigsten Vorwärts- und Seitwärtsstreuung ausgeschlossen wurde. Durch Gating der Zellen anhand der Seitwärtsstreuung und des GFP-Signals wurden die fluoreszierenderen Zellen innerhalb eines bestimmten Bereichs der Seitwärtsstreuung ausgewählt, um einen Vergleich zwischen der myotischen Mischung und der negativen Kontrollprobe, die kein GFPA exprimiert, zu ermöglichen. Ein GA, identisch mit dem zur Auswahl der P-drei-Population, ist im Diagramm dargestellt. Für die ähnlich ausgewählten Zellen der negativen Kontrolle in einem separaten Haplos wurden nach Induktion der GFP-Expression und Sortierung anhand der Fluoreszenz PCR-Analysen durchgeführt. Die erwartete Anzahl an Deletionen in einer nicht sortierten Zelle, resultierend aus zufälliger Segregation, betrug 7,5.

Bei diesem speziellen Experiment wies die sortierte Zellpopulation eine durchschnittliche Deletionsanzahl von 8,8 ± 0,3 auf, einschließlich fünf Zellen mit jeweils 10 Deletionen. DO-Genotyp. Die PCL-Analyse der sortierten Stämme wurde unter Verwendung eines reversen Primers durchgeführt.

Dieser 10 bindet an den downstream flankierenden Bereich in Kombination mit einem Vorwärtsprimer. Dieser 10 bindet an das Ende der Kassette. Das Vorhandensein eines Bands zeigt die Anwesenheit der GFP-Kassette an.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die grüne Monster-Methode anwenden, um Deletionen in Hefe zu erzeugen.