The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Stämme von Hefe zu erzeugen, die mehrere Deletionen tragen, die mit einem grün fluoreszierenden Protein markierten Reportergen gekennzeichnet sind. Dies wird erreicht, indem zunächst haploide Einzelmutanten, sogenannte Pro-Monster, hergestellt werden, von denen jeder ein GFP-Deletionskassette anstelle eines der Zielgene enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die Deletionen durch Kreuzung und Sporulation von Hefestämmen mittels zweier Sätze von diploiden und haploiden Selektionsmarkern, die als GM-Toolkit A und GM-Toolkit alpha bezeichnet werden und ebenfalls in den Pro-Monster-Stämmen vorhanden sind, zu kombinieren.

Anschließend werden mithilfe der Durchflusszytometrie stark fluoreszierende Zellen aus der meiotischen Population ausgewählt, um Stämme mit zwei Deletionen anzureichern. Der letzte Schritt besteht in der Bestätigung der Genotypen der sortierten Stämme. Letztendlich führen wiederholte Runden von Zellfusion und Durchflusszytometrie-basierter Anreicherung, beginnend mit den resultierenden Stämmen, zur Erzeugung von Multi-Deletions-Stämmen mit höherer Anzahl an Deletionen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der G-Methode zur Markerverwendung und sequenziellen Genlöschung besteht darin, dass pro Zyklus mehrere Deletionen erzielt werden können, was zu einer schnelleren Erzeugung von Multimutanten führt. Nach der Erzeugung von Pro-Monstern gemäß dem schriftlichen Protokoll, das diesem Video beiliegt, wird der sexuelle Zyklus eingeleitet, indem Kulturen der etablierten Pro-Monster-GFP-Deletionsstämme in einem 1,6-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen vorbereitet werden. Bereiten Sie den Deletionsstamm des Kopplungstyps A in 100 Mikrolitern synthetischem komplettem Medium, das Histidin fehlt (als „minus his“-Medium bezeichnet), vor. Bereiten Sie außerdem den Deletionsstamm des Kopplungstyps alpha in 100 Mikrolitern synthetischem komplettem Medium, das Leucin fehlt (oder „minus leu“-Medium), in einem 1,6-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen für den Gasaustausch vor.

Stechen Sie mit einer mit 70 % Ethanol behandelten Nadel Löcher in die Verschlüsse der Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen horizontal rotierend über Nacht bei 30 Grad Celsius. Die Rotationsachse muss parallel zur Längsachse des Röhrchens liegen.

Schätzen Sie anhand der optischen Dichte und mischen Sie grob 250.000 a-Haplo-Zellen und 250.000 alpha-Haplo-Zellen von GFP-Deletionsstämmen in einem 1,6-Milliliter-Einor-Röhrchen. Diese Zellzahl entspricht gewöhnlich sieben Mikrolitern jeder Übernachtkultur, die vortexiert wurde. Zentrifugieren Sie die Zellen zunächst mit 800 × g für zwei Minuten, um diese Zellen aufzubereiten.

Nachdem Sie das Überstand entfernt haben, machen Sie ein Loch in den Deckel mit einem mit 70 % Ethanol behandelten Reißnagel. Geben Sie 50 Mikroliter YPDA-Medium zu, um Luftaustausch zu ermöglichen, und wirbeln Sie kurz vortexartig, zentrifugieren Sie dann Ihren Ansatz bei 800 ×g für fünf Minuten. Stellen Sie anschließend das Gefäß in eine feuchte Box, die aus einer leeren Pipettenspitzenbox, einem kleinen Ständer für Spitzen und einem nassen Papiertuch hergestellt wurde.

Inkubieren Sie die Box über Nacht bei 30 Grad Celsius. Übertragen Sie 10 Mikroliter der Konjugationsmischung in 500 Mikroliter GNA-Medium ohne Agar, das die Antibiotika G418 und Nat enthält, in ein fünf Milliliter fassendes Kulturgefäß mit gelöstem Deckel; die Start-Optische Dichte bei 600 Nanometern beträgt etwa 0,1. Schütteln Sie die Kultur 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.

Dies ermöglicht die Selektion von Diploiden, da nur Diploide, die sowohl MX vier im GM-Toolkit A als auch nat MX vier enthalten, in Gegenwart von G vier 18 und Nat wachsen können. Übertragen Sie 20 Mikroliter der ein Tage alten Kultur in 500 Mikroliter frisches GN-Medium, das G vier 18 und Nat enthält. Die anfängliche optische Dichte bei 600 Nanometern beträgt ungefähr 0,2.

Drehen Sie das Reagenzglas 5 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, um die Zellen in die exponentielle Wachstumsphase zu bringen. Danach korrelieren Sie die Diploiden und isolieren die Sporen. Befolgen Sie das in der schriftlichen Anleitung beschriebene Verfahren.

Teilen Sie die Suspension von SPO-bezogenen Zellen in zwei Teile zu je 300 Mikroliter auf und geben Sie jeden Teil in ein separates 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 ×g für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des überstehenden Überstandes bohren Sie ein Loch in den Deckel jedes Röhrchens.

Verwenden Sie eine Nadelspitze, um 100 Mikroliter Minus-His-Medium zum Pellet eines Reaktionsgefäßes hinzuzufügen. Um Haploiden des PT des anderen Reaktionsgefäßes auszuwählen, geben Sie 100 Mikroliter Minus-Loo-Medium hinzu. Zur Selektion der Alpha-Haploiden.

Schwenken Sie die Röhrchen über Nacht bei 30 Grad Celsius. Die endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern sollte unter 0,5 liegen. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern dazu neigt, zu hoch zu sein, versuchen Sie es bei Raumtemperatur.

Um die GFP-Expression zu induzieren, geben Sie 100 Mikroliter frisches Medium ohne Hiss oder ohne LU, das 20 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin enthält, zu den verschiedenen Stämmen hinzu. Die Endkonzentration von Doxycyclin beträgt 10 Mikrogramm pro Milliliter. Vortexen Sie das Gefäß und inkubieren Sie es unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für zwei Tage.

Um die Durchflusszytometrie zu beginnen, geben Sie 900 Mikroliter vorgefilterter TE-Pufferlösung in eine fünf Milliliter fassende Polypropylen-Röhrchen, dessen Verschluss durch eine Zellsiebkappe von einem fünf Milliliter fassenden Polystyrol-Röhrchen ersetzt wurde. Polypropylen-Röhrchen eignen sich für die Durchflusszytometrie. Die Siebkappe dient der Entfernung größerer Partikel.

Geben Sie vorsichtig 75 Mikroliter des Puffers auf die Zellsiebhaube. Fügen Sie 25 Mikroliter der induzierten Zellen zur Lösung auf der Haube hinzu, während Sie die Spitze der Pipette gegen das Netz drücken. Drücken Sie die gesamte kombinierte Lösung durch den Sieb.

Drücken Sie die Siebkappe herunter und wirbeln Sie das Gefäß. Bereiten Sie die Sammelgefäße vor, 1,6-Milliliter-Fendor-Gefäße, die mit 200 Mikrolitern Minus-Hiss- oder Minus-Lube-Medium gefüllt sind. Starten Sie den Zellsortierer und stellen Sie die Einstellungen gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers ein.

Vortexen Sie die Sammelgefäße, um die Wand mit dem Medium zu benetzen. Vortexen Sie außerdem das Gefäß mit den Zellen, bevor Sie sie in den Zellsortierer geben. Erfassen Sie die Durchflusszytometriedaten der Probe.

Ein Stamm ohne GFP kann als negativer Kontrollstamm dienen. Zeichnen Sie Gates für die Sortierung, um Zellaggregate auszuschließen, die eine hohe GFP-Intensität aufweisen könnten. Verwerfen Sie Ausreißer mit unverhältnismäßig großer Pulsbreite oder -fläche für den Vorwärtsstreulicht (abgekürzt FSC), indem Sie eine Darstellung der Pulsbreite gegenüber der Pulsamplitude oder eine Darstellung der FSC-Fläche gegenüber der FSC-Amplitude verwenden.

Da eine hohe FSC nur bei Zellaggregaten zu erwarten ist, sollten nur Zellen im unteren 20 %-Bereich der FSC ausgewählt werden. Bereiche mit den niedrigsten Werten für FSC und Seitenstreuung (SSC), wo sich häufig Zelltrümmer befinden, sollten vermieden werden. SSC- und GFP-Signal sind oft positiv korreliert.

Um eine Anreicherung der Zellen mit einem höheren SSC-Wert zu vermeiden, ziehen Sie ein Tor entlang des Randes der Population unter Verwendung eines Diagramms der GFP-Intensität und des SSC, um insgesamt einen ähnlichen Prozentsatz der hellsten Zellen von jedem Punkt entlang der SSC-Achse zu erfassen. 0,1 bis 1 % der Teilpopulation, die zuvor mithilfe der FSC- und SSC-Tore ausgewählt wurde, sollten zur Sortierung in die Sammelröhre markiert werden. Vortexen Sie die Sammelröhre, um die sortierten Zellen mit Medium zu bedecken und auf die Platte zu geben.

Teilmenge von Zellen auf A-Y-P-D-A-Platte zur Genotypisierung. Inkubieren Sie die Platte nach der Inkubation zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius. Stellen Sie ein Lysat für etwa 12 Kolonien her.

Nach den im schriftlichen Protokoll für die Genotypisierung beschriebenen Schritten vorgehen. Ein Mikroliter eines verdünnten Lysats unter Verwendung einer 10-Mikroliter-PCR-Reaktion mit einem Vorwärtsprimer analysieren. Dieser 10 kniet in den upstream flankierenden Bereich jedes gelöschten Gens, gepaart mit einem gemeinsamen Primer, der 10 in allen Deletionsloki kniet.

Die PCR kann in einem 96- oder 384-Well-Format nach der Amplifikation durchgeführt werden. Analysieren Sie die PCR-Produkte mittels Elektrophorese.

Identifizieren Sie Haploide, die wahrscheinlich die gewünschten Genotypen aufweisen. Stellen Sie diese Stämme auf einer frischen Platte sicher. Lagern Sie sie außerdem in 25 % Glycerin bei minus 80 Grad Celsius ein.

Zusätzliche Tests, wie die Bestätigung des Fehlens von Wildtyp-Sequenzen für gelöschte Gene und die Gelelektrophorese nach dem Feld, werden empfohlen. Wiederholen Sie den sexuellen Zyklus mit geeigneten Stämmen. Haploide Nachkommen aus einer Kreuzung zweier Stämme wurden zur Expression von GFP induziert.

Jede Genlöschung wies eine GFP-Kassette auf, wobei Tore mit einem Durchflusszytometer verwendet wurden, um eine Population der resultierenden Zellen auszuwählen. Diese Population enthält wahrscheinlich weder Zelltrümmer noch Zellaggregate. Die hellsten 1 % der Zellen wurden sortiert und anhand der Streulichtfläche und der Streulichthöhe durch Gating ausgewählt.

Zellaggregate, die tendenziell eine überproportional große Vorwärtsstreufläche aufweisen, oder Zellen im unteren 20 %-Bereich der Vorwärtsstreuung wurden anhand von Vorwärts- und Seitwärtsstreuung ausgeschlossen; stattdessen wurden Zellen akzeptiert, während zellulärer Trümmer mit der niedrigsten Vorwärts- und Seitwärtsstreuung durch Gating der Zellen basierend auf Seitwärtsstreuung und GFP-Signal ausgeschlossen wurde. Unter den Zellen innerhalb eines bestimmten Bereichs der Seitwärtsstreuung wurden die stärker fluoreszierenden Zellen ausgewählt, um einen Vergleich zwischen der myotischen Mischung und der negativen Kontrollprobe, die GFP nicht exprimiert, zu ermöglichen. Ein GA, identisch mit dem zur Auswahl der P3-Population verwendeten, ist in der Abbildung dargestellt. Für die ähnlich ausgewählten Zellen der negativen Kontrolle aus separaten Haplos wurde nach Induktion der GFP-Expression und Sortierung anhand der Fluoreszenz eine PCR-Analyse durchgeführt. Die erwartete Anzahl an Deletionen für eine nicht sortierte Zelle, die durch zufällige Segregation entsteht, betrug 7,5.

In diesem speziellen Experiment wies die sortierte Zellpopulation eine durchschnittliche Deletionsanzahl von 8,8 ± 0,3 auf, einschließlich fünf Zellen mit jeweils 10 Deletionen. DO-Genotyp. Die PCL der sortierten Stämme wurde unter Verwendung eines reversen Primers durchgeführt.

Dieser 10 bindet an den downstream flankierenden Bereich in Kombination mit einem Vorwärtsprimer. Dieser 10 bindet an das Ende der Kassette. Das Vorhandensein eines Bands zeigt die Anwesenheit der GFP-Kassette an.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die grüne Monster-Methode verwenden können, um Deletionen in Hefe zu erzeugen.