Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, eine intestinale Manipulation durchzuführen, um die Entstehung und Auflösung des postoperativen Ileus in einem Nagetiermodell zu untersuchen. Dies wird durch eine standardisierte Manipulation des Dünndarms zwischen zwei feuchten Wattestäbchen erreicht. Anschließend werden die gastrointestinale und kolonale Passage analysiert, um die postoperative Motilität zu messen. Danach erfolgt eine histochemische Analyse sowie eine Organkultur der Dünndarmmuskulatur, der Tunica muscularis externa oder des me, um Entzündungsgrade zu untersuchen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die eine starke Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das Darmepithel und eine übermäßige Produktion von Stickstoffmonoxid in Darmkulturen zeigen, was zu Verzögerungen der Transitzzeiten im Magen-Darm-Trakt und im Kolon führt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Entstehung und Behandlung des postoperativen Ileus zu beantworten sowie potenzielle Prophylaxe- oder Therapieansätze zu untersuchen. Die Durchführung der Prozedur wird Mario Lewison, ein Techniker aus unserem Labor, demonstrieren. Nach Verabreichung von 0,8 bis 1 % Isofluran in Sauerstoff an eine männliche Maus wird das Tier in Rückenlage gebracht und mit Klebeband an den Extremitäten fixiert.

Verwenden Sie einen leichten Schmerzreiz, um eine tiefe Sedierung zu testen. Führen Sie anschließend eine mediane Laparotomie von zwei Zentimetern Länge durch. Danach setzen Sie zwei sterile Retraktoren ein, um den Bauchraum geöffnet zu halten, und exponieren vorsichtig den Dünndarm nach links, um ihn auf feuchter Mullbinde abzulegen.

Entfernen Sie mithilfe zweier feuchter Wattestäbchen den luminalen Inhalt des gesamten Dünndarms, indem Sie die Stäbchen gleichzeitig vom Pylorus bis zum Z盲kum abrollen. Legen Sie den Darm ohne Verdrehung zurück in die Bauchhöhle, um eine Ischämie oder mechanische Obstruktion zu vermeiden, und verschließen Sie ihn mit zwei Längen fortlaufender nicht resorbierbarer Polyamidnahtfäden der Stärke 5,0. Schließen Sie den Bauchschnitt.

Stellen Sie das Tier unter eine Wärmelampe und überwachen Sie es, bis es sich von der Anästhesie erholt hat. Danach setzen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und gewähren ihr Zugang zu Futter und Wasser. Am nächsten Tag.

Nach vollständiger Anästhesie der Maus vorsichtig den Kopf überstrecken und mit stumpfen Pinzetten die Zunge herausziehen, eine Ein-Milliliter-Spritze mit mindestens 100 Mikrolitern fluoresceinmarkiertem Dextran füllen. Diese mit einem arteriellen Katheter verbinden und den Katheter vorsichtig wie eine Magensonde in den Magen einführen. Schnell 100 Mikroliter FITC-Dextran injizieren und den Katheter entfernen.

Lassen Sie das Tier das Bewusstsein wiedererlangen und warten Sie 90 Minuten. Nach den 90 Minuten euthanasieren Sie die Maus und entfernen den gesamten Gastrointestinaltrakt vom Magen bis zum Rektum. Legen Sie den Darm auf eine Polystyrolunterlage und vermeiden Sie Dehnung.

Messen Sie anschließend die gesamte Länge des Dünndarms und des Dickdarms. Befestigen Sie den Darm mit Kanülen auf der Polystyrolplatte. Teilen Sie den Dünndarm in 10 gleich lange Abschnitte und den Dickdarm in drei gleich lange Abschnitte ein.

Nachdem der Darm an den markierten Stellen durchtrennt wurde, spülen Sie die Abschnitte einmal mit einem Milliliter Krebs-HCO₃⁻-Puffer oder KHB aus. Überführen Sie die Abschnitte in nacheinander beschriftete 2-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie die Proben kräftig im Vortex, anschließend zentrifugieren. Danach überführen Sie das Überstandsvolumen in saubere, nummerierte 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern, bis die Analyse erfolgt. Als Nächstes pipettieren Sie hundert Mikroliter-Aliquots jedes Überstandes dupliziert in eine schwarze 96-Loch-Platte und verwenden einen Fluoreszenzreader, um die Platte auszulesen, um die kolonale Transitzzeit nach wöchentlicher Anästhesie des Tieres zu überprüfen.

Überprüfen Sie sorgfältig die Durchgängigkeit des Kolons, indem Sie eine Fistel einführen. Untersuchen Sie über den Anus in das Kolon mithilfe des Probes. Führen Sie eine zwei Millimeter große Glaskugel drei Zentimeter in das Kolon ein und entfernen Sie den Probe.

Starten Sie unverzüglich eine Stoppuhr. Stellen Sie die Maus in einen transparenten Käfig und beobachten Sie sie über den Zeitraum, der für die Ausscheidung des Balls benötigt wird. Für die histochemische Analyse von mittleren Totproben.

Nachdem Gewebestücke aus dem Darm herausgeschnitten und in kaltem KHB in einer mit Silikon gefüllten Schale eingetaucht wurden, verwenden Sie Insektennadeln, um das Mesenterium an der Schale zu befestigen. Schneiden Sie die Stücke entlang ihrer mesenterialen Grenze auf und dehnen Sie das Gewebe auf 120 % seiner Länge und Breite. Befestigen Sie das Gewebe mit Nadeln, beginnend am Mesenterium. Mechanisch.

Trennen Sie die Muscularis externa oder me von der Tunica mucosa. Fixieren und färben Sie die Proben gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls zur Kultivierung. Die me.

24 Stunden nach dem Eingriff an der Darmmanipulation das gesamte Dünndarmresektat entnehmen und in kalte, mit Penicillin, G und Streptomycin versetzte KHB-Lösung legen. Den Darm in drei Zentimeter lange Stücke schneiden und jedes Segment mit feinen Scheren auf einer silikonbeschichteten Glasplatte fixieren. Das Mesenterium entfernen und den Darm mit einer spitzen Pinzette auf eine Nicknadel schieben.

Schneiden Sie vorsichtig in die Mukosa ein und heben Sie sie mit einem angefeuchteten Wattestäbchen ab. Lösen Sie sie vom Submukosa-Gewebe ab und legen Sie sie in kalte KHB-Lösung mit Ps. Anschließend schneiden Sie die Mukosa-Streifen in Stücke von zwei bis vier Millimetern Länge und inkubieren Sie diese 30 Minuten lang in eiskalter KHB-Lösung mit PS. Spülen Sie die Probe mehrmals gründlich aus.

Überführen Sie anschließend etwa 50 bis 60 Milligramm von mir in eine sterile 24-Loch-Platte, die 500 Mikroliter DMEM enthält. Inkubieren Sie das Gewebe 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn fünf Minuten bei 1000 RCF.

Dann schnell einfrieren, indem das Gewebe in flüssigem Stickstoff für die Messung von Zytokinen oder Stickstoffmonoxid fixiert wird. Abschließend das Muskelgewebe mit einem sauberen Papiertuch 30 Sekunden abtupfen und anschließend wiegen. Der wichtigste Parameter zur Beurteilung der Schwere einer postoperativen Ileus ist die Untersuchung des gastrointestinellen Transits oder GIT in vivo.

Diese Abbildung zeigt eine typische Verteilung von FITC-Dextran entlang des Magen-Darm-Trakts bei unbehandelten Kontrolltieren und bei Mäusen mit intestinaler Manipulation 24 Stunden nach der Operation. Wie hier dargestellt, wiesen die sham-operierten Tiere einen normalen Magen-Darm-Transit mit einem berechneten geometrischen Zentrum im Blinddarm auf. Während die intestinale Manipulation (Im) zu einer signifikanten Verzögerung des Magen-Darm-Transits im proximalen Jejunum führte, exkreten die sham-operierten Mäuse eine Glaskugel innerhalb von 48 bis 200 Sekunden im Test zur Analyse der kolonmotilität, wohingegen Im die Ausscheidungszeit auf 470 bis 775 Sekunden verlängerte, um Entzündungen zu messen.

Innerhalb des ME wurden die Leukozytenwerte mithilfe der Histochemie oder Immunhistochemie analysiert, wie hier dargestellt. Bei Kontrollmäusen wurden nur wenige polymorphkernige Neutrophile beobachtet; eine starke Infiltration trat jedoch im Dünndarm auf. Viele entzündungsfördernde Mediatoren, die von Zellen freigesetzt werden, sind im Gewebe schwer nachweisbar.

Lysate-Organkulturen ermöglichen den Nachweis entzündlicher Marker in der Kultur. Ein repräsentatives Mediator-Molekül bei POI ist Stickstoffmonoxid, oder NO, das ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im Magen-Darm-Trakt darstellt. Diese Abbildung zeigt, dass NO in ME nicht nachgewiesen werden konnte.

Bei der Organkultur wurden in den Überständen von Kontrolltieren, die einer Scheinoperation unterzogen wurden, basale nno-Werte beobachtet. Kulturen von intestinal manipulierten Mäusen produzieren dagegen nach einer 24-stündigen Inkubation signifikant mehr nno. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die intestinale Manipulation innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden, sofern sie korrekt ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine postoperative Ileus bei Mäusen induziert und wie man deren Schweregrad analysiert.