Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expression von microRNA in Mikroglia zu analysieren. Dazu werden zunächst das Gehirn und das Rückenmark präpariert und dann das Gewebe des Zentralnervensystems oder des ZNS-Gewebes homogenisiert. Im zweiten Schritt werden mononukleäre Zellen aus dem ZNS durch einen Pro-Call-Gradienten isoliert und dann die Mikrogliapopulation durch Fakten identifiziert.

Als nächstes wird die Mikroglia-RNA isoliert und die Qualität der Probe analysiert. Schließlich wird eine real-time PCR für die jeweilige Mikro-RNA von Interesse durchgeführt. Letztendlich kann die Delta-Delta-CT-Methode verwendet werden, um das relative Expressionsniveau einer bestimmten Mikro-RNA in Mikroglia darzustellen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil sie nicht in der Lage sind, eine ausreichende Anzahl von mononukleären Zellen aus dem ZNS zu isolieren oder weil die Probe kontaminiert, Myelin und Zelltrümmer ist. In beiden Fällen kommt es zu einer minderwertigen Präparation, aber entweder zu einer geringen RNA-Konzentration oder zu einer Kontamination mit Proteinen. Das Verfahren wird von mir und vir demonstriert.

Dr.O Fellow von Nach der Perfusion aller Mäuse sezieren Sie die Gehirne und das Rückenmark. Geben Sie dann jeweils ein Gehirn und ein Rückenmark in einen 15-Milliliter-Downs-Homogenisator und fügen Sie dem Gewebe jedes Mal fünf Milliliter PBS hinzu. Nachdem Sie 10 bis 20 sanfte Schläge ausgeführt haben, passieren Sie die homogenen Zellsiebe durch 70-Mikron-Zellsiebe in einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf bis sieben Minuten lang bei 834 mal G und vier Grad Celsius.

Nach dem Verwerfen des Überstands suspendiert Resus das Gehirn und das Rückenmark homogen von zwei bis drei Mäusen in fünf bis sieben Millilitern von 70 % pro Aufruf. Überlagern Sie dann sieben Milliliter mit 40 % pro Anruf und drehen Sie die Lösung pro Anruf und Zelle 30 Minuten lang bei 850 mal G 20 Grad Celsius ohne Pause. Entsorgen Sie die beschädigten Zellen sowie die Meile und den Schmutz am oberen Rand der 70 % pro Anruf.

Sammeln Sie dann die mononukleären Zellen an der Grenzfläche zwischen den 70%- und 40%-Lösungen pro Anruf und verdünnen Sie die gesammelten Zellen in PBS, zumindest in einem Verhältnis von eins zu eins. Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, reanimieren Sie das Pellet in einem halben Milliliter PBS und überführen Sie es in ein 1,7-Milliliter-Einorröhrchen. Beginnen Sie damit, 50 Mikroliter der nach Dichtegradienten sortierten Zellen in ein neues 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen zu überführen und fügen Sie dem Röhrchen 350 Mikroliter Faxpuffer hinzu.

Nachdem Sie fünf bis 10 Mikroliter Anti-FCR-Antikörper in das Röhrchen gegeben haben, inkubieren Sie die Zellen 10 bis 15 Minuten lang auf Eis. Teilen Sie die Zellprobe in zwei Einor-Röhrchen auf ein Röhrchen auf. Fügen Sie einen Mikroliter Anti-CD 11 B und zwei Mikroliter Anti-CD 45-Antikörper hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen für weitere 10 bis 15 Minuten auf Eis. Beschriften Sie das zweite Röhrchen mit der Negativkontrolle und legen Sie es auf Eis. Nach der Inkubation mit Färbeantikörpern geben Sie einen Milliliter Faxpuffer in beide Röhrchen und schleudern die Zellen in einer Mikrozentrifuge fünf Minuten lang mit 1200 Mal.

Befestigen Sie dann die Pellets in 400 Mikrolitern 1%para Formaldehyd in PBS und wirbeln Sie die Röhrchen vor, um ein Verklumpen zu verhindern. Schließlich analysieren Sie die Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der negativen Kontrollzellprobe und der BD com-Kügelchen und beginnen mit der subkutanen Immunisierung einer Gruppe von fünf bis 10, acht bis 12 Wochen alten C 57 schwarzen sechs Mäusen mit 150 Milligramm MOG 35 bis 55 Peptid in vier Milligramm pro Milliliter vollständiger Frons Adjuvans, um EAE zu induzieren. Verabreichen Sie dann Pertussis-Toxin intraperitoneal am Tag Null und am zweiten Tag nach der Immunisierung.

Nachdem Sie die Zellen isoliert und gefärbt haben, wie gerade gezeigt, suspendieren Sie die Pellets in 400 Mikrolitern PBS anstelle von Fixiermittel kurz vor dem Sortieren. Füllen Sie dann zwei 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen mit 300 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 10 % FBS, zur Entnahme der Proben. Sortieren Sie schließlich die Mikroglia- und Makrophagenpopulationen auf eine hohe Reinheit mit der Gating-Strategie, die in diesem repräsentativen Dichtediagramm dargestellt ist.

Analysieren Sie nach der Sortierung die Mikroglia- und Makrophagenpopulationen erneut, um die Reinheit der isolierten Zellproben zu bestimmen. Nachdem Sie die sortierten Zellpopulationen fünf bis sieben Minuten lang bei 1200 mal G in einer Mikrozentrifuge heruntergeschleudert haben, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und frieren Sie die Zellpellets auf Trockeneis ein. Übertragen Sie als Nächstes die gefrorenen Zellpellets auf normales Eis.

Zum Auftauen fügen Sie 300 Mikroliter Lysepuffer aus einem Nirvana-Kit hinzu und mischen Sie die Zelllösung dann vorsichtig durch fünf- bis siebenmaliges Pipettieren. Fügen Sie dann 30 Mikroliter des Homogenatadditivs hinzu, wirbeln Sie die Zellsuspension 30 Sekunden lang vor und legen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie nun 300 Mikroliter der Säure Phenol und Chloroform hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen weitere 30 Sekunden lang.

Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 9.500 G heruntergeschleudert haben, übertragen Sie die oberen 300 Mikroliter des Überstandes, der die wässrige Phase enthält, vorsichtig in ein neues 1,7-Milliliter-Einorröhrchen. Mischen Sie die Lösung mit 375 Mikrolitern 100%igem Ethanol. Übertragen Sie den gesamten Röhrcheninhalt in eine Filterpatrone aus dem Nirvana-Kit und drehen Sie die Kartusche eine Minute lang bei 9.500 G. Entsorgen Sie anschließend den Durchflusspuffer.

Fügen Sie 700 Mikroliter Waschlösung hinzu, eine aus dem Nirvana-Kit, und schleudern Sie nach dem Waschen der Kartusche eine weitere Minute lang bei 9.500 G. Noch zwei Mal mit 500 Mikrolitern Waschlösung. Zwei aus dem Nirvana-Kit Elute, die RNA aus der Kartusche mit 60 Mikrolitern vorgewärmtem nukleasefreiem Wasser.

Verwenden Sie schließlich ein NanoDrop-Spektrophotometer, um die Reinheit und Menge der RNA zu beurteilen, nachdem Sie Echtzeit-Q-R-T-P-C-R zum Nachweis von Mikro-RNA in den Mikroglia- und Makrophagenproben durchgeführt haben. P-R-T-P-C-R-Kurven für fluoreszenzmarkierte mere 1 24 und snow RNA 55 PCR-Produkte können erstellt werden, wie hier in der ersten Grafik gezeigt. Typische Kurven für die Menge fluoreszenzmarkierter spezifischer PCR-Produkte zur Kontrolle von Schnee-RNA-55-RNA-Proben, die aus Mikroglia oder aus dem Knochenmark abgeleiteten Makrophagen isoliert wurden, im Vergleich zur Anzahl der PCR-Zyklen sind dargestellt.

Es ist zu beachten, dass die CT-Werte für die Analyse der Schnee-RNA-55-Expression aus den verschiedenen Zellpopulationen am Schnittpunkt der Basislinie mit dem unteren Teil des linearen Bereichs der Q-R-T-P-C-R-Kurven bestimmt werden, wie in der Grafik durch die grünen und blauen vertikalen Linien dargestellt. In dieser zweiten Grafik ist die Menge an fluoreszenzmarkierten spezifischen PCR-Produkten für die experimentellen nur 1 24 RNA-Proben aus Mikroglia oder aus Knochenmark gewonnenen Makrophagen im Vergleich zur Anzahl der PCR-Zyklen dargestellt. Es ist zu beachten, dass die CT-Werte für die Analyse der Expression von nur 1 24 aus den verschiedenen Zellpopulationen wiederum am Schnittpunkt der Basislinie mit dem unteren Teil des linearen Bereichs der Q-R-T-P-C-R-Kurven bestimmt werden, wie in der Grafik durch die grünen und blauen vertikalen Linien angedeutet.

Nach der Bestimmung der CT-Werte für jede der Proben, wie für die Schnee-RNA 55 und die bloße Expression von 1:24 in Mikroglia- und BM-DMS von normalen und EAE-Mäusen, die in dieser Tabelle gezeigt werden, subtrahiert man den CT-Wert für die Kontroll-Schnee-RNA 55, Probe vom CT-Wert für die experimentelle bloße 1:24-Probe, um die Delta-CT-Werte für jedes Duplikat jeder Probe zu berechnen. Subtrahieren Sie dann die Delta-CT der Referenzprobe von den Delta-CT-Werten der anderen Proben, um die Delta-Delta-CT-Werte zu berechnen. Schließlich wird das relative Expressionsniveau für jede Stichprobe als zwei hoch minus delta delta CT berechnet, wie in diesem Dichtediagramm zu sehen ist.

Im Falle einer guten Isolierung von Mikroglia aus dem normalen ZNS repräsentieren 95 bis 98 % der Zellen CD 11 B-positive CD 45 niedrige Mikroglia, wobei zwei bis 5 % der Zellsuspension aus CD 11 B positiven CD 45 hohen perivaskulären Makrophagen, weniger als 1 % CD 11 B negativen CD 45 hohen Lymphozyten oder CD 11 B negativen CD 45 negativen Astroglia oder Oligo DRO Gliazellen bestehen Oder Zellfragmente werden vergleichsweise in einem schlechten Präparat vorhanden sein. Es besteht eine signifikante Kontamination von CD 11 B, negativen CD 45-negativen Zellen oder Zellfragmenten wie Astroglia oder Myelinpartikeln, wodurch die Zellen für die RNA-Isolierung und weitere Analyse ungeeignet sind. Darüber hinaus können auch CD 11 B negative CD 45 hohe Zellen vorhanden sein, was auf eine Kontamination durch Blutlymphozyten aufgrund unzureichender Perfusion hinweist. In diesem Dichtediagramm sind in dieser Abbildung die drei Populationen der Zellen dargestellt, die während der Neuroinflammation CD 11 B positiv CD 45 im ZNS vorhanden sind, niedrige Mikroglia CD 11 B positive CD 45 hohe Makrophagen und CD 11 B negative CD 45 hohe Lymphozyten.

Es wird die Qualität der RNA gezeigt, wie sie durch Gelelektrophorese nach einer guten vs. schlechten Isolierung bestimmt wird. Wenn die RNA auf saubere Weise isoliert wird, sind eine RNA-Leiter und ribosomale RNA erkennbar, wenn der Isolierungsprozess schlecht durchgeführt wird, Abstrich und Abbauprodukte mit niedrigem Molekulargewicht sind offensichtlich. Diese endgültigen Daten zeigen eine Expression von nur 1 24 in normalen adulten Mikroglia-Mikroglia von Mäusen mit EAE und Mikroglia, die in frühen Entwicklungsstadien aus Mäusen isoliert wurden.

In diesem ersten Balkendiagramm ist die relative Expression von nur 1 24 in Mikroglia aus normalem ZNS viel größer als bei Makrophagen aus dem Knochenmark. Auch wenn es eine Zunahme von nur 1:24 RNA in Makrophagen aus dem ZNS von Mäusen mit EAE gibt, exprimieren Mikroglia immer noch die fünffache Menge von nur 1:24 RNA. Dieses abschließende Balkendiagramm zeigt, wie Veränderungen des Expressionsniveaus von nur 1 24 in Mikroglia während der Entwicklung von Mäusen im Alter von ein, zwei und vier Wochen im Vergleich zu erwachsenen acht Wochen alten Mäusen auch mit dieser Methode bewertet werden können.

Es ist wichtig, daran zu denken, eine ausreichende Menge und gute Qualität der isolierten Zellen zu haben, die gute Ergebnisse für das gesamte Experiment garantieren.