Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von Mikro-RNA in Mikroglia zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn und das Rückenmark präpariert und anschließend das Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) homogenisiert wird. Im zweiten Schritt werden mononukleäre Zellen aus dem ZNS mittels einer Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend die Mikroglia-Population durch FACS identifiziert.

Anschließend wird die RNA der Mikroglia isoliert und die Qualität der Probe analysiert. Schließlich wird eine Echtzeit-PCR für das spezifische Mikro-RNA-Molekül von Interesse durchgeführt. Letztendlich kann die Delta-Delta-CT-Methode verwendet werden, um den relativen Expressionsgrad eines bestimmten Mikro-RNAs in Mikroglia darzustellen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie entweder nicht genügend mononukleäre Zellen aus dem ZNS isolieren können oder da die Probe mit Myelin und zellulärem Detritus kontaminiert ist. Beide Fälle führen zu einer Vorbereitung geringer Qualität, entweder aufgrund einer niedrigen RNA-Konzentration oder einer Kontamination mit Protein. Die Durchführung des Verfahrens werden ich und vir demonstrieren.

Dissezieren Sie nach der Perfusion aller Mäuse die Gehirne und Rückenmarke. Anschließend jeweils ein Gehirn und ein Rückenmark in einen 15-Milliliter-Dounce-Homogenisator geben und jedes Mal 5 Milliliter PBS zu dem Gewebe hinzufügen. Nach 10 bis 20 sanften Stößen das homogenisierte Gewebe durch 70-Mikrometer-Zellsiebe in einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße filtrieren und die Proben 5 bis 7 Minuten bei 834 × g und 4 °C zentrifugieren.

Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie das Gehirn- und Rückenmark-Homogenat von zwei bis drei Mäusen in fünf bis sieben Milliliter 70 %iger Percoll-Lösung. Dann überlagern Sie sieben Milliliter 40 %iger Percoll-Lösung und zentrifugieren die Percoll- und Zelllösung 30 Minuten bei 850 × g und 20 °C ohne Bremsung. Verwerfen Sie die beschädigten Zellen sowie Milz und Trümmer an der Oberfläche der 70 %igen Percoll-Lösung.

Sammeln Sie dann die mononukleären Zellen an der Grenzfläche zwischen den 70 % und 40 % Per-Call-Lösungen und verdünnen Sie die gesammelten Zellen in PBS, mindestens im Verhältnis 1:1. Nach dem Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in einem halben Milliliter PBS und überführen Sie es in ein 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen. Geben Sie zunächst 50 Mikroliter der dichtegradientengereinigten Zellen in ein neues 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen und fügen Sie 350 Mikroliter Fax-Puffer hinzu.

Danach 5 bis 10 Mikroliter Anti-FCR-Antikörper zum Röhrchen hinzufügen und die Zellen 10 bis 15 Minuten auf Eis inkubieren. Die Zellprobe auf zwei Eppendorf-Röhrchen aufteilen, wobei eine Probe in ein Röhrchen gegeben wird. Ein Mikroliter Anti-CD11b- und zwei Mikroliter Anti-CD45-Antikörper hinzufügen.

Die Zellen weitere 10 bis 15 Minuten auf Eis inkubieren. Das zweite Röhrchen als Negativkontrolle beschriften und auf Eis stellen. Nach der Inkubation mit den Färbungsantikörpern ein Milliliter Fax-Puffer zu beiden Röhrchen hinzufügen und die Zellen in einer Mikrozentrifuge fünf Minuten bei 1200 ×g abzentrifugieren.

Danach die Pellets in 400 Mikrolitern 1 % Paraformaldehyd in PBS fixieren und die Röhrchen vortexen, um Verklumpungen zu vermeiden. Abschließend die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysieren, wobei als Negativkontrolle die Zellprobe und BD™ CompBeads verwendet werden. Beginnen Sie mit der subkutanen Immunisierung einer Gruppe von fünf bis zehn C57BL/6-Mäusen im Alter von acht bis zwölf Wochen mit 150 Milligramm MOG 35–55-Peptid in vier Milligramm pro Milliliter komplettem Freund-Adjuvans, um EAE zu induzieren. Anschließend wird am Tag null und am Tag zwei nach der Immunisierung Pertussis-Toxin intraperitoneal verabreicht.

Nach der Isolierung und Färbung der Zellen wie gerade gezeigt, resuspendieren Sie die Pellets kurz vor der Sortierung in 400 Mikrolitern PBS anstelle von Fixansatz. Füllen Sie dann zwei 1,7-Milliliter-Einwegröhrchen mit jeweils 300 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 10 % FBS, zur Sammlung der Proben. Sortieren Sie abschließend die Mikroglia- und Makrophagenpopulationen mit hoher Reinheit unter Verwendung der in diesem repräsentativen Dichtediagramm dargestellten Gating-Strategie.

Nach der Sortierung analysieren Sie erneut die Mikroglia- und Makrophagenpopulationen, um die Reinheiten der isolierten Zellproben zu bestimmen. Nachdem Sie die sortierten Zellpopulationen in einer Mikrozentrifuge fünf bis sieben Minuten lang mit 1200 × g abzentrifugiert haben, entfernen Sie vorsichtig das Überstand und frieren die Zellpellets auf Trockeneis ein. Danach überführen Sie die gefrorenen Zellpellets auf normales Eis.

Zum Auftauen 300 µL Lysepuffer aus einem Nirvana-Kit hinzufügen und die Zelllösung anschließend vorsichtig durch fünf bis siebenmaliges Pipettieren mischen. Danach 30 µL des Homogenisatzusatzes hinzufügen, die Zellsuspension 30 Sekunden lang vortexen und die Röhrchen anschließend 10 Minuten auf Eis stellen. Nun 300 µL des sauren Phenols, Chloroform, hinzufügen und das Röhrchen weitere 30 Sekunden vortexen.

Danach die Zellen bei 9.500 × g fünf Minuten lang zentrifugieren und vorsichtig die oberen 300 Mikroliter des Überstandes, der die wässrige Phase enthält, in ein neues 1,7-Milliliter-Einwegröhrchen überführen. Die Lösung mit 375 Mikrolitern 100 %igem Ethanol mischen. Den gesamten Inhalt des Röhrchens in eine Filterkassette aus dem Nirvana-Kit übertragen und die Kassette eine Minute lang bei 9.500 × g zentrifugieren. Anschließend den Durchlaufpuffer verwerfen.

Fügen Sie 700 Mikroliter Waschlösung 1 aus dem Nirvana-Kit hinzu und zentrifugieren Sie nach dem Waschen der Säule weitere Minute bei 9.500 × g. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern Waschlösung 2 aus dem Nirvana-Kit. Eluieren Sie die RNA aus der Säule mit 60 Mikrolitern vorgewärmtem nukleasefreiem Wasser.

Verwenden Sie abschließend ein NanoDrop-Spektrophotometer, um die Reinheit und Menge der RNA zu bewerten, nachdem eine Echtzeit-Q-R-T-P-C-R durchgeführt wurde, um mikro-RNA in den Mikroglia- und Makrophagen-Proben nachzuweisen. P-R-T-P-C-R-Kurven für fluoreszenzmarkierte Mere-1-24- und Snow-RNA-55-PCR-Produkte können wie hier im ersten Diagramm dargestellt erstellt werden. Typische Kurven für die Menge an fluoreszenzmarkierten spezifischen PCR-Produkten für Kontroll-Snow-RNA-55-RNA-Proben, die aus Mikroglia oder aus Knochenmark stammenden Makrophagen isoliert wurden, im Vergleich zur Anzahl der PCR-Zyklen sind dargestellt.

Beachten Sie, wie die CT-Werte zur Analyse der Expression von snow RNA 55 aus den verschiedenen Zellpopulationen am Schnittpunkt der Basislinie mit dem unteren Bereich des linearen Bereichs der Q-R-T-P-C-R-Kurven bestimmt werden, wie in der Grafik durch die grünen und blauen vertikalen Linien angezeigt. In diesem zweiten Diagramm ist die Menge an fluoreszenzmarkierten spezifischen PCR-Produkten für die experimentellen mere 1 24 RNA-Proben aus Mikroglia oder aus Knochenmark stammenden Makrophagen in Abhängigkeit von der Anzahl der PCR-Zyklen dargestellt. Beachten Sie, wie die CT-Werte zur Analyse der Expression von mere 1 24 aus den verschiedenen Zellpopulationen erneut am Schnittpunkt der Basislinie mit dem unteren Bereich des linearen Bereichs der Q-R-T-P-C-R-Kurven bestimmt werden, wie in der Grafik durch die grünen und blauen vertikalen Linien angezeigt.

Nach der Bestimmung der CT-Werte für jede Probe, wie für die Expression von snow RNA 55 und mere 1 24 in Mikroglia und BM-dms von gesunden und EAE-Mäusen in dieser Tabelle dargestellt, subtrahieren Sie den CT-Wert der Kontrollprobe snow RNA 55 vom CT-Wert der experimentellen Probe mere 1 24, um die Delta-CT-Werte für jedes Duplikat jeder Probe zu berechnen. Anschließend subtrahieren Sie den Delta-CT-Wert der Referenzprobe von den Delta-CT-Werten der anderen Proben, um die Delta-Delta-CT-Werte zu berechnen. Schließlich wird der relative Expressionsgrad jeder Probe als zwei hoch minus Delta-Delta-CT berechnet, wie in diesem Dichtediagramm dargestellt.

Im Fall einer guten Isolierung von Mikroglia aus dem normalen ZNS repräsentieren 95 bis 98 % der Zellen CD11b-positive, CD45-low Mikroglia, wobei zwei bis 5 % der Zellsuspension aus CD11b-positiven, CD45-high perivaskulären Makrophagen bestehen; weniger als 1 % CD11b-negativer, CD45-high Lymphozyten oder CD11b-negativer, CD45-negativer Astroglia- oder Oligodendrozyten-Gliazellen oder Zellfragmente sind vergleichsweise in einer schlechten Präparation vorhanden. Es liegt eine erhebliche Kontamination durch CD11b-negative, CD45-negative Zellen oder Zellfragmente wie Astroglia oder Myelinpartikel vor, wodurch die Zellen für die RNA-Isolierung und weitere Analysen ungeeignet sind. Zusätzlich können auch CD11b-negative, CD45-hohe Zellen vorhanden sein, was auf eine Kontamination durch Blutlymphozyten infolge unzureichender Perfusion hinweist. In diesem Dichtediagramm sind die drei Zellpopulationen dargestellt, die im ZNS während einer Neuroinflammation auftreten: CD11b-positive, CD45-low Mikroglia, CD11b-positive, CD45-high Makrophagen und CD11b-negative, CD45-high Lymphozyten.

Die Qualität der RNA, bestimmt durch Gelelektrophorese nach einer guten im Vergleich zu einer schlechten Isolierung, wird gezeigt. Wenn die RNA sauber isoliert wird, sind eine RNA-Leiter und ribosomale RNA erkennbar; bei einer schlecht durchgeführten Isolierung hingegen treten Schmierungen und Abbauprodukte mit niedrigem Molekulargewicht in Erscheinung. Diese abschließenden Daten zeigen die Expression von lediglich 1 24 in normalen adulten Mikroglia, Mikroglia von Mäusen mit EAE sowie Mikroglia, die aus Mäusen in frühen Entwicklungsstadien isoliert wurden.

In diesem ersten Balkendiagramm ist die relative Expression von mere 1 24 in Mikroglia aus dem normalen ZNS deutlich höher im Vergleich zu der bei aus Knochenmark stammenden Makrophagen beobachteten. Ebenso steigt zwar die Menge an mere 1 24-RNA in Makrophagen aus dem ZNS von Mäusen mit EAE, doch Mikroglia exprimieren weiterhin die fünffache Menge an mere 1 24-RNA. Dieses letzte Balkendiagramm zeigt, wie Veränderungen in der Expressionshöhe von mere 1 24 in Mikroglia während der Entwicklung von Mäusen im Alter von ein, zwei und vier Wochen im Vergleich zu erwachsenen acht Wochen alten Mäusen ebenfalls mithilfe dieser Methode bewertet werden können, während des Verfahrensversuchs.

Es ist wichtig, eine ausreichende Menge und eine hohe Qualität isolierter Zellen zu haben, was gute Ergebnisse für das gesamte Experiment gewährleistet.