Name: Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Lernen Sie die Real-time PCR-Methode zur Analyse von microRNAs in Mikroglia während Neuroinflammation. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von microRNA-Expression im ZNS und liefert wertvolle Einblicke in immunologische Prozesse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Arbeit wurde durch die NIH R01 NS071039-01A1 Forschungsstipendium unterstützt.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Kürzlich wurde großes Interesse an Mikroglia und Beteiligung dieser Zellen bei vielen Erkrankungen, die mit Neuroinflammation und Neurodegeneration verbunden gegeben. Darüber hinaus wurde die Rolle von microRNAs bei der Differenzierung von Immun-und Krebszellen sich in den letzten Jahren gewachsen 5,10. Wir haben zuvor die Rolle der miR-124 in der Wartung von nicht-aktivierten oder ruhenden Phänotyp der Mikroglia im normalen ZNS-7 berichtet, aber die Rolle der anderen Arten von Mikro-RNAs in Mikrog...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> 7,2-7,4: Kann aus trockenen Komponenten im Labor, pH-Wert hergestellt werden </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> 7,2-7,4: Kann aus trockenen Komponenten im Labor, pH-Wert hergestellt werden </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana Kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml 100% Percoll wird durch Mischen von 10 ml 10X PBS und 90 ml Percoll hergestellt von Sigma. 50 ml von 70% Percoll isthergestellt durch Mischen von 35 ml 100% Percoll und 15 ml DMEM 50 ml 40% Percoll wird, indem man 20 ml 100% Percoll und 30 ml 1X PBS hergestellt </td></tr><tr><td> MOG-Peptid 35-55 </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Pertussis-Toxin </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR blockierende Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAk </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Kann mit unterschiedlichen Fluorophoren (zB AF488) verwendet werden </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mABs </td><td> BioLegend </td><td> 103116 </td><td> Kann mit unterschiedlichen Fluorophoren (zB APC) verwendet werden </td></tr><tr><td> ParaformalBenzaldehyd (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Verdünnen 01.15 in 1X PBS </td></tr><tr><td> 15% TBE-Harnstoff-Gel </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Reverse Transkription-Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Assays MMU-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Nuklease-freies Wasser </td></tr><tr><td> 384-Well-Platte klare optische Reaktion </td&gt; <td> Life Technologies Inc. </td><td> 4309849 </td><td> Kann mit anderen Platten (z. B. 96-Well-Platte) in verschiedenen Real-Time PCR Instrumente ersetzt werden </td></tr><tr><td> Dounce-Homogenisator (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / Glas </td></tr><tr><td> 40 μ Nylon Zellsieb </td><td> Falke </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Big Zentrifuge </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotordurchmesser 18,5 cm </td></tr><tr><td> Kleinzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotordurchmesser 6,5 cm </td></tr><tr><td> Real-time PCR-Instrument </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Kann mit anderen Instrumenten ersetzt werden </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Kann mit anderen Instrumenten ersetzt werden </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Kann mit anderen Instrumenten ersetzt werden </td></tr><tr><td> Nanodrop Spektralphotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von micrornas in mikroglia durch real-time pcr in normal-und zns während neuroinflammation

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Mikroglia sind Zellen der myeloischen Linie, die im zentralen Nervensystem (ZNS) 1 befinden. Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathologie vieler Krankheiten, die mit Neuroinflammation wie Multiple Sklerose (MS) 2 verbunden ist. Mikroglia bei einem normalen ZNS auszudrücken Makrophagen-CD11b und weisen eine Ruhestätte Phänotyp durch die Expression niedrigen Aktivierungsmarker wie CD45. Während pathologischen Prozessen im ZNS, werden Mikroglia aktiviert, bestimmt durch Hochregulation von CD45 und andere Marker 3. Die Faktoren, die Mikroglia-Phänotyp und Funktionen im ZNS betreffen sind nicht gut untersucht. MicroRNAs (miRNAs) sind eine wachsende Familie von konservierten Molekülen (~ 22 Nukleotide lang), die in vielen normalen physiologischen Prozesse wie Zellwachstum und Differenzierung 4 und Krankheiten wie Entzündungen 5 beteiligt sind. MiRNAs herunterregulieren die Expression bestimmter Zielgenen durch Binden komplementärer Sequenzen derir mRNAs und spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des angeborenen Immunsystems Zellen, einschließlich Makrophagen 6 und Mikroglia 7. Um miRNA-vermittelten Pfade, die Mikroglia-Phänotyp, biologische Funktion zu definieren, und Mikroglia von anderen Arten von Makrophagen zu unterscheiden zu untersuchen, ist es wichtig, quantitative Erfassung der Expression bestimmter microRNAs in verschiedenen Teilmengen von CNS-ansässigen Mikroglia. Gängige Methoden zur Messung der Expression von miRNAs im ZNS gehören quantitative PCR aus ganzen neuronalen Gewebe und in situ Hybridisierung. Allerdings ist die quantitative PCR aus ganzen Gewebehomogenat nicht zulassen, die Bewertung der Expression von miRNA in Mikroglia, die nur 5-15% der Zellen des neuronalen Gewebes darstellen. In-situ-Hybridisierung erlaubt die Beurteilung der Expression von microRNA in spezifischen Zelltypen in den Gewebeschnitten, aber diese Methode ist nicht ganz quantitativ. In diesem Bericht beschreiben wir eine quantitative und Sensitive Methode zum Nachweis von miRNA durch real-time PCR in Mikroglia von normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Mausmodell für MS isoliert. Das beschriebene Verfahren wird nützlich sein, um die Höhe der Expression von microRNAs in Mikroglia im normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit verschiedenen Pathologien wie MS, Schlaganfall, traumatische Verletzungen, die Alzheimer-Krankheit und Hirntumoren zu messen.

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Mikroglia sind Zellen der myeloiden Linie, die im zentralen Nervensystem (ZNS) residieren1. Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei Pathologien vieler ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von Mikro-RNA in Mikroglia zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn und das Rückenmark präpariert und anschließend das Gewebe des zentralen Nervensystems oder CNS homogenisiert wird. Im zweiten Schritt werden mononukleäre Zellen aus dem CNS mittels einer Percoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend die Mikroglia-Population durch FACS identifiziert.Anschließend wird die RNA der Mikroglia isoliert und die Qualität der Probe analysiert. Schließlich wird eine Echtzeit-PCR für das spezifische Mikro-RNA-Molekül von Interesse durchgeführt. Letztendlich kann die Delta-Delta-CT-Methode verwendet werden, um den relativen Expressionsgrad eines bestimmten Mikro-RNAs in Mikroglia darzustellen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie entweder nicht genügend mononukleäre Zellen aus dem ZNS isolieren können oder da die Probe mit Myelin und zellulärem Detritus kontaminiert ist. Beide Fälle führen zu einer Vorbereitung geringer Qualität, entweder aufgrund einer niedrigen RNA-Konzentration oder einer Proteinkontamination. Die Durchführung

detection-micrornas-microglia-real-time-pcr-normal-cns-during

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Mikroglia (Immunzellen des Gehirns), werden als Ersatz-Biosensor verwendet, um zu bestimmen, wie Nanopartikel die Neurotoxizität beeinflussen. Wir beschreiben eine Reihe von Experimenten, die darauf ausgelegt sind, die Reaktion von Mikroglia auf Nanopartikel und die Exposition von hypothalamischen Neuronen gegenüber Überständen aus aktivierten Mikroglia zu testen, um die Neurotoxizität zu bestimmen.

Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur chronischen in vivo Beobachtung der ruhenden Mikroglia im Hippocampus CA1 der Maus mittels präzise kontrollierter Chirurgie und Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung  

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

Die Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) ist eine benutzerfreundliche Analysepipeline, die keine Programmierkenntnisse erfordert und die Analyse der einzelnen Mikroglialmorphologie aus Immunfluoreszenzbildern halbautomatisiert. Validiert in einem von Nagetieren induzierten Lipopolysaccharid-induzierten Neuroinflammationsmodell, erkennt MMPS reproduzierbar aktivierungsassoziierte morphologische Veränderungen und ermöglicht eine standardisierte, skalierbare mikrogliale Phänotypisierung.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Ein Open-Source-, benutzerfreundliches Werkzeug zur quantitativen Analyse der Mikrogliamorphologie

Lernen Sie die Real-time PCR-Methode zur Analyse von microRNAs in Mikroglia während Neuroinflammation. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von microRNA-Expression im ZNS und liefert wertvolle Einblicke in immunologische Prozesse.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Weitere Videos entdecken