High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, rekombinante His-markierte Proteine hochdurchsatzfähig zu reinigen, indem ein automatisiertes Protokoll auf einer Robotikplattform verwendet wird. Dies wird erreicht, indem die Proteine zunächst in E. coli unter Verwendung von Kulturen mit geringem Volumen überexprimiert werden. Anschließend werden die Zellen chemisch lysiert, um die Freisetzung der Proteine zu bewirken, die dann an magnetische Nickel-Behälter binden.

Anschließend werden die Kügelchen gewaschen, um kontaminierende Proteine zu entfernen und die Reinheit der gewünschten Proteine zu erhöhen. Schließlich werden die Proteine von den magnetischen Kügelchen gereinigt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Konzentration und Reinheit der Proteine mittels BCA-Assays und SDS-Gelelektrophorese sowie zusätzlicher funktioneller Assays zur Bestimmung der Proteinaktivität zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir nun eine große Anzahl von Proteinen unter identischen Bedingungen mit minimalem Aufwand reinigen können. Dies ermöglicht es uns, eine hohe Reproduzierbarkeit zu erzielen und menschliche Fehler weitgehend auszuschließen. Diese Methode eignet sich besonders gut zur Untersuchung einer großen Anzahl von Punktmutationen eines bestimmten Proteins, da sichergestellt ist, dass Unterschiede in der Aktivität des Proteins tatsächlich auf die Mutation und nicht auf Variabilitäten bei der Probenvorbereitung zurückzuführen sind.

Um vornächtliche Bakterienkulturen vorzubereiten, füllen Sie zunächst 24-Loch-Platten mit Wasser und bestrahlen Sie diese zwei Minuten lang in der Mikrowelle, um sie zu sterilisieren. Entsorgen Sie das Wasser und bestrahlen Sie die Platten erneut zwei Minuten lang in der Mikrowelle. Inokulieren Sie 1,5 Milliliter Autoinduktionsmedium, das eine Mischung aus Glukose und Laktosereserve enthält, mit frisch gezüchteten, lac-induzierbaren BL 21 Rosetta zwei Bakterienkolonien oder eingefrorenen Glycerinbeständen. Verwenden Sie jeweils drei Löcher für positive und negative Kontrollen sowie ein Loch mit Medium allein als Kontrolle.

Züchten Sie die Zellen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 250 U/min. Entfernen Sie den Deckel und stellen Sie die Platte auf die Roboterplattform. Die Plattform verfügt über einen Greifarm zum Bewegen von Objekten von einer Position zu einer anderen, einen Pipettierarm sowie verschiedene Positionen für Platten und Troughs, einschließlich einer Schüttelplattform, eines Magnetrührers mit Magnetperlen und einer magnetischen Plattform.

Für 96-Well-Platten bereiten Sie die Wasch- und Verdünnungspuffer für das Reinigungsverfahren gemäß dem schriftlichen Protokoll vor, wobei Sie 100 Milliliter destilliertes Wasser und 15 Mikroliter eines Antischaumreagenz verwenden. Bereiten Sie eine Lösung zur Verdünnung von Übernachtkulturen für die optische Dichtemessung vor. Stellen Sie eine Lysepufferlösung her, die Fast-Break-Reagenz Lyase und Magnesiumacetat enthält, und bereiten Sie die BCA-Proteinbestimmungslösung vor.

Da sich TF two B dazu neigt, an den Pipettiernadeln anzulagern, bereiten Sie eine sechsmolare Guaninhydrochlorid-Lösung zur Reinigung vor. Füllen Sie Troughs oder Platten passender Größe mit den entsprechenden Puffern und platzieren Sie diese an ihren vorab zugewiesenen Positionen auf der Robotikplattform. Stellen Sie eine 24-Loch-Platte für den Guaninhydrochlorid-Abfall, zwei klare 96-Loch-Platten für die OD600- und Absorbanzmessungen sowie eine blaue 96-Loch-Platte für die gereinigten Proteine bereit.

Stellen Sie eine 96er-Tieflochplatte auf den Magnethalter. Verdünnen Sie die Magna-Haar-Nickel-Partikel mit Wasser und geben Sie sie zur Bead-Stirring-Einheit hinzu. Schalten Sie den Rührer ein, um die Perlen in Suspension zu halten.

Schalten Sie die Roboterplattform ein und spülen Sie die Pipettiernadeln mehrere Minuten lang durch. Um Luftblasen zu entfernen, stellen Sie die Platte auf eine Schüttelplattform, um das Wachstum der Übernachtkulturen zu überprüfen. Verdünnen Sie 10 Mikroliter Kultur in 90 Mikrolitern Verdünnungslösung, während Sie die Pipetten zwischen den Zugaben spülen.

Anschießend die Dichte bei OD 600 messen, wenn die Kulturen ähnliche Dichten erreicht haben. 100 µL der magnetischen Nickelpartikelsuspension in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte überführen, danach 900 µL jeder Kultur in die Vertiefungen geben und die Pipetten zwischen den Schritten spülen. Dann 100 µL der Fast-Break-Lyase-Mischung hinzufügen.

Platzieren Sie die Platte auf der Schüttelplattform bei 800 U/min für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen lyse zu lassen und die His-markierten Proteine an die Perlen binden zu lassen, um die Perlen zu waschen. Überführen Sie sie in eine 96-Loch-Platte auf einem Ständer mit magnetischen Stäben, die die Perlen von den Zentren der Löcher wegziehen, entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie sechs Mo iGuide-Hydrochlorid, um die Pipettenspitzen zu waschen. Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter Waschpuffer zu den Vertiefungen der 24er-Platte hinzu.

Scheibenplatte und übertragen Sie die Proben in die 96er-Platte. Entfernen Sie dann das Überstand. Geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer zur 96er-Platte hinzu.

Schale mit Vertiefungen. Überführen Sie die Schale auf den Schüttler und schütteln Sie die Schale eine Minute lang kräftig. Danach stellen Sie die Schale zurück auf den Magnethalter und entfernen Sie den Waschpuffer.

Nach dem letzten Waschschritt 100 µL Elutionspuffer zu den Kügelchen geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur kräftig schütteln. Anschließend das Eluat in eine neue Platte überführen. Um die Proteinproben zu quantifizieren, 190 µL BCA-Reagenz in die Vertiefungen einer klaren 96-Loch-Platte geben und jeweils 10 µL der Proteinproben zu den Vertiefungen hinzufügen.

Die Proben mindestens fünf Stunden inkubieren und die Extinktion mit einer Reihe von BSA-Standards messen. Die Proteine werden anschließend bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Das Reinigungsprotokoll umfasst zwei Qualitätskontrollstufen.

Zunächst im Stadium des bakteriellen Wachstums und später bei der Bewertung der Proteinausbeute. Durch die Reinigung der Proteine im Dreifachansatz kann sichergestellt werden, dass etwaige Variationen in den funktionellen Assays auf die mutanten Phänotypen und nicht auf experimentelle Schwankungen oder fehlgeschlagene Reinigungen zurückzuführen sind. Die Ausbeuten liegen typischerweise zwischen 50 und 200 Mikrogramm und sind mehr als ausreichend für funktionelle Assays. Ist die Methode einmal beherrscht, dauert sie nur etwa drei Stunden, und abgesehen vom Einrichten der Plattform, dem Ansatz der Kulturen und dem Sammeln der gereinigten Proteine, ist nichts weiter zu tun.

Nach diesem Verfahren können Funktionsanalysen durchgeführt werden. In unserem Fall handelt es sich dabei um eine Reihe von Transkriptionsanalysen, um zu untersuchen, wie die Mutation von TF two B ihre Wirkung auf die katalytische Aktivität der ar-Polymerase verändert.