Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Das Ziel dieses Videos ist es, ein Verfahren zur Charakterisierung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs zu beschreiben. Schlechte Öffnung in den Mitochondrien, isoliert aus dem Mausherz. Zunächst werden Mitochondrien aus Mäuseherzen isoliert.

Mit der Differenzialzentrifugationsmethode wird dann die Qualität der isolierten Mitochondrien mit einer oxythermischen Sauerstoffelektrode beurteilt, die mit einem Computer verbunden ist, um das Atmungskontrollverhältnis zu messen und die Integrität der Mitochondrienmembran zu bewerten. Anschließend wird mit spektrofluormetrischen Instrumenten die gleichzeitige Messung der Kalziumhandhabung, des mitochondrialen Membranpotentials und des mitochondrialen Volumens verwendet, um den Permeabilitätsübergang zu bestimmen. Schlechte Eröffnung.

Die daraus resultierenden Daten zeigten Unterschiede in der Kalziumretentionskapazität und dem Übergang der mitochondrialen Permeabilität. Schlechte Empfindlichkeit isolierter Mitochondrien, Öffnung des Übergangs zur mitochondrialen Permeabilität. Die Pore ist ein komplexes Phänomen, das Veränderungen auf mehreren Ebenen in der mitochondrialen Physiologie und Anatomie mit sich bringt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Messung mehrerer Parameter gleichzeitig ein umfassenderes Bild des Phänomens bietet als die alleinige Messung einzelner Parameter wie Kalzium, Mobilisierung oder Schwellung. Tauen Sie vor Beginn des Eingriffs den mitochondrialen Isolationspuffer auf und überprüfen Sie den pH-Wert, der 7,4 betragen sollte. Lege dann alle Puffer, Schalen und Röhren, die verwendet werden sollen, auf Eis. Beachten Sie, dass alle Schritte des Mitochondrien-Isolationsprotokolls auf Eis durchgeführt werden müssen.

Legen Sie die Herzen von euthanasierten Mäusen auf eine Petrischale und spülen Sie das Blut mit kalten Mitochondrien ab. Isolations-Puffer. Übertragen Sie dann die Herzen mit einer Klinge in eine neue Petrischale, entfernen Sie das Fett und die Vorhöfe und hacken Sie die Herzen, bis ein homogenes Produkt entsteht.

Die gehackten Herzen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben. Fügen Sie 10 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Tripsin hinzu und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis verdauen. Beachten Sie, dass die Verwendung von Trypsin die Ausbeute an isolierten Mitochondrien erhöht und zwischen der mitochondrialen Zubereitung konstant gehalten werden sollte.

Wir empfehlen jedoch, die Funktionalität der isolierten Mitochondrien an Präparaten zu testen, die in Abwesenheit von Trypsin erhalten wurden, um sicherzustellen, dass das Enzym ihre Ionen nicht beeinträchtigt. Nach der Inkubation 10 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer mit 0,1 % fettsäurefreiem, BS-, a- und fünf Milligramm Trypsin-Inhibitor hinzufügen und mischen, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen Um das Trypsin zu neutralisieren, erholen Sie das verdaute Gewebe mit niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit. Zentrifugation für eine Minute bei vier Grad Celsius.

Nach der Spin-Resus wird das Gewebe in acht Millilitern Mitochondrien-Isolationspuffer mit 0,1 % fettsäurefreiem BSA suspendiert und die Probe auf Eis gehalten. Verwenden Sie einen motorisierten Tanzhomogenisator mit einem Teflonstößel, um die Probe in vier bis sechs Durchgängen bei 1.200 bis 1.400 U/min zu homogenisieren. Das Homogenat wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und bei 800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Zum Pelletieren der Zellkerne und Gewebetrümmer. Nach dem Schleudern wird das Supinat, das die Mitochondrien enthält, in Mikrozentrifugenröhrchen gewonnen und bei 8.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach dem Schleudern hat das Pellet eine weiße Schicht darauf.

Verwenden Sie ein Vakuumsystem, um die weiße Schicht auf dem mitochondrialen Pellet vorsichtig abzusaugen und zu entfernen. Resuspendieren Sie dann das verbleibende dunklere Pellet, das die Mitochondrien in einem Milliliter Mitochondrien enthält. Isolations-Puffer.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Mitochondrien bei 8.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie das Supinat und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet. In 150 Mikrolitern Mitochondrien, Isolationspuffer, halten Sie die Mitochondrien auf Eis.

Die Atmung isolierter Mitochondrien wird mit einer oxythermischen Sauerstoffelektrode gemessen, die an einen Computer angeschlossen und durch Oxy gesteuert wird. Mit der Plus-Software sollte die Sauerstoffelektrode am Tag des Experiments kalibriert werden. Geben Sie zwei Milliliter Mitochondrien-Atmungspuffer mit einer Endkonzentration von einem mikromolaren Rotenon in die Oxy-Kammer, verschließen Sie die Kammer und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Sauerstoffsignals.

Das vom System aufgezeichnete und auf dem Computerbildschirm angezeigte Signal ist proportional zur Sauerstoffkonzentration in der Oxy Therm-Kammer. Sobald das Sauerstoffsignal stabil ist, fügen Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und zeichnen Sie die basale Atmung eine Minute lang auf. Die Atmung sollte zu diesem Zeitpunkt sehr gering sein, da die Mitochondrien auf endogenen Substraten anstreben.

Dies ist die Atmung des ersten Staates. Fügen Sie Succinat in einer Endkonzentration von fünf Millimolar hinzu, um die mitochondriale Atmung bei Komplex zwei zu initiieren, und zeichnen Sie das Signal eine Minute lang auf. Der Sauerstoffverbrauch sollte während der Atmung im zweiten Zustand ansteigen.

Um die Zustandsatmung zu induzieren, fügen Sie eine DP bis zu einer Endkonzentration von 150 Mikromolaren hinzu. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Sauerstoffverbrauch durch eine TP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung steigen. Zeichnen Sie das Signal auf, bis sich die Atmung verlangsamt, was auf einen DP-Verbrauch und den Übergang zum Atemaufzeichnungszustand vier hinweist.

Zustand vier, Atmung für mindestens eine Minute. Geben Sie CCCP bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolaren hinzu und zeichnen Sie das Signal eine Minute lang auf. Zu diesem Zeitpunkt sollte die ungekoppelte Atmung maximal sein.

Berechnen Sie das Atemkontrollverhältnis, indem Sie die Sauerstoffverbrauchsrate während des dritten Zustands dividieren. Die Atmung erfolgt durch die Sauerstoffverbrauchsrate während des vierten Zustands, die Atmung a Ziel-RCR sollte größer als vier sein. Als nächstes, um die Integrität der mitochondrialen Membran zu beurteilen, induzieren Sie die Atmung des dritten Zustands in einer neuen Probe von Mitochondrien, indem Sie eine DP zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen.

Zeichnen Sie dann den Sauerstoffverbrauch eine Minute lang auf, fügen Sie 10 mikromolare Cytochrom C hinzu und zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauch für zwei bis drei Minuten auf. Da Cytochrom C in einem guten mitochondrialen Präparat für intakte Mitochondrienmembranen undurchlässig ist, kommt es zu keiner oder nur einer sehr geringen Zunahme der Atmung. Eine Zunahme der Atmung deutet auf gebrochene oder beschädigte Mitochondrienmembranen hin.

Die Instrumentierung für die Multiparameter-Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangsöffnung besteht aus einem Quanten-Master-Dual-Emissions-Spektro-Fluorimeter-Computer, der vom Felix GX-Programm gesteuert wird. Erstellen Sie unter Verwendung des Felix GX-Programms ein Multidi-Erfassungsprotokoll und geben Sie die Parameter für die Messung des mitochondrialen Membranpotentials und der Quellung von Kalzium für das Verhältnis metrischer Farbstoffe ein, Forer und JC erzeugen die abgeleiteten Spuren für ein Verhältnis und JC ein Verhältnis in einem vierseitigen Einweg-Meth ACRL vete Mix einen Milliliter Mitochondrien-Assay-Puffer mit einer Endkonzentration von einem mikromolaren Rotenon, fünf Millimolare Succinate und 800 Nanomolare. Für eine FF fügen Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und legen Sie die Probe in den Probenraum des Spektrofluorimeters.

Beginnen Sie nach einer Minute mit der Aufzeichnung der Fluoreszenzsignale, unterbrechen Sie die Erfassung, fügen Sie 500 nanomolare JC hinzu und starten Sie dann die Erfassung erneut. Das JC-Eins-Verhältnis-Signal sollte zunehmen, was auf die Aufnahme durch aktive Mitochondrien hinweist. Fahren Sie mit der Aufnahme fort, bis JC ein Signal ein Plateau erreicht hat.

In der Regel innerhalb von fünf Minuten fügen Sie Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 20 Mikromolaren hinzu. Es sollte ein sofortiger Anstieg des Fluor-FF-Verhältnisses beobachtet werden, der eine erhöhte Kalziumpräsenz im Assay-Puffer darstellt, gefolgt von einer allmählichen Abnahme aufgrund der mitochondrialen Kalziumaufnahme. Das JC-Ein-Verhältnis-Signal sollte eine kurze vorübergehende Abnahme aufweisen, die auf eine leichte Depolarisation der mitochondrialen Membran hinweist.

Wenn das Signal des ER-FF-Verhältnisses wieder auf das Basalniveau zurückkehrt, in der Regel innerhalb von ein bis 1,5 Minuten bei weiteren 20 Mikromolar Calciumchlorid, pulsieren Sie in festen Intervallen weiter, bis die Mitochondrien kein Kalzium mehr akkumulieren können und beginnen, Kalzium in den Assay-Puffer freizusetzen. Die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsöffnung wird durch einen gleichzeitigen Anstieg des URA-FF-Verhältnis-Signals aufgrund der Kalziumfreisetzung visualisiert. Eine Abnahme des JC-Eins-Signalverhältnisses aufgrund eines Membranpotentialkollapses und eine Abnahme der Lichtstreuung aufgrund einer mitochondrialen Schwellung, mitochondriale Schwellung, während sie aus C 56 schwarzen sechs J-Mäusen isoliert wurde.

Wie in diesem Video gezeigt, wurde dann der Sauerstoffverbrauch während der Atmung im dritten Zustand in Gegenwart von Succinat und einem DP gemessen, und während der Atmung im vierten Zustand nach einem DP-Verbrauch, wie hier gezeigt, erhöhte eine DP-Zugabe den Sauerstoffverbrauch aufgrund der oxidativen Phosphorylierung und der Sauerstoffverbrauch verlangsamte sich. Sobald alle DP verbraucht wurden, wird die Reaktion der isolierten Mitochondrien auf die Entkopplung durch Zugabe von CCCP in Gegenwart von CCCP gemessen. Die Sauerstoffverbrauchsrate ist höher als bei der Atmung im dritten Zustand, um die Membranintegrität der isolierten Mitochondrien zu beurteilen.

Der Sauerstoffverbrauch wurde in Gegenwart von Succinat und einem DP gemessen, und nach der Zugabe von Cytochrom C.As hier zu sehen, erhöht die Zugabe von Cytochrom C den Sauerstoffverbrauch in Bezug auf ein DP und Succinat nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass intakte Mitochondrienmembranen nicht für Cytochrom C durchlässig sind, um den Übergang der mitochondrialen Permeabilität zu beurteilen, eine schlechte Öffnung in isolierten Herzmitochondrien als Indikator für die mitochondriale Calciumretentionskapazität. Übergang der mitochondrialen Permeabilität. Die schlechte Eröffnung wurde durch sequentielle Zugaben von 20 Mikromolaren ausgelöst.

Calciumchlorid, zusätzliches mitochondriales Calcium und Membranpotential wurden mit den ratiometrischen Indikatoren gemessen. URA FF als grüne Spur und JC eins als rote Spur der Mitochondrien wurden gemessen, indem die Lichtstreuung bei 525 Nanometern aufgezeichnet wurde, die durch die schwarze Spur gezeigt wurde. Die Spezifität der JC 1- und Quellsignale wurde mit einem Mikromolaren, CCCP und fünf Mikrogramm pro Milliliter des mikrobiellen Toxins Ethin getestet. Wie hier zu sehen ist, geht die Kalziumaufnahme durch die Mitochondrien mit einer leichten Depolarisation der Mitochondrienmembran einher.

Nach vier Calciumpulsen wird die Öffnung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangspools als Anstieg des URA FF angesehen, was auf eine Kalziumfreisetzung hinweist. Eine Abnahme des JC eins, die auf einen Kollaps des Membranpotentials hinweist, und eine Zunahme des mitochondrialen Matrixvolumens, was als Verringerung der Lichtstreuung als Marker für eine Schwellung angesehen wird, um die Spezifität der Öffnung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs zu überprüfen. Die gleichen Messungen wurden in Gegenwart von Cyclosporin A durchgeführt, das an die mitochondriale Permeabilitätsübergangskomponente Cyclofillin bindet D.As in dieser Abbildung gezeigt, erhöht die Anwesenheit eines mikromolaren Radfahrers, der A bohrt, die Anzahl der Calciumchloridimpulse, die erforderlich sind, um den mitochondrialen Permeabilitätsübergang PO im Vergleich zur Kontrollprobe zu öffnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangsöffnung in isolierten Herzmitochondrien beurteilen können. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Gewinnung von isolierten Mitochondrien von guter Qualität. Daher ist es wichtig, Qualitätskontrollmessungen durchzuführen, bevor Mitochondrien für weitere Experimente verwendet werden.