Name: Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Permeabilitätsübergangspore in isolierten Maus-Herzmitochondrien mit spektrofluorometrischen Methoden charakterisieren. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Messung von Calcium-Handling, Membranpotential und Volumen.

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Ein. Isolierung von Mitochondrien aus Maus Herz <ol><li> Zu isolieren Herzen Mitochondrien, zu betäuben und zu opfern Mäusen nach den Verfahren von Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. </li></ol> Hinweis: Alle Schritte der Mitochondrien isoliert Protokoll muss auf Eis durchgeführt werden. Verwenden eiskalten Puffer und vorgekühlten Petrischalen, Falcon-Röhrchen und Eppendorf-Röhrchen. Die Volumina im Protokoll angegeben ist, für eine Probe mit 2 Mäuseherzen. <ol start="2"><li> Entfernen Herzen, legen Sie sie in kaltem Mitochondrien Isolation Buffer (300 mM Saccharose, 10 mM Na-HEPES, 200 uM EDTA, pH 7,4) und abspülen Blut. </li></ol> Hinweis: Für optimale Ergebnisse der pH-Wert der mitochondrialen Puffer sollten mit KOH und Essigsäure eingestellt werden. <ol start="3"><li> Ort Herzen auf einem kalten Petrischale entfernen Fett und Atrien und Hackfleisch fein mit einem Messer bis zu erhaltenING ein homogenes Produkt. </li><li> Übertragen Hackfleisch Herzen einer 50 ml-Falcon-Röhrchen, 10 ml Mitochondrien Isolation Puffer mit 0,1 mg / ml Trypsin und damit die Probe auf Eis für 10 min zu verdauen. </li></ol> Anmerkung: Trypsin während des Isolierungsverfahrens erhöht die Ausbeute an isolierten Mitochondrien und sollte konstant gehalten zwischen mitochondrialen Präparationen werden. Wir empfehlen Testen mitochondrialen Funktionen auf Zubereitungen isoliert ist die Abwesenheit von Trypsin, um sicherzustellen, dass das Enzym nicht mit Funktionen stören. <ol start="5"><li> 10 ml Mitochondrien Isolation Puffer mit 0,1% Fettsäure free BSA und 5 mg Trypsin-Inhibitor (Soja) und mischen durch Invertieren des Röhrchens mehrmals, um das Trypsin zu neutralisieren. </li></ol> Hinweis: Mitochondrien Isolation Buffer kann im Voraus zubereitet werden und kann bei -20 ° C gelagert werden Überprüfen pH beim Auftauen. Trypsin, Trypsin-Inhibitor oder BSA muss seindded der Mitochondrien Isolation Puffer am Tag des Experiments. <ol start="6"><li> Wiederherstellen der verdaute Gewebe durch niedrige bis mittlere Geschwindigkeit Zentrifugation für 1 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Gewebe in 8 ml Mitochondrien Isolation Puffer mit 0,1% Fettsäure freies BSA und homogenisieren Verwendung eines motorisierten Dounce Homogenisator mit Teflon-Pistill (4-6 Durchläufen bei 1,200-14,00 rpm). Halten Sie die Probe auf Eis, während Homogenisieren. </li><li> Übertragen Homogenat in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 800xg 10 min bei 4 ° C bis Pellet Kerne und Gewebereste. </li><li> Wiederherstellen der Überstand mit dem Mitochondrien in Eppendorf-Röhrchen und Zentrifuge bei 8.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die obere weiße Schicht und waschen Sie die verbleibenden dunkleren Pellet die Mitochondrien in 1 ml Mitochondrien Isolation Buffer. </li><li> Zentrifugieren bei 8000 xg für 15 min bei 4 ° C. Überstand und resuspendieren Mitochondrien Pellet in 150 ul Mitochondriale Isolation Buffer. Keep on ice Mitochondrien für weitere Tests. </li></ol> Hinweis: Die besten Ergebnisse bei der funktionellen Assays verwenden Mitochondrien innerhalb von 4 Stunden der Isolation. <ol start="12"><li> Quantifizierung mitochondriale Protein mit dem Bradford-Assay. </li></ol> 2. Qualitätskontrolle von isolierten Mitochondrien 2,1. Messung der Atemwege Regelverhältnis (RCR) <ol><li> Kalibrieren Sie den Oxytherm Sauerstoff-Elektrode mit Luft-gesättigtem Wasser, um die maximale Sauerstoff-Linie zu etablieren. Wenn ein stabiles Niveau von Sauerstoff erhalten werden 100 ul einer frisch zubereiteten 10 mM Natriumhydrosulfit Lösung, um die Null Sauerstoff Linie festzulegen. Führen Sie Messungen bei 30 ° C. </li><li> 2 ml Mitochondrien Respiration Buffer (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl 2, 400 uM EGTA, 300 uM DTT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) mit 1 uM Rotenon der Oxytherm Kammer, versiegeln die Kammer und Start Recording. </li><li> Wenn Sauerstoff Signal stabil ist, fügen Sie 250 ug Mitochondrien und aufzeichnen Basalatmung für 1 min. Die Atmung sollte an dieser Stelle sehr niedrig sein wie Mitochondrien auf endogene Substrate (State 1 Atmung) werden atmenden. </li><li> Add 5 mM Succinat und Record-Signal für 1 min. Sauerstoffverbrauch sollte während State 2 Atmung erhöhen. </li><li> Erbrechen State 3 Atmung durch Zugabe von 150 uM ADP. An diesem Punkt Sauerstoffverbrauch erhöhen sollte aufgrund der ATP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung. Record-Signal, bis die Atmung verlangsamt, was auf ADP Verbrauch und Übergang zu 4 Atmung Zustand. Rekord State 4 Atmung für mindestens 1 min. </li><li> Fügen Sie 1 uM CCCP und Record-Signal für 1 min. Entkoppelt Atmung sollte maximal sein. </li></ol> Hinweis: Die Wirkung von CCCP auf die mitochondriale Atmung ist dosisabhängig: hohe Konzentrationen von CCCP können Sauerstoffverbrauch hemmen und sollten daher sorgfältig titrated. <ol start="7"><li> Berechnen Sie die Atemwege Regelverhältnis (RCR), indem Sauerstoffverbrauchsrate im Zustand 3 Atmung durch den Sauerstoff-Verbrauch während der State 4 Atmung. Ein Ziel RCR sollte ≥ 4 sein. </li></ol> 2,2. Beurteilung der mitochondrialen Membran Integrität (Cytochrom c-Test) <ol><li> Gründlich waschen Oxytherm Kammer mit 70% Ethanol und Wasser und wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Fügen Sie 1 mM ADP und aufzeichnen Sauerstoffverbrauch für 1 min. </li><li> Hinzufügen 10 uM Cytochrom c. Da Cytochrom c ist undurchlässig für intakte Membranen der Mitochondrien, zeigt eine Zunahme der Atmung gebrochen oder beschädigt mitochondrialen Membranen. </li></ol> 3. Messung der mitochondrialen Permeabilität Transition Pore Opening <ol><li> Richten Sie den Spektrofluorometer für die Multi-Parameter-Messung mtPTP Öffnung. Mit dem FelixGx Programm, erstellen Sie eine neue Hardware-Konfiguration (Quanta Master stetigen state), umfassend die Lichtquelle, Anregungsmonochromator, Probenkammer und zwei Detektoren bei 90 ° und 270 ° in Bezug auf die Anregung Monochromator (Abbildung 4) positioniert ist. Um eine maximale zeitliche Auflösung zu erreichen, müssen beide Emissionsmonochromatoren (90 ° und 270 °) deaktiviert und die Emissions-Filter bei 90 ° und 270 ° in den Probenraum in der Hardware-Konfiguration aktiviert haben. Dieser Schritt entfernt die Motorsteuerung der Emissionswellenlängen und beheben jeden Monochromator bei einer bestimmten Wellenlänge. Wenn die Emissionsmonochromatoren nicht deaktiviert sind, wird jeder Detektor Zyklus zwischen beiden Wellenlängen und doppelte Messungen werden aufgezeichnet. </li><li> Erstellen Sie eine neue Übernahme-Protokoll mit der Multi Dye und geben Sie die folgenden Farbstoffe: <ul><li> Fura (hohe Ca + +): Anregung 340 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li><li> Fura (low Ca + +): Anregung 380 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li><li> JC1 (Aggregat): Anregung 543 nm, Emission 595 nm (Detektor 2) </li><li> JC1 (Monomer): Anregung 498 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li><li> Schwellung: Anregung 525 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li></ul></li><li> Einstellen der Anregung und Emission Schlitze bis 1 nm und die Temperatur auf 37 ° C. </li><li> Um die ratiometrische Signal für Fura und JC-1 zu erhalten, erzeugen zwei abgeleiteten Spuren: Fura (hohe Ca + +) / Fura (low Ca + +) und JC1 (Aggregat) / JC1 (Monomer). </li><li> Manuelle Einstellung der Emissionswellenlänge von Detektoren 1 und 2 bis 525 nm und 595 nm auf. </li><li> Mix 1 ml Mitochondrien Assaypuffer (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) mit 1 uM Rotenon, 5 mM Succinat und 800 nM Fura FF in einem Einweg-4-seitige Methacrylat Küvette. Fügen Sie 250 ug Mitochondrien und Ort Probe im Probenraum. Stellen Sie sicher, dass der Magnetrührer eingeschaltet ist. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Nach 1 min Pause den Erwerb, 500 nM JC-1 und starten Sie den acquisition. Der JC-1-Ratio Signal sollte zu erhöhen, was darauf hinweist Farbstoffaufnahme durch aktive Mitochondrien. Aufnahme fortsetzen, bis JC-1-Signal ein Plateau (in der Regel innerhalb von 5 min) erreicht hat. </li><li> Hinzufügen 20 uM CaCl 2. Ein momentaner Anstieg der Fura FF Verhältnissignal sollte von der erhöhten Ca 2 + in der Gegenwart Assaypuffer, durch eine allmähliche Abnahme durch mitochondriale Ca 2 +-Aufnahme gefolgt beobachtet werden. Der JC-1-Ratio Signal sollte zeigen eine kurze vorübergehende Abnahme indikativ für leichte Mitochondrienmembran Depolarisation. </li><li> Warten Sie, bis Fura FF Verhältnis Signal wieder auf Basisniveau vor der Zugabe der anderen CaCl 2 Puls (1-1.5 min). Weiter pulsierenden in festen Intervallen, bis Mitochondrien nicht ansammeln können Ca 2 + und beginnen Loslassen Ca 2 + in die Assay-Puffer. mtPTP Öffnung ist durch eine gleichzeitige Erhöhung der Fura FF Verhältnissignal durch Ca 2 +-Freisetzung visualisiert, eine Abnahme in der JC-1-Signal-Verhältnisses aufgrund Membran potential Kollaps und eine Abnahme der Lichtstreuung aufgrund mitochondriale Schwellung (Abbildung 5). </li><li> Nach mtPTP Aktivierung, ob die Spezifität der Fura FF, JC-1 und Schwellungen, die jeweils mit 1 mM EGTA, 1 uM CCCP und 5 ug / ml Alamethicin. </li><li> Um die Spezifität der mtPTP Öffnung zu überprüfen, wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,9 in Gegenwart von 1 uM des Cyclophilin D Inhibitor Cyclosporin A (Cyclophilin D ist eine Komponente des mtPTP). In Anwesenheit von Cyclosporin A, das Öffnen des mtPTP benötigt erheblich mehr CaCl2 Impulse als Kontrollproben (Abbildung 6). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt eine typische respiratorische Kontrolle der isolierten Maus-Mitochondrien. Zustand 3 Beatmung wird durch Zugabe von ADP in Mitochondrien atmenden auf Succinat erreicht, und wird durch eine deutliche Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs bezüglich des Substra dadurchte allein. Abreicherung zugegeben ADP initiiert State 4 Atmung, bei dem Sauerstoffverbrauch verlangsamt und ist vergleichbar mit Raten vor ADP Zugabe erreicht. RCR wird berechnet, indem der Sauerstoff-Verbrauch für staatliche 3 Atmung durch, dass der Staat 4 Beatmung erhalten. Die Cytochrom c-Test wird verwendet, um Test der Integrität der äußeren Membran der Mitochondrien: wenn Cytochrom c zu Mitochondrien atmenden auf Succinat und ADP, keine weitere Zunahme der Atmung beobachtet wird hinzugefügt, was auf eine intakte äußeren mitochondrialen Membranen (Abbildung 3). Ein repräsentatives Bild für die mtPTP Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien ist in Abbildung 4 dargestellt. In diesem Fall mtPTP Öffnung wurde durch die Zugabe von 4 CaCl 2 Impulse (20 uM jedes) nach 1,5 min Intervallen ausgelöst. mtPTP Öffnung ist durch die gleichzeitige Freisetzung der Nähe der mitochondrialen Ca 2 + (Erhöhung Fura FF Verhältnissignal), Zusammenbruch mitochond scheinbarenrial Membranpotential (Abnahme der JC-1-Ratio-Signal) und erhöhte mitochondriale Volumen (Rückgang der Schwellung Signal). Wenn Cyclosporin A zugesetzt wird, welche an den D-Anteil des Cyclophilin bindet mtPTP erfordert mtPTP Öffnung 7 Impulsen von CaCl 2 anstelle von 4 (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufdiagramm des Multi-Parameter-mitochondrialer Permeabilitätsübergang Porenöffnung Protokoll für isolierte Mitochondrien. Herz von Mäusen geerntet und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Die mitochondrialen Präparation wird dann qualitativ durch polarographische Messung des respiratorischen Verstärkungsfaktor und Mitochondrienmembran Intaktheit in Anwesenheit von Cytochrom c ausgewertet. Mitochondriale permeability transition pore Öffnung in isolierten Mitochondrien wird durch sequentielle CaC ausgelöstl 2 Additionen und ist mit einem Spektrofluorometer durch Überwachung Ca 2 +-Freisetzung aus Mitochondrien-Membran möglichen Zusammenbruch und Schwellung der mitochondrialen Matrix gemessen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Abbildung 2. Messung Atemwege Regelverhältnis (RCR) von isolierten Herzen Mitochondrien. Sauerstoffverbrauch durch isolierte Mitochondrien während State 3 Atmung in Gegenwart von Succinat und ADP gemessen, und im Zustand 4 Atmung nach ADP Verbrauch. Die Reaktion des isolierten Mitochondrien Entkuppler wird durch die Zugabe von CCCP gemessen. Zahlen auf dem Graphen sind die Raten der Sauerstoffverbrauch durch isolierte Mitochondrien in nmol / min / mg Protein. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Abbildung 3. Measure<html> ment der Membran Integrität der isolierten Herzen Mitochondrien. Mitochondrienmembran Integrität wird durch Messen des Sauerstoffverbrauchs in isolierter Mitochondrien in Gegenwart von Succinat und ADP und nach der Zugabe von Cytochrom c bestimmt. Zahlen auf dem Graphen sind die Raten der Sauerstoffverbrauch durch isolierte Mitochondrien in nmol / min / mg Protein. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Abbildung 4. Spectrofluorometer Hardwarekonfiguration für die Multi-Parameter-Messung mtPTP Öffnung. Die Hardware-Konfiguration der Spektrofluorometer umfasst eine Lichtquelle, ein Erregungssignal-Monochromator, einen Probenraum und zwei Detektoren mit festen Emissionswellenlängen bei 525 nm und 595 nm liegt. Detektor 1 ist für die Signaldetektion von Fura FF hohen und niedrigen Ca 2 +, JC-1-Monomer und Aufblähen Signals verwendet wird. Detector 2 misst die JC-1 Summensignal. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Abbildung 5. Multi-Parameter-Messung mtPTP Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien. mtPTP Eröffnung wurde durch sequentielle Zugabe von 20 uM CaCl 2 ausgelöst und wurde von Ca 2, dadurch +-Freisetzung aus Mitochondrien, Mitochondrienmembranpotentials Zusammenbruch und erhöhten mitochondrialen Matrix Volumen (Schwellung). Extramitochondrialen Ca 2 + und Membranpotential wurden mit den ratiometrisch Indikatoren Fura FF (grüne Kurve) und JC-1 (rote Kurve) gemessen. Schwellung der Mitochondrien wurde durch Aufnahme Lichtstreuung bei 525 nm (schwarze Kurve) gemessen. Spezifität von JC-1 und Schwellungen Signale wurde mit 1 uM CCCP und 5 ug / ml Alamethicin (a mikrobiellen Toxin) getestet. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Abbildung 6. Multi-Parameter-Messung der mtPTP Öffnung in isolierten Mitochondrien in Gegenwart von Cyclosporin A. Cyclosporin A (1 uM) erhöht die Anzahl der CaCl 2 Impulse benötigt, um mtPTP in isolierten Mitochondrien öffnen.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt die notwendigen experimentellen Schritte permeability transition pore Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien (Abbildung 1 und Abbildung 4) zu beurteilen: das Verfahren zur Isolierung von Maus-Mitochondrien, die Atemwege Steuerelemente, die ihre Integrität und Funktionalität zu gewährleisten, die mitochondriale Parameter während überwacht mtPTP Öffnung und die Farbstoffe für ihre Messung eingesetzt, die Einrichtung des spektrofluorometrisch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Trypsin-Inhibitor (Sojabohne) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Natriumhydrosulfit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytochrom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyclosporin A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue Grinder Potter-Elvehjem mit Teflon Pistill 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Rührwerk </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperaturgesteuerten Sauerstoffelektrode) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 duale Emission Spektrofluorometer </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter-messung der durchlässigkeit transition pore opening in isolierten maus-mitochondrien

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Das mitochondriale Permeabilitätsübergang Pore (mtPTP) ein nicht spezifischen Kanal, der in der inneren mitochondrialen Membran bildet für gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht kleiner als 1,5 kDa transportieren. Obwohl die definitive molekulare Identität der Pore wird noch diskutiert, tragen Proteine ​​wie Cyclophilin D, VDAC und ANT zur Bildung mtPTP. Während die Beteiligung von mtPTP Öffnung in Zelltod gut 1 festgelegten vermehrt Hinweise darauf gibt, dass die mtPTP eine physiologische Rolle dient während mitochondriale Ca 2 +-Homöostase 2, Bioenergetik und Redox Signaling 3. mtPTP Öffnung durch Matrix Ca 2 + ausgelöst aber seine Aktivität kann durch verschiedene andere Faktoren, wie oxidative Stress, Adeninnucleotid Depletion, hohe Konzentrationen von Pi, Mitochondrienmembran Depolarisation oder Entkuppeln und langkettigen Fettsäuren 4 moduliert. In vitro mtPTP Öffnung kann ach seinieved durch Erhöhen Ca 2 +-Konzentration innerhalb der mitochondrialen Matrix durch exogene Zugabe von Ca 2 + (Calcium Retention Capacity). Wenn Ca 2 +-Spiegel in den Mitochondrien zu erreichen eine bestimmte Schwelle, wird das mtPTP und erleichtert Ca 2 +-Freisetzung, die Ableitung des Protons treibende Kraft, Membranpotential Kollaps und eine Erhöhung der mitochondrialen Matrix Volumen (Schwellung), die letztlich zum Bruch der äußeren Membran der Mitochondrien und irreversiblen Verlust der Organellen-Funktion. Hier beschreiben wir eine fluorimetrischen Assay, die für eine umfassende Charakterisierung der mtPTP Öffnung in isolierten Maus-Mitochondrien ermöglicht. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von 3 mitochondrialen Parameter verändert, wenn mtPTP Öffnung eintritt sind: mitochondrialen Ca 2 +-Handling (Aufnahme und Abgabe, wie durch Ca2 +-Konzentration im Testmedium gemessen), Mitochondrienmembranpotential und mitochondrial Volumen. Die Farbstoffe für Ca 2 +-Messung eingesetzt im Testmedium und Mitochondrienmembranpotential sind Fura FF, einer Membran impermeante, ratiometrisch Indikator, der eine Verschiebung in der Anregungswellenlänge in Gegenwart von Ca 2 + und JC-1, ein kationisches erfährt, ratiometrische Indikator, grün oder rot Monomeren Aggregate bildet bei niedrigen und hohen Membranpotential sind. Veränderungen im mitochondrialen Volumens erfolgt durch Aufnahme Lichtstreuung durch den mitochondrialen Suspension gemessen. Da qualitativ hochwertige, funktionelle Mitochondrien für die mtPTP Öffnung Assay erforderlich sind, beschreiben wir auch die notwendigen Schritte zu erhalten intakt, stark gekoppelte und funktionelle isolierten Herzen Mitochondrien.

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Handhabung, Mitochondrienmembranpotentials und mitochondriale Volumen. Das Verfahren zur Beantragung hochwertige und funktionale Herzmitochondrien wird ebenfalls beschrieben.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Die mitochondriale Permeabilitätsübergangspore (mtPTP) ist ein unspezifischer Kanal, der sich in der inneren Mitochondrienmembran bildet, um Solute mit ... zu transportieren.

Das Ziel dieses Videos ist es, ein Verfahren zur Charakterisierung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs zu beschreiben. Schwache Öffnung in Mitochondrien, isoliert aus Mausherz. Zunächst werden Mitochondrien aus Mäuseherzen isoliert.Mit der Methode der differenziellen Zentrifugation wird anschließend die Qualität der isolierten Mitochondrien mithilfe einer an einen Computer angeschlossenen Sauerstoffelektrode bewertet, um das Atmungskontrollverhältnis zu messen und die Integrität der mitochondrialen Membran zu beurteilen. Anschließend erfolgt mittels spektrofluorometrischer Geräte die gleichzeitige Messung des Kalziumhaushalts, des mitochondrialen Membranpotentials und des mitochondrialen Volumens, um den Permeabilitätsübergang zu bestimmen. Schlechte Öffnung.Die resultierenden Daten zeigten Unterschiede in der Kalzium-Retentionskapazität und der mitochondrialen Permeabilitätstransition. Geringe Empfindlichkeit isolierter Mitochondrien, Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätstransition. Die Pore ist ein komplexes Phänomen, das Veränderungen auf mehreren Ebenen der mitochondrialen Physiologie und Anatomie beinhaltet.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die gleichzeitige Messung mehrerer Parameter ein umfassenderes Bild des Phänomens bietet als die alleinige Messung einzelner Parameter wie Calcium, Mobilisierung oder Schwellung. Vor Beginn des Verfahrens den Isolationspuffer für Mitochondrien auftauen und den pH-Wert überprüfen, der 7,4 betragen sollte. Anschließend alle Puffer, Schalen und Röhrchen, die verwendet werden, auf Eis stellen. Beachten Sie, dass alle Schritte des Protokolls zur Mitochondrienisolation auf Eis durchgeführt werden müssen.Legen Sie die Herzen euthanisierter Mäuse auf eine Petrischale und spülen Sie mit kaltem Puffer für die Isolierung von Mitochondrien das Blut ab. Übertragen Sie die Herzen anschließend mit einem Skalpell auf eine neue Petrischale, entfernen Sie Fett- und Vorhofgewebe und zerkleinern Sie das Herzgewebe, bis ein homogenes Produkt vorliegt.Überführen Sie die zerkleinerten Herzen in eine 50-Milliliter-Kegelrohrflasche. Geben Sie 10 Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Trypsin hinzu und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis verdauen. Beachten Sie, dass die Verwendung von Trypsin die Ausbeute an isolierten Mitochondrien erhöht und zwischen verschiedenen Mitochondrienpräparationen konstant gehalten werden sollte.Es wird jedoch empfohlen, die Funktionalität der isolierten Mitochondrien an Präparationen zu überprüfen, die in Abwesenheit von Trypsin gewonnen wurden, um sicherzustellen, dass das Enzym ihre Ionen nicht beeinträchtigt. Nach der Inkubation 10 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer mit 0,1 % fettfreiem BS, a, und fünf Milligramm Trypsininhibitor hinzufügen und durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen des Probengefäßes mischen, um den Trypsin zu neutralisieren. Das digestierte Gewebe durch Zentrifugation bei niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit für eine Minute bei vier Grad Celsius gewinnen.Nach dem erneuten Vortexen suspendieren Sie das Gewebe in acht Milliliter Isolierungspuffer für Mitochondrien mit 0,1 % fettfreiem BSA und lagern die Probe auf Eis. Homogenisieren Sie die Probe mit einem motorisierten Dounce-Homogenisator und einem Teflon-Stößel durch vier bis sechs Durchgänge bei 1.200 bis 1.400 U/min. Überführen Sie das Homogenat in eine 15-Milliliter-Konikalflasche und zentrifugieren Sie es bei 800 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Um die Kerne und Gewebetrümmer zu pelletieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand, der die Mitochondrien enthält, in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 8.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation weist das Pellet eine weiße Schicht an der Oberseite auf.Entfernen Sie vorsichtig mithilfe eines Vakuumsystems die weiße Schicht auf dem mitochondrialen Pellet. Resuspendieren Sie anschließend das verbleibende dunklere Pellet, das die Mitochondrien enthält, in einem Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer.Zentrifugieren Sie anschließend die Mitochondrien bei 8.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 150 Mikroliter Mitochondrien-Isolierpuffer. Bewahren Sie die Mitochondrien auf Eis auf.Die Atmung isolierter Mitochondrien wird mit einer an einen Computer angeschlossenen und über die Oxy-Software gesteuerten thermischen Sauerstoffelektrode gemessen. Die Sauerstoffelektrode sollte am Tag des Experiments kalibriert werden. Geben Sie zwei Milliliter Mitochondrien-Atmungspuffer, der eine Endkonzentration von einem Mikromolar Rotenon enthält, in die Oxy-Kammer, verschließen Sie die Kammer und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Sauerstoffsignals.Das vom System aufgezeichnete Signal, das auf dem Computerbildschirm angezeigt wird, ist proportional zur Sauerstoffkonzentration in der Oxy-Therm-Kammer. Sobald das Sauerstoffsignal stabil ist, geben Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und registrieren Sie die basale Atmung für eine Minute. Die Atmung sollte an diesem Punkt sehr niedrig sein, da die Mitochondrien endogene Substrate veratmen.Dies ist die Atmung im Zustand eins. Geben Sie Succinat in eine Endkonzentration von fünf Millimolar hinzu, um die mitochondriale Atmung am Komplex zwei einzuleiten, und nehmen Sie das Signal eine Minute lang auf. Der Sauerstoffverbrauch sollte während der Atmung im Zustand zwei ansteigen.Um die Zustandsatmung auszulösen, geben Sie einen DP zu einer Endkonzentration von 150 µM hinzu. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Sauerstoffverbrauch aufgrund einer TP-Synthese über die oxidative Phosphorylierung ansteigen. Registrieren Sie das Signal, bis die Atmung langsamer wird, was auf den Verbrauch von DP und den Übergang zur Atmung im Zustand vier hinweist.Zustand vier, Atmung für mindestens eine Minute. Fügen Sie CCCP bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar hinzu und registrieren Sie das Signal für eine Minute. An diesem Punkt sollte die entkoppelte Atmung maximal sein.Berechnen Sie das Atmungssteuerungsverhältnis, indem Sie die Sauerstoffverbrauchsrate während des Zustands drei durch die Sauerstoffverbrauchsrate während des Zustands vier dividieren. Ein Ziel-RCR sollte größer als vier sein. Als Nächstes bewerten Sie die Integrität der mitochondrialen Membran, indem Sie in einer neuen Probe von Mitochondrien die Atmung im Zustand drei induzieren, indem Sie ADP auf eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen.Zeichnen Sie dann den Sauerstoffverbrauch eine Minute lang auf, geben Sie 10 µM Cytochrom C hinzu und zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauch zwei bis drei Minuten lang auf. Da Cytochrom C bei einer intakten mitochondrialen Präparation nicht in die mitochondrialen Membranen eindringen kann, wird kein Anstieg oder nur ein sehr geringer Anstieg der Atmung beobachtet. Ein Anstieg der Atmung weist auf beschädigte oder defekte mitochondriale Membranen hin.Die Instrumentierung für die multiparametrische Messung des Öffnens des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores besteht aus einem Quantum-Master-Dual-Emissions-Spektrofluorimeter, das über das Felix-GX-Programm computergesteuert wird. Erstellen Sie mit dem Felix-GX-Programm ein Multidi-Aufnahmeprotokoll und geben Sie die Parameter zur Messung von Kalzium, mitochondrialem Membranpotenzial und Schwellung für die ratiometrischen Farbstoffe Forer und JC-1 ein, um die abgeleiteten Spuren für das Verhältnis und das JC-1-Verhältnis in einer Einweg-Vierseiten-Meth-ACRL-Vete zu erzeugen. Mischen Sie ein Milliliter Mitochondrien-Assaypuffer mit einer Endkonzentration von einem Mikromolar Rotenon, fünf Millimolar Succinat und 800 Nanomolar For a FF, geben Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und stellen Sie die Probe in das Probenfach des Spektralfluorimeters.Beginnen Sie eine Minute später mit der Aufzeichnung der fluoreszierenden Signale, pausieren Sie die Aufnahme, geben Sie 500 Nanomolar JC-1 hinzu und starten Sie die Aufnahme dann erneut. Das JC-1-Verhältnissignal sollte ansteigen, was auf die Aufnahme durch aktive Mitochondrien hinweist. Setzen Sie die Aufzeichnung fort, bis das JC-1-Signal eine Plateauphase erreicht hat.In der Regel innerhalb von fünf Minuten Calciumchlorid auf eine Endkonzentration von 20 µM zugeben. Ein sofortiger Anstieg des Fluor-FF-Verhältnissignals sollte sichtbar sein, der eine erhöhte Kalziumkonzentration im Assaypuffer anzeigt, gefolgt von einem allmählichen Abfall aufgrund des mitochondrialen Kalziumaufnahmes. Das JC-1-Verhältnissignal sollte eine kurzzeitige Abnahme zeigen, die auf eine leichte mitochondriale Membrandepolarisation hinweist.Wenn das ER-FF-Verhältnissignal auf den Grundniveau zurückkehrt, was normalerweise innerhalb von einer bis 1,5 Minuten bei weiteren 20 Mikromolar Calciumchlorid der Fall ist, setzen Sie die Pulsung in festen Abständen fort, bis die Mitochondrien kein Calcium mehr akkumulieren können und mit der Freisetzung von Calcium in das Testpuffermedium beginnen. Das Öffnen des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores wird durch einen gleichzeitigen Anstieg des URA-FF-Verhältnissignals infolge der Calciumfreisetzung sichtbar. Eine Abnahme des JC-1-Signalverhältnisses aufgrund des Kollapses des Membranpotentials und eine Abnahme der Lichtstreuung infolge mitochondrieller Schwellung, während sie aus C57BL/6J-Mäusen isoliert wurden.Wie in diesem Video gezeigt, wurde der Sauerstoffverbrauch anschließend während der Atmung im Zustand drei in Gegenwart von Succinat und ADP sowie während der Atmung im Zustand vier nach dem Verbrauch von ADP gemessen. Wie hier dargestellt, erhöht die Zugabe von ADP den Sauerstoffverbrauch aufgrund der oxidativen Phosphorylierung, und der Sauerstoffverbrauch verlangsamt sich. Sobald der gesamte ADP verbraucht ist, wird die Reaktion isolierter Mitochondrien auf Entkopplung durch Zugabe von CCCP in Gegenwart von CCCP gemessen. Die Sauerstoffverbrauchsrate ist höher als während der Atmung im Zustand drei, um die Membranintegrität der isolierten Mitochondrien zu beurteilen.Der Sauerstoffverbrauch wurde in Gegenwart von Succinat und einem DP sowie nach Zugabe von Cytochrom C gemessen. Wie hier zu sehen ist, erhöht die Zugabe von Cytochrom C den Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu DP und Succinat nicht signifikant, was darauf hinweist, dass intakte mitochondriale Membranen für Cytochrom C undurchlässig sind. Um den mitochondrialen Permeabilitätsübergang zu bewerten, dient die Porenöffnung in isolierten Herzmitochondrien als Indikator für die mitochondriale Calcium-Retentionskapazität. Der mitochondriale Permeabilitätsübergang. Die Porenöffnung wurde durch schrittweise Zugaben von 20 µM ausgelöst.Calciumchlorid, extramitochondriales Calcium und das Membranpotential wurden mit verhältnisbestimmenden Indikatoren gemessen. URA FF wird als grüne Kurve und JC-1 als rote Kurve dargestellt. Die Schwellung der Mitochondrien wurde durch Aufzeichnung der Lichtstreuung bei 525 Nanometern gemessen, die durch die schwarze Kurve angezeigt wird. Die Spezifität der JC-1- und Schwellungs-Signale wurde mit einem Mikromolar CCCP und fünf Mikrogramm pro Milliliter des mikrobiellen Toxins Ethin getestet. Wie hier zu sehen ist, geht die Calciumaufnahme durch Mitochondrien mit einer leichten Depolarisation der mitochondrialen Membran einher.Nach vier Kalzium-Pulsen wird die Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pools als Anstieg der URA-FF, was Kalziumfreisetzung anzeigt, beobachtet. Eine Abnahme von JC-1 weist auf einen Kollaps des Membranpotentials hin und ein Anstieg des mitochondrialen Matrixvolumens, der als Verringerung der Lichtstreuung als Marker für Schwellung sichtbar wird, um die Spezifität der Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Porens zu überprüfen. Dieselben Messungen wurden in Gegenwart von Cyclosporin A durchgeführt, das an die Komponente Cyclophilin D des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Por-Komplexes bindet. Wie in dieser Abbildung gezeigt, erhöht die Anwesenheit von einem Mikromolar Cyclosporin A die Anzahl der erforderlichen Calciumchlorid-Pulse, um das mitochondriale Permeabilitäts-Übergangs-Por im Vergleich zur Kontrollprobe zu öffnen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pores in isolierten Herzmitochondrien beurteilt werden kann. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, isolierte Mitochondrien von guter Qualität zu erhalten. Daher ist es wichtig, vor der Verwendung der Mitochondrien für weitere Experimente Kontrollmessungen zur Qualitätsprüfung durchzuführen.

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JoVE Journal

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Biologie

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