Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Das Ziel dieses Videos ist es, ein Verfahren zur Charakterisierung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs zu beschreiben. Geringe Öffnung in Mitochondrien, isoliert aus Mausherz. Zunächst werden Mitochondrien aus Mausherzen isoliert.

Mit der Methode der differenziellen Zentrifugation wird anschließend die Qualität der isolierten Mitochondrien mithilfe einer an einen Computer angeschlossenen Sauerstoffelektrode bewertet, um das Atmungskontrollverhältnis zu messen und die Integrität der mitochondrialen Membran zu beurteilen. Anschließend erfolgt mittels spektrofluorometrischer Geräte die gleichzeitige Messung des Kalziumhaushalts, des mitochondrialen Membranpotentials und des mitochondrialen Volumens, um den Permeabilitätsübergang zu bestimmen. Schlechte Öffnung.

Die erhaltenen Daten zeigten Unterschiede in der Kalzium-Retentionskapazität und der mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pore. Geringe Empfindlichkeit isolierter Mitochondrien, Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs. Die Pore ist ein komplexes Phänomen, das Veränderungen auf mehreren Ebenen der mitochondrialen Physiologie und Anatomie beinhaltet.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die gleichzeitige Messung mehrerer Parameter ein umfassenderes Bild des Phänomens bietet als die Messung einzelner Parameter allein, wie beispielsweise Calcium, Mobilisierung oder Schwellung. Vor Beginn des Verfahrens den Puffer zur Isolierung von Mitochondrien auftauen und den pH-Wert überprüfen, der 7,4 betragen sollte. Anschließend alle Puffer, Schalen und Röhrchen, die verwendet werden, auf Eis stellen. Beachten Sie, dass alle Schritte des Protokolls zur Isolierung von Mitochondrien auf Eis durchgeführt werden müssen.

Legen Sie die Herzen euthanasierter Mäuse auf eine Petrischale und spülen Sie das Blut mit kaltem Puffer zur Isolierung von Mitochondrien ab. Überführen Sie die Herzen anschließend mit einem Messer in eine neue Petrischale, entfernen Sie Fett- und Vorhofgewebe und zerkleinern Sie das Herzmuskelgewebe, bis ein homogenes Produkt erhalten ist.

Überführen Sie die zerkleinerten Herzen in eine 50-Milliliter-Konischflasche. Geben Sie 10 Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Trypsin hinzu und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis verdauen. Beachten Sie, dass die Verwendung von Trypsin die Ausbeute an isolierten Mitochondrien erhöht und zwischen verschiedenen Mitochondrienpräparationen konstant gehalten werden sollte.

Es wird jedoch empfohlen, die Funktionalität isolierter Mitochondrien an Präparationen zu testen, die in Abwesenheit von Trypsin gewonnen wurden, um sicherzustellen, dass das Enzym nicht mit deren Ionen interferiert. Nach der Inkubation 10 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer, der 0,1 % fettfreies BS, a, und fünf Milligramm Trypsininhibitor enthält, hinzufügen und durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen des Gefäßes mischen, um den Trypsin zu neutralisieren. Das verdauten Gewebe durch Zentrifugation mit niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius für eine Minute gewinnen.

Nach dem Aufschwemmen suspendieren Sie das Gewebe in acht Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer mit 0,1 % fettfreiem BSA und halten die Probe auf Eis. Homogenisieren Sie die Probe mit einem motorisierten Glas-Teflon-Homogenisator mit vier bis sechs Hubbewegungen bei 1.200 bis 1.400 U/min. Überführen Sie das Homogenat in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie bei 800 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Um die Kerne und Gewebetrümmer zu pelletieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand, der die Mitochondrien enthält, in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 8.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation weist das Pellet eine weiße Schicht an der Oberseite auf.

Entfernen Sie vorsichtig mithilfe eines Vakuumsystems die weiße Schicht auf dem mitochondrialen Pellet. Resuspendieren Sie anschließend das verbleibende dunklere Pellet, das die Mitochondrien enthält, in einem Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer.

Zentrifugieren Sie anschließend die Mitochondrien bei 8.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 150 Mikrolitern Mitochondrien-Isolierpuffer. Bewahren Sie die Mitochondrien auf Eis auf.

Die Atmung isolierter Mitochondrien wird mit einer an einen Computer angeschlossenen und über die Plus-Software gesteuerten Sauerstoff-Wärmeleitfähigkeits-Elektrode gemessen. Die Sauerstoffelektrode sollte am Tag des Experiments kalibriert werden. Geben Sie zwei Milliliter Mitochondrien-Atmungspuffer, der eine Endkonzentration von einem Mikromolar Rotenon enthält, in die Oxy-Kammer, verschließen Sie die Kammer und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Sauerstoffsignals.

Das vom System aufgezeichnete Signal, das auf dem Computerbildschirm angezeigt wird, ist proportional zur Sauerstoffkonzentration in der Oxy-Therm-Kammer. Sobald das Sauerstoffsignal stabil ist, geben Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und registrieren Sie die basale Atmung für eine Minute. Die Atmung sollte an diesem Punkt sehr niedrig sein, da die Mitochondrien endogene Substrate veratmen.

Dies ist die Atmung im Zustand eins. Geben Sie Succinat bis zu einer Endkonzentration von fünf Millimolar hinzu, um die mitochondriale Atmung am Komplex zwei einzuleiten, und registrieren Sie das Signal eine Minute lang. Der Sauerstoffverbrauch sollte während der Atmung im Zustand zwei ansteigen.

Um die Zustandsatmung auszulösen, fügen Sie ein DP in einer Endkonzentration von 150 µM hinzu. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Sauerstoffverbrauch aufgrund einer TP-Synthese über die oxidative Phosphorylierung ansteigen. Registrieren Sie das Signal, bis die Atmung langsamer wird, was auf einen DP-Verbrauch und einen Übergang zur Aufzeichnung der Zustands-4-Atmung hinweist.

Zustand vier, Atmung für mindestens eine Minute. CCCP bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar hinzufügen und das Signal für eine Minute aufzeichnen. An diesem Punkt sollte die entkoppelte Atmung maximal sein.

Berechnen Sie das Atmungs-Kontroll-Verhältnis, indem Sie die Sauerstoffverbrauchsrate während der Staat-drei-Atmung durch die Sauerstoffverbrauchsrate während der Staat-vier-Atmung dividieren. Ein Ziel-RCR sollte größer als vier sein. Als Nächstes bewerten Sie die Integrität der mitochondrialen Membran, indem Sie in einer neuen Probe von Mitochondrien die Staat-drei-Atmung induzieren, indem Sie ADP in einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen.

Notieren Sie anschließend den Sauerstoffverbrauch für eine Minute, geben Sie 10 Mikromolar Cytochrom C hinzu und erfassen Sie den Sauerstoffverbrauch für zwei bis drei Minuten. Da Cytochrom C bei einer intakten mitochondrialen Membran in einer guten mitochondrialen Präparation undurchlässig ist, wird kein Anstieg oder nur ein sehr geringer Anstieg der Atmung festzustellen sein. Ein Anstieg der Atmung weist auf beschädigte oder defekte mitochondriale Membranen hin.

Die Instrumentierung für die multiparametrische Messung des Öffnens des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores besteht aus einem Quantum-Master-Dual-Emissions-Spektrofluorimeter, das über das Felix-GX-Programm computergesteuert wird. Erstellen Sie mit dem Felix-GX-Programm ein Multidi-Akquisitionsprotokoll und geben Sie die Parameter zur Messung von Kalzium, mitochondrialem Membranpotenzial und Schwellung für die ratiometrischen Farbstoffe Forer und JC-1 ein, um die abgeleiteten Spuren für das Verhältnis und das JC-1-Verhältnis zu generieren. Geben Sie in einer Einweg-Messküvette mit vier Seiten 1 ml Mitochondrien-Assaypuffer mit einer Endkonzentration von 1 µM Rotenon, 5 mM Succinat und 800 nm For a FF hinzu, fügen Sie 250 µg Mitochondrien hinzu und stellen Sie die Probe in das Probenfach des Spektofluorimeters.

Beginnen Sie eine Minute später mit der Aufzeichnung der fluoreszierenden Signale, unterbrechen Sie die Aufnahme, geben Sie 500 Nanomolar JC-1 hinzu und starten Sie die Aufnahme dann erneut. Das Verhältnissignal von JC-1 sollte ansteigen, was auf die Aufnahme durch aktive Mitochondrien hinweist. Setzen Sie die Aufzeichnung fort, bis das JC-1-Signal eine Plateauphase erreicht hat.

In der Regel innerhalb von fünf Minuten Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 20 Mikromolar hinzufügen. Ein sofortiger Anstieg des Fluor-FF-Verhältnissignals sollte zu sehen sein, der eine erhöhte Kalziumkonzentration im Assaypuffer anzeigt, gefolgt von einer allmählichen Abnahme aufgrund des mitochondrialen Kalziumaufnahmes. Das JC-1-Verhältnissignal sollte eine kurze vorübergehende Abnahme zeigen, die auf eine leichte Depolarisation der mitochondrialen Membran hinweist.

Wenn das ER-FF-Verhältnissignal auf den Ausgangswert zurückkehrt, was normalerweise innerhalb von einer bis 1,5 Minuten bei weiteren 20 Mikromolar Calciumchlorid der Fall ist, setzen Sie die Pulsung in festen Abständen fort, bis die Mitochondrien kein Calcium mehr anreichern können und mit der Freisetzung von Calcium in das Testpuffermedium beginnen. Das Öffnen des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores wird durch eine gleichzeitige Zunahme des URA-FF-Verhältnissignals infolge der Calciumfreisetzung sichtbar. Eine Abnahme des JC-1-Signalverhältnisses aufgrund des Kollapses des Membranpotentials und eine Abnahme der Lichtstreuung infolge mitochondrieller Schwellung, während sie aus C57BL/6J-Mäusen isoliert sind.

Wie in diesem Video gezeigt, wurde anschließend der Sauerstoffverbrauch während der Atmung im Zustand drei in Gegenwart von Succinat und ADP sowie während der Atmung im Zustand vier nach ADP-Verbrauch gemessen. Wie hier dargestellt, erhöht die Zugabe von ADP den Sauerstoffverbrauch aufgrund der oxidativen Phosphorylierung, und der Sauerstoffverbrauch verlangsamt sich. Sobald das gesamte ADP verbraucht ist, wird die Reaktion isolierter Mitochondrien auf Entkopplung durch Zugabe von CCCP in Gegenwart von CCCP gemessen. Die Rate des Sauerstoffverbrauchs ist höher als während der Atmung im Zustand drei, um die Integrität der Membran der isolierten Mitochondrien zu beurteilen.

Der Sauerstoffverbrauch wurde in Gegenwart von Succinat und einem DP sowie nach Zugabe von Cytochrom C gemessen. Wie hier zu sehen ist, erhöht die Zugabe von Cytochrom C den Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu DP und Succinat nicht signifikant, was darauf hinweist, dass intakte mitochondriale Membranen für Cytochrom C undurchlässig sind. Um die mitochondriale Permeabilitätsübertragung zu beurteilen, dient die Porenöffnung in isolierten Herzmilochondrien als Indikator für die mitochondriale Kalziumspeicherkapazität. Mitochondriale Permeabilitätsübertragung. Die Porenöffnung wurde durch sukzessive Zugaben von 20 Mikromolar ausgelöst.

Calciumchlorid, extramitochondriales Calcium und Membranpotential wurden mit verhältnisbasierten Indikatoren gemessen. URA FF ist als grüne Kurve und JC-1 als rote Kurve dargestellt. Die Schwellung der Mitochondrien wurde durch Aufzeichnung der Lichtstreuung bei 525 Nanometern gemessen, die durch die schwarze Kurve angezeigt wird. Die Spezifität der JC-1- und Schwellungssignale wurde mit einem Mikromolar CCCP und fünf Mikrogramm pro Milliliter des mikrobiellen Toxins Ethin getestet. Wie hier zu sehen ist, geht die Calciumaufnahme durch Mitochondrien mit einer leichten Depolarisation der mitochondrialen Membran einher.

Nach vier Kalzium-Pulsen wird das Öffnen des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pools als Anstieg der URA-FF, was Kalziumfreisetzung anzeigt, beobachtet. Eine Abnahme von JC-1 weist auf einen Kollaps des Membranpotentials hin und ein Anstieg des mitochondrialen Matrixvolumens, der als Verringerung der Lichtstreuung als Marker für Schwellung sichtbar wird, um die Spezifität des Öffnens des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Porens zu überprüfen. Dieselben Messungen wurden in Gegenwart von Cyclosporin A durchgeführt, das an die Komponente Cyclophilin D des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Porens bindet. Wie in dieser Abbildung gezeigt, erhöht die Anwesenheit von einem Mikromolar Cyclosporin A die Anzahl der erforderlichen Calciumchlorid-Pulse, um das mitochondriale Permeabilitäts-Übergangs-Por zu öffnen, im Vergleich zur Kontrollprobe.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pores in isolierten Hermitochondrien beurteilt werden kann. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, isolierte Mitochondrien in guter Qualität zu erhalten. Daher ist es wichtig, vor der Verwendung der Mitochondrien für weitere Experimente Qualitätskontrollmessungen durchzuführen.