Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit Nanometergenauigkeit zu messen. Dazu werden die Zellen zunächst auf transparenten Glasobjektträgern kultiviert und mit einem fluoreszierenden Marker inkubiert. Dann wird die Winkelposition des verstellbaren Spiegels des Mikroskops kalibriert und die Position im Spiegelpositionierungsprogramm gespeichert.

Der nächste Schritt besteht darin, die Fluoreszenzbilder bei Bestrahlung in etwa 10 verschiedenen Winkeln aufzunehmen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellsubstratabstände mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern zu berechnen. Letztendlich werden die Ergebnisse der Topologie der Zelladhäsion auf dem Substrat verwendet, um Unterschiede in der Adhäsion zwischen verschiedenen Zelllinien, z.B. Krebszellen und weniger bösartigen Zellen, aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass die tatsächliche Auflösung im Bereich von nur wenigen Nanometern liegt. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Zellmembranen geben. Es kann auch auf andere Systeme wie kleine Vesikel oder Nanomaterialien angewendet werden.

Experiment wird von unserer Postdoktorandin Petra, die die Zellproben vorbereiten wird, und unserem Ingenieur Michael Wagner, der das Experiment durchführen wird, um Zellen für die totale interne Reflexion mit variablem Winkel vorzubereiten. Mit der Fluoreszenzmikroskopie werden einzelne Zellen mit einer Dichte von 100 Zellen pro Quadratmillimeter auf einem Objektträger in Kulturmedium ausgesät, das mit 10 % fötalem Kalb, Serum und Antibiotika ergänzt wird. Züchten Sie Zellen 72 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Als nächstes tragen Sie die Fluoreszenzmembran, Marker sechs D, Decano zwei, Dimethylaminonaphthalin oder Loran in einer Konzentration von acht Mikromolaren in Kultur auf die Zellen auf und inkubieren vor der Fluoreszenzmikroskopie 60 Minuten lang im Medium. Waschen Sie die Zellen mit PBS, pipettieren Sie die Pufferlösung über den Objektträger, um anschließend das Medium zu entfernen, und wischen Sie die Pufferlösung von der Rückseite des Objektträgers ab. Für den variablen Winkel wird ein aufrechtes Mikroskop wie ein Zeiss Axio Plan verwendet, das mit einer rückwärtig beleuchteten und/oder Exon-E-M-C-C-D-Kamera ausgestattet ist.

T-I-R-F-M ersetzt seinen Kondensor durch eine speziell angefertigte Beleuchtungsvorrichtung mit einem halbzylindrischen Glasprisma, das optisch mit dem Objektträger gekoppelt ist. Der Laserstrahl wird von einer kollatierten Monomode-Faser einfallen, die nach Abbildung durch das Glasprisma und weitere optische Komponenten wiederum einen parallelen Strahl auf der Oberfläche der Probe ergibt. Achten Sie darauf, dass der Vektor des elektrischen Feldes senkrecht zur Einfallsebene polarisiert ist.

Diese Position ist auf dem Ausgangskoppler der Faser markiert. Verwenden Sie einen verstellbaren Spiegel im Inneren des Kondensors, der in der Probenebene abgebildet wird und die Probe unter einem variablen Einfallswinkel oder Objektstrahl beleuchtet. Der verstellbare Spiegel kann von einem Schrittmotor angetrieben werden, der per Software gesteuert wird.

Jede Position entspricht einem genau definierten Einfallswinkel, der durch go-metrische Messungen bestimmt wird. Um die Winkelposition des verstellbaren Spiegels zu kalibrieren, verwenden Sie einen Fluoreszenzfarbstoff wie ein millimolares Flavinnukleotid, das in Wasser gelöst ist. Um den kritischen Winkel bei Variation des Einfallswinkels zu visualisieren, verwenden Sie den kritischen Winkel von 61,3 Grad für einen Glaswasserübergang als festen Wert, die Winkelposition des Spiegels, bei der der Einfallswinkel gleich dem kritischen Winkel ist, wird im Spiegelpositionierungsprogramm gespeichert.

Stellen Sie mit der Kamerasoftware die Parameter der E-M-C-C-D-Kamera ein, einschließlich Temperaturverstärkung, Aufnahmezeit und Schaltgeschwindigkeit. Verwenden Sie Immersionsöl, um den optischen Kontakt der Probe zu gewährleisten. Wählen Sie mit einem Glasprisma eine Objektivlinse mit geeigneter Vergrößerung für die Zellen und mittlerer numerischer Blende.

Um das Objekt im Mikroskop sichtbar zu machen, verwenden Sie einen geeigneten Langpass- oder Bandpassfilter für die Fluoreszenzdetektion. Aufzeichnung von Fluoreszenzbildern identischer Proben bei Variation des Beleuchtungswinkels. Die Winkel von Ereignissen sollten gleich oder größer als der kritische Winkel sein.

Mit dem kritischen Winkel, der für eine Zellglasschnittstelle 64,5 Grad entspricht, wird ein Winkelbereich von 66 Grad bis 74 Grad mit Schritten von 0,5 Grad oder einem Grad empfohlen. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, verwenden Sie das Lab-View-Programm, um die in verschiedenen Winkeln aufgenommenen Bilder sowie die Kameraeinstellungen, die Anregungswellenlänge und die Brechungsindizes zu lesen. Für Glas (1,52) und Zellen (1,37) werden die Einstellungen importiert, um die Daten richtig auszuwerten.

Für jeden Parametersatz werden die Eindringtiefe und der Transmissionsfaktor automatisch für den Erfolg des Eingriffs berechnet. Es ist wichtig, dass die Bilder sorgfältig aufgezeichnet und für die Analyse ausgewählt werden. Wählen Sie Bilder aus, die für die Bewertung der Zellsubstratabstände gemäß der Gleichung verwendet werden.

Bei einem Membranmarker können einzelne Bilder innerhalb einer homogenen Beleuchtung, wie in diesem Beispiel gezeigt, ausgeschlossen werden. Berechnen Sie Bilder der Zellsubstrattopologie und wählen Sie einen geeigneten Farbcode für die Anzeige während der Auswertung. Profile einzelner Pixel können wie in dieser Abbildung dargestellt dargestellt werden.

Diese Profile können als Indikator für die Qualität der Passform verwendet werden. Speichern Sie abschließend das Auswertungsprotokoll. Diese Abbildung zeigt Totalreflexionsbilder von U2 51 mg Glioblastomzellen mit einem aktivierten TP 53 Tumorsuppressorgen.

Bei der Inkubation mit Luan wurden bei verschiedenen Einfallswinkeln 66 Grad entsprechend einer Eindringtiefe des evaneszenten elektromagnetischen Feldes von etwa 140 Nanometern, 69 Grad, entsprechend einer Eindringtiefe von 75 Nanometern und 73 Grad, entsprechend einer Eindringtiefe von 60 Nanometern mit abnehmender Eindringtiefe aufgezeichnet. Die Intensität der Tiefenfluoreszenz nimmt ab und stammt von oberflächlicheren Stellen der Zellen, wie z. B. fokalen Kontakten an ihren Rändern. Die Zellsubstratabstände werden in Panel D durch einen Farbcode von null bis 600 Nanometern dargestellt, wie hier zu sehen.

Die Zellsubstratabstände variieren bei den Zellen stark zwischen nur wenigen Nanometern, dargestellt durch Weiß, bis Gelb und 250 bis 300 Nanometern, dargestellt durch Dunkelrot. Dies deutet darauf hin, dass fokale Kontakte und größere Zellsubstratabstände in unmittelbarer Nähe liegen. Eine ähnliche Variation der Zellsubstratabstände wird für U2 51 mg Glioblastomzellen mit einem aktivierten Tumorsuppressorgen P 10 berechnet.

Im Gegensatz dazu sind die Zellsubstratabstände für U2 51 mg Kontrollzellen, dargestellt durch gelb, und Wildtyp-Zellen, dargestellt durch orange bis rot, nach ihrer Entwicklung ziemlich konstant. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellsubstrattopologie den Weg, um Tumorzellen und die morphologischen Veränderungen bei der Lasertherapie zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Oberflächen mit einer tatsächlichen Auflösung im Nanometerbereich bei geringer Lichteinwirkung visualisieren können, die für lebende Organismen gut erträglich ist.