Name: Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Nanotopologie der Zelladhäsion mit VA-TIRFM für Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von Zell-Substrat-Abständen im Nanometerbereich und vergleicht verschiedene Zelllinien.

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Die Autoren danken dem Land Baden-Württemberg und die Europäische Union Europäischer Fonds für regionale sterben Entwicklung - für die Finanzierung ZAFH-PHOTON n, das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die Finanzierung von Forschung Grant No. 1792C08 sowie die Baden-Württemberg-Stiftung GmbH für die Finanzierung des Projekts &quot;Aurami&quot;.

Ein. Seeding und Inkubation der Zellen <ol><li> Saatgut einzelnen Zellen, zB U373-MG oder U-251 MG-Glioblastomzellen mit einer typischen Dichte von 100 Zellen / mm 2 auf einem Glasträger und wachsen sie für 4872 Stunden in Kulturmedium (zB RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika) mit einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Inkubieren von Zellen mit einer Membran-Marker, zB 6-Dodecanoyl-2-dimethylamino Naphthalin (Laurdan) für 60 min bei einer Konzentration von 8 uM (in Kulturmedium) 4, oder eines Cytoplasma-Marker aufgebracht, angewendet zB Calcein acetomethlyester 40 min bei einer 4,5; Konzentration von 5 uM 3, oder eine Membran zugeordnet Photosensibilisator Protoporphyrin IX z. B. auf 4 h Inkubation mit seiner Vorstufe 5-Aminolävulinsäure (1 mM 5-ALA) induziert. </li><li> Waschen der Zellen mit Kulturmedium oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vor der Fluoreszenzmikroskopie. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Verwenden Sie einen aufrechten Mikroskop, z. B. Zeiss Axioplan, und ersetzen Sie ihre Kondensator durch eine Beleuchtungseinrichtung, wie in Lit. beschrieben. 3 mit einer halbkugelförmigen oder halbzylindrischen Glasprisma optisch mit dem Objektträger verbunden (siehe Abbildung 1). </li><li> Verwenden eines parallelen kollimierten Laserstrahls das nach Abbildung durch das Glasprisma und weitere optische Komponenten (zB Hohlspiegel) resultiert wiederum in einer parallelen Strahls auf der Oberfläche der Probe (telezentrische Pupille ray). Achten Sie darauf, dass der elektrische Feldvektor senkrecht polarisiert sind zu der Einfallsebene ist. </li><li> Verwenden einer einstellbaren Spiegel innerhalb des Kondensators, der in der Probe abgebildet wird und beleuchtet die Probe unter einem variablen Anstellwinkel (Objektstrahl) befindet. Die verstellbare Spiegel kann durch einen Schrittmotor angetrieben werden, wobei jede Position einem gut definierten Einfallswinkel, wie durch Messungen goniometrischen 3 bestimmt </sup&gt;. </li><li> Kalibrieren der Winkelposition des verstellbaren Spiegels mit dem kritischen Winkel Θ c = 61,3 ° für ein Glas-Wasser-Übergang als ein fester Wert. Θ c visualisiert werden bei Variation der Θ wenn ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. 1 mM Flavinmononucleotid, FMN) in Wasser gelöst ist. Die Position des Spiegels bei Θ = Θ c ist in dem Spiegel Positionierprogramm gespeichert. </li><li> Stellen Sie die Parameter der Kamera (hinten beleuchtet Andor Ixon EMCCD, DV887DC, Andor Technology, Belfast, UK 6), einschließlich Temperatur, Verstärkung, Aufnahmezeit und Schaltgeschwindigkeit. </li><li> Verwenden Sie ein Objektiv von geeigneten Vergrößerung und bevorzugt moderate numerische Apertur (z. B. 40 × / 0,75 oder 63 × / 0,90 Eintauchen in Wasser) und lokalisieren Sie die Objektträger unter dem Mikroskop. Verwenden Immersionsöl, um optischen Kontakt der Probe mit dem Glasprisma gewährleisten. Aufzuzeichnen Fluoreszenzbilder von identischen Proben auf die VariationBeleuchtungswinkel (Θ ≥ Θ c mit Θ c entspricht 64,5 ° für eine Zell-Glas-Grenzfläche). Ein Winkelbereich von 66 ° -74 ° in Schritten von 0,5 ° oder 1 ° empfohlen. Verwenden ein geeignetes Langpass oder Bandpassfilter zum Fluoreszenzdetektion. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Lesen von Bildern (zB im ASCII-Format) in verschiedenen Winkeln Θ sowie den Kameraeinstellungen (für Hintergrund Diskriminierung), der Anregungswellenlänge und den Brechungsindizes für Glas (n 1 = 1,52) und Zellen aufgenommen (n 2 = 1,37) in die Auswertung Programm (LabView; NanoCell). Für jeden Satz von Parametern die Eindringtiefe d (Θ) und der Transmissionsgrad T (Θ) werden automatisch berechnet. </li><li> Wählen Sie die Bilder zur Auswertung von Zell-Substrat-Distanzen Δ nach Gleichung 5 (Membran Marker) oder Gleichung 4 (Zytoplasma Marker), Einzelne Bilder mit inhomogenerBeleuchtung (aufschlussreiche e, g. Streifen) kann ausgeschlossen werden. </li><li> Berechnen Sie Bilder von Zell-Substrat-Topologie und wählen Sie einen geeigneten Farbcode für die Anzeige. Bei der Auswertung Profile der einzelnen Pixel dargestellt werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese Profile können als Indikator für die Qualität der Anpassung verwendet werden. </li><li> Bewahren Sie die Auswertung Protokoll. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Vertreter Experimente mit gentechnisch veränderten U251-MG Glioblastom-Zellen freundlicherweise von Prof. Jan Mollenhauer, Abteilung Molekulare Onkologie, Universität Süddänemark, Odense zugeführt wird. In zwei Subklone dieser U251 Zellen die Tumorsuppressorgene oder TP53 PTEN sind überexprimiert Verwendung eines Tet-On Induzierbares Expressionssystem, derart, dass diese Zellen einen verminderten tumorigene Potential aufweisen und können als weniger malignen anzusehen. Hochmalignen U251-MG Zellen ohne Suppressor-Gen sind als Kontrollen verwendet, und U251-MG Wildtyp-Zellen dienen einem weiteren Vergleich. Eine Laserdiode Emittieren eines quasi kontinuierliche Reihe von Pikosekundenpulse (LDH400 mit Treiber PDL 800-B, PicoQuant, Berlin, Deutschland; Wellenlänge: 391 nm; Pulsenergie: 12 PJ; Wiederholungsrate: 40 MHz) als Anregungsquelle verwendet. In 3 TIRFM Bilder der U251-MG Glioblastomzellen mit einer aktivierten TP53 Tumorsuppressorgens und inkubiert mit Laurdan (8 uM, 60 min) werden für Einfallswinkel von 66,0 °, 69,0 ° und 73,0 ° entsprechend Eindringtiefen der abgebildete evaneszenten elektromagnetischen Feld von etwa 140 nm, 75 nm und 60 nm aufweisen. Mit abnehmender Eindringtiefe Fluoreszenz Intensität abnimmt (siehe Skalen) und stammt aus oberflächlicher Seiten der Zellen (zB fokalen Kontakten auf ihren Kanten). Zell-Substrat-Abstände (visualisiert in Abbildung 3d durch einen Farbcode zwischen 0 bis 600 nm) stark in den Zellen zwischen auf unterschiedlichly wenige Nanometer (weiß-gelb) und 250-300 nm (dunkelrot), dh fokale Kontakte und größere Zell-Substrat-Abstände sind in unmittelbarer Nähe. Das gleiche gilt für U251-MG Glioblastomzellen mit einer aktivierten Suppressorgen PTEN (4d), während Zell-Substrat-Abstände relativ konstant sind für U251-MG-Steuerung und Wildtyp-Zellen mit typischen Werten von 80 bis 100 nm (gelb; 4b ) und 150-200 nm (orange-rot; Abbildung 4a). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beleuchtungseinrichtung für VA-TIRFM in einem aufrechten Mikroskop. Eine einstellbare Spiegel durch einen Schrittmotor angetrieben erlaubt eine Winkelauflösung von ± 0,25 °. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Abbildung 2. Auswertung Profil für ein pixel (schematisch). Wenn ln [I C / T (Θ)] in Abhängigkeit von 1 / d (Θ) aufgetragen ist, stellt die Steigung der Zell-Substrat-Abstand Δ. Diese Steigung wird üblicherweise mit einer Genauigkeit von etwa ± 10% bestimmt. Ein Wert - resultierend aus inhomogenen Beleuchtung - markiert wurde und ausgeschlossen von der Auswertung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Abbildung 3 TIRFM Bilder der U251-MG Glioblastomzellen mit aktivierten TP53 Suppressorgen nach Inkubation mit Laurdan (8 uM, 60 min). Aufgezeichnet bei verschiedenen Beleuchtungswinkeln (ac); Zell-Substrat-Abstände im Bereich von 0-600 nm gezeigten durch einen Farbcode (d); Anregungswellenlänge: 391 nm, Detektion: ≥ 420 nm; image size:. 210 &amp;mgr; m × 210 &amp;mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Abbildung 4 Zell-Substrat-Abstände von U251-MG glioblatoma Zellen im Bereich von 0-600 nm durch einen Farbcode gezeigt;. (A) Wildtyp (b) steuert, (c) Zellen mit aktivierten Suppressorgen TP53, (d) Zellen mit aktiviertem Suppressor-Gen PTEN; Anregungswellenlänge: 391 nm, Detektion: ≥ 420 nm; image size:. 210 &amp;mgr; m × 210 &amp;mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es wird ein Verfahren zum Messen Zell-Substrat-Abstände mit Nanometer-Präzision beschrieben. Derzeit Methoden der super-hochauflösenden Mikroskopie, zB auf strukturierte Beleuchtung 7 oder auf Einzelmoleküldetektion 8-10 sowie stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie 11 sind von großem Interesse basiert. Keine dieser Techniken erlaubt jedoch eine axiale Auflösung unterhalb von 50 nm aufweist. Darüber hinaus relativ hohe Bestrahlungsstärke von 50100 W / cm 2 i...

Wenn ein Lichtstrahl durch ein Medium ausbreitet der Brechungsindex n 1 eine Schnittstelle erfüllt, um ein zweites Medium mit einem Brechungsindex n 2 &lt;n 1 tritt Totalreflexion an alle Einfallswinkel Θ, der größer als der kritische Winkel Θ c = sind arcsin (n 2 / n 1). Obwohl sie total reflektiert das einfallende Lichtstrahl Wucht einem evaneszenten elektromagnetischen Felds, das in das zweite Medium und nimmt exponentiell mit senkrechten Abstand z von der Grenzfläche eindringt gemäß I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) entspricht der Intensität des elektromagnetischen Feldes und d (Θ) zu der Eindringtiefe bei der Wellenlänge λ, wie gegeben durch d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Wie in der Literatur 1,2 berichtet, 0 I </ssub&gt; entspricht der Intensität des einfallenden Lichts I e mit der Transmissionsfaktor T (Θ) und dem Verhältnis n 2 / n 1 multipliziert. Wenn der elektrische Feldvektor des Lichts polarisiert ist senkrecht zur Einfallsebene (dh die Ebene, die durch den einfallenden und den reflektierten Strahl aufgespannten) wird diese Transmissionsfaktor gegeben durch T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [ein - (n 2 / nL 1) 2] Für den erfassten Fluoreszenzintensität in TIRFM Messungen hat Lichtabsorption, über alle Schichten der Probe integriert werden und multipliziert mit der Fluoreszenzquantenausbeute η des jeweiligen Farbstoff sowie mit der Raumwinkel Ω Detektion. Wie bereits berichtet 3, kann diese Intensität beschrieben werden durch I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz wenn alle Faktoren f die unabhängig sind<html> rom der Einfallswinkel Θ und die Koordinate z innerhalb des experimentellen konstanten A. Gleichung 3 enthalten kann analytisch gelöst werden, wenn die Konzentration c (z) von Fluorophoren vorliegt, gilt als nahezu konstant - Entweder überhaupt Koordinaten z ≥ Δ, im Zytoplasma von Zellen mit einem Abstand Δ von der Schnittstelle zB. In diesem Fall weist das Integral von z = Δ bis z = ∞ was zu berechnen I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Oder zwischen z = Δ - t / 2 und z = + Δ t / 2, dh innerhalb einer dünnen Schicht mit einer Dicke t, zB einer Zellmembran in einem Abstand Δ von der Schnittstelle angeordnet ist. In diesem Fall kann die Fluoreszenzintensität berechnet werden als I F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ) wenn t im Vergleich mit Δ klein. ent &quot;&gt; Aus den Gleichungen (4) und (5) Zell-Substrat-Abstände Δ berechnet werden, wenn die Bilder der Fluoreszenzintensität I F für variable Winkel Θ aufgezeichnet werden, und wenn ln (I F / T d) (Gl. 4) oder ln (I F / T) (Gl. 5) als Funktion von 1 / d für diese Winkel ausgewertet. Für die Membran Marker Laurdan in diesem Papier verwendet (s. unten) die Auswertung nach Gl. 5 durchgeführt wurde. Wie bereits berichtet 3, Bildaufnahme und Auswertung benötigt - Homogene Verteilung von Anregungslicht über die Probe, - Gültigkeit einer 2-Schichten-Modells (mit den Brechungsindizes n 1 und n 2 für das Substrat und das Zytoplasma, jeweils). Dies gilt, wenn die Plasmamembran ist sehr dünn, und wenn die Schicht aus dem extrazellulären Medium (zwischen der Zelle und dem Substrat) klein ist im Vergleich zur Wellenlänge des einfallenden Lichts. Zusätzlich kann eine moderate numerische Apertur(Typischerweise A ≤ 0,90) des Mikroskops Objektivlinse ist vorteilhaft, Abweichungen der Helligkeit aufgrund Anisotropie von Strahlung im nahen Feld des Dielektrikum-Grenzfläche zu vermeiden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Typ </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Nunc </td><td> Nunc CELLSTAR QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminar Flow </td><td> Holten Sichere </td><td> S2010 1,2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% Penicillin / Streptomycin </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> Kultivierungsmedium </td></tr><tr><td> Glas Objektträger </td><td> Marienfeld </td><td> Reines weißes Glas </td><td> Spezialreinigung Verfahren verwendet </td></tr><tr><td> 6-Dodecanoyl-2-dimethylamino Naphthalin (Laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Fluoreszierenden Marker (Stammlösung: 2 mM in Ethanol) </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiode </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 mit Fahrer PDL 800-B </td><td> Wellenlänge: 391 nm </td></tr><tr><td> Singlemode-Faser-System </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Wird mit Kollimationsoptik </td></tr><tr><td> EMCCD-Kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Kamera hinten beleuchtet </td></tr></tbody></table>

nanotopologie der zelladhäsion auf variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Oberflächentopologie, z. B. von Zellen wachsen auf einem Substrat, mit Nanometer-Präzision durch unterschiedlichen Winkeln Total Internal Reflection-Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) bestimmt. Zellen werden auf transparente Folien kultiviert, gewaschen und mit einem fluoreszierenden Marker homogen in ihrem Plasma Membran verteilt. Beleuchtungssystem tritt durch einen parallelen Laserstrahl unter variablen Winkeln der inneren Totalreflexion (TIR) ​​mit unterschiedlichen Eindringtiefen der evaneszenten elektromagnetischen Feldes. Aufzeichnung von Bildern bei Bestrahlung Fluoreszenz bei etwa 10 unterschiedlichen Winkeln ermöglicht, Zell-Substrat-Abstände mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern berechnen. Unterschiede der Haftung zwischen verschiedenen Zelllinien, zB Krebszellen und weniger malignen Zellen werden somit bestimmt. Darüber hinaus können eventuelle Änderungen der Zelladhäsion auf chemische oder photodynamischen Behandlung geprüft. Im Vergleich mit anderen Methoden der super-hochauflösenden Mikroskopie Belichtung gehalten wirdsehr klein, und keine Beschädigung der lebenden Zellen erwartet wird.

Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit Nanometer-Präzision durch verstellbarem Winkel Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) gemessen.

Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Die Oberflächentopologie, z. B. von auf einem Substrat wachsenden Zellen, wird mit Nanometerpräzision mittels fluoreszenzmikroskopischer Totalreflexion mit variablem Einstrahlwinkel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit nanometrischer Präzision zu messen. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst auf transparenten Glasobjektträgern kultiviert und anschließend mit einem fluoreszierenden Marker inkubiert werden. Danach wird die Winkelposition des justierbaren Spiegels des Mikroskops kalibriert und die Position im Spiegelpositionierungsprogramm gespeichert.Der nächste Schritt besteht darin, die Fluoreszenzbilder bei Bestrahlung unter etwa 10 verschiedenen Winkeln aufzuzeichnen. Der letzte Schritt ist die Berechnung der Zell-Substrat-Abstände mit einer Präzision von wenigen Nanometern. Abschließend werden die Ergebnisse zur Topologie der Zelladhäsion auf dem Substrat verwendet, um Unterschiede in der Adhäsion zwischen verschiedenen Zelllinien darzustellen, beispielsweise Krebszellen und weniger malignen Zellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass die tatsächliche Auflösung im Bereich von nur wenigen Nanometern liegt. Obwohl diese Methode Einblicke in Zellmembranen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie kleine Vesikel oder Nanomaterialien anwendbar.Die Experimentdurchführung wird unsere Postdoktorandin Petra übernehmen, die die Zellproben vorbereitet, sowie unser Ingenieur Michael Wagner, der das Experiment durchführt. Um Zellen für die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie mit variabler Einfallswinkel vorzubereiten, säen Sie einzelne Zellen mit einer Dichte von 100 Zellen pro Quadratmillimeter auf einem Objektträger in Kulturmedium, das mit 10 % Fötales Kalbsserum und Antibiotika ergänzt ist. Kultivieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Als Nächstes wird den Zellen der fluoreszierende Membranmarker 6-D-Decanoyl-2-Dimethylaminonaphthalen (Laurdan) in einer Konzentration von 8 µmol/L im Kulturmedium zugesetzt und 60 Minuten vor der Fluoreszenzmikroskopie inkubiert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, indem die Pufferlösung mit der Pipette über den Objektträger gegeben wird, um das Medium zu entfernen; anschließend wird die Pufferlösung von der Rückseite des Objektträgers abgewischt. Zur variablen Winkelmessung wird ein aufrechter Mikroskop wie ein Zeiss Axio Plan, ausgestattet mit einer rückseitig belichteten und/oder Exon E-M-CCD-Kamera, verwendet.T-I-R-F-M ersetzt seinen Kondensor durch eine eigens angefertigte Beleuchtungseinrichtung mit einem halbzylindrischen Glasprisma, das optisch an die Objektträgerplatte gekoppelt ist. Der Laserstrahl fällt aus einer kollimierten Monomodefaser ein, die nach der Abbildung durch das Glasprisma und weitere optische Komponenten erneut einen parallelen Strahl an der Oberfläche der Probe erzeugt. Achten Sie darauf, dass der elektrische Feldvektor senkrecht zur Einfallsebene polarisiert ist.Diese Position wird am Ausgangskoppler der Faser markiert. Verwenden Sie einen verstellbaren Spiegel, der sich im Kondensor befindet, in der Objektebene abgebildet wird und die Probe unter einem variablen Einfallswinkel oder Objektstrahlwinkel beleuchtet. Der verstellbare Spiegel kann von einem Schrittmotor angetrieben werden, der über eine Software gesteuert wird.Jede Position entspricht einem genau definierten Einfallswinkel, der durch geometrische Messverfahren bestimmt wird. Zur Kalibrierung der winkelgenauen Position des verstellbaren Spiegels verwenden Sie einen fluoreszierenden Farbstoff wie einmillimolares Flavin-Nukleotid, gelöst in Wasser. Um den kritischen Winkel bei Variation des Einfallswinkels sichtbar zu machen, nutzen Sie den kritischen Winkel von 61,3 Grad für einen Glas-Wasser-Übergang als festen Wert; die Winkelposition des Spiegels, bei der der Einfallswinkel dem kritischen Winkel entspricht, wird im Spiegelpositionierungsprogramm gespeichert.Stellen Sie mithilfe der Kamerasoftware die Parameter der E-M-C-C-D-Kamera ein, einschließlich Temperaturverstärkung, Aufnahmedauer und Shift-Geschwindigkeit. Verwenden Sie Immersionsöl, um den optischen Kontakt der Probe sicherzustellen. Wählen Sie mit einem Glasprisma ein Objektiv mit geeigneter Vergrößerung für die Zellen und einer mäßigen numerischen Apertur aus.Um das Objekt im Mikroskop sichtbar zu machen, verwenden Sie einen geeigneten Langpass- oder Bandpassfilter zur Fluoreszenzerkennung. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder identischer Proben bei Variation des Beleuchtungswinkels auf. Die Einfallswinkel sollten gleich groß oder größer als der kritische Winkel sein.Da der kritische Winkel für eine Zell-Glas-Grenzfläche 64,5 Grad beträgt, wird ein Winkelbereich von 66 bis 74 Grad mit Schritten von 0,5 oder einem Grad empfohlen. Zur Initiierung der Datenanalyse verwenden Sie das Lab-View-Programm, um die bei verschiedenen Winkeln aufgezeichneten Bilder sowie die Kameraeinstellungen, die Anregungswellenlänge und die Brechungsindizes auszulesen. Für Glas mit einem Brechungsindex von 1,52 und Zellen mit einem Brechungsindex von 1,37 werden die Einstellungen importiert, um eine korrekte Auswertung der Daten zu gewährleisten.Für jeden Parametersatz werden die Eindringtiefe und der Transmissionsfaktor automatisch für den Erfolg des Verfahrens berechnet. Es ist wichtig, dass die Bilder sorgfältig aufgenommen und für die Analyse ausgewählt werden. Wählen Sie die zur Auswertung der Zell-Substrat-Abstände verwendeten Bilder gemäß der Gleichung aus.Für einen Membranmarker können einzelne Bilder bei homogener Beleuchtung, wie in diesem Beispiel gezeigt, ausgeschlossen werden. Berechnen Sie Bilder der Zellsubstrat-Topographie und wählen Sie einen geeigneten Farbcode für die Anzeige während der Auswertung. Profile einzelner Bildpunkte können wie in dieser Abbildung dargestellt angezeigt werden.Diese Profile können als Indikator für die Qualität der Anpassung verwendet werden. Speichern Sie abschließend das Evaluierungsprotokoll. Diese Abbildung zeigt Totalreflexionsbilder von U2 51 mg Glioblastomzellen mit einem aktivierten TP 53-Tumorsuppressorgen.Nach Inkubation mit Luan, aufgezeichnet bei verschiedenen Einfallswinkeln, entsprechen 66 Grad einer Eindringtiefe des evaneszenten elektromagnetischen Feldes von etwa 140 Nanometern, 69 Grad einer Eindringtiefe von 75 Nanometern und 73 Grad einer Eindringtiefe von 60 Nanometern mit abnehmender Eindringtiefe. Die Fluoreszenz nimmt in der Intensität ab und stammt aus oberflächlicheren Zellbereichen, wie beispielsweise fokalen Kontakten an ihren Rändern. Die Abstände zwischen Zelle und Substrat werden in Panel D durch eine Farbcodierung dargestellt, die von null bis 600 Nanometern reicht, wie hier gezeigt.Die Zell-Substrat-Abstände variieren stark über die Zellen hinweg, wobei nur wenige Nanometer durch Weiß bis Gelb und 250 bis 300 Nanometer durch Dunkelrot dargestellt werden. Dies weist darauf hin, dass fokale Kontakte und größere Zell-Substrat-Abstände in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Eine ähnliche Variation der Zell-Substrat-Abstände wird für U2-51-mg-Glioblastomzellen mit einem aktivierten Tumorsuppressorgen P 10 berechnet.Im Gegensatz dazu sind die Zell-Substrat-Abstände für die U2 51 mg Kontrollzellen, dargestellt durch Gelb, und die Wildtyp-Zellen, dargestellt durch Orange bis Rot, nach ihrer Entwicklung eher konstant. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Zell-Substrat-Topologie, Tumorzellen und die morphologischen Veränderungen nach Lasertherapie zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Oberflächen mit einer tatsächlichen Auflösung im Nanometerbereich bei geringer Lichtexposition sichtbar gemacht werden können, was für lebende Organismen gut verträglich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015). Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen,...

Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

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Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

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Nah-UV-Lithographie und Zugkraftmikroskopie werden kombiniert, um zelluläre Kräfte auf mikrostrukturierte Hydrogele zu messen. Die gezielte lichtinduzierte Freisetzung einzelner Zellen ermöglicht eine hohe Anzahl von Messungen an derselben Probe.

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Erfahren Sie die Nanotopologie der Zelladhäsion mit VA-TIRFM für Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von Zell-Substrat-Abständen im Nanometerbereich und vergleicht verschiedene Zelllinien.

Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

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