Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit In utero Die Elektroporation

Ziel dieses Verfahrens ist es, in utero, Elektroporation, zur Visualisierung und genetischen Manipulation von Dendriten und Stacheln in der Großhirnrinde und im Hippocampus der Maus zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zuerst das gewünschte Plasmid, die DNA-Lösung, in den lateralen Ventrikel von Embryonen in utero injiziert wird. Als nächstes verwenden Sie verschiedene Positionen der Palo-Elektroden.

Entsprechend der DNA-Injektion wird die Großhirnrinde oder der Hippocampus elektroporiert, dann ein gewünschtes postnatales oder adultes Stadium. Mäuse werden durchblutet und Gehirne gesammelt. Zum Schluss werden die Gehirne mit einem Vibram geschnitten.

Letztendlich können Dendriten und Stacheln mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Die Technik der unitären Elektroporation bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu den Methoden zur Untersuchung der rechten Wirbelsäule und der Wirbelsäule. Diese Technik ermöglicht es zunächst, diesen Aspekt direkt in vivo zu untersuchen.

Darüber hinaus ist im Vergleich zur Erzeugung von Knockout-Mäusen in Elektrooperation ein schneller Ansatz zur Untersuchung der Wirkung von Gensuppression bzw. Genexpression und Anziehen von Weiß und Stachel, nicht nur in spezifischer Zellstruktur, sondern auch an einem bestimmten Entwicklungspunkt. Die Verwendung eines induzierbaren Systems im interelektrischen Betrieb ist auch ein nützliches Werkzeug, um funktionelle Wechselwirkungen zwischen Genen zu identifizieren, die an der Entwicklung des Don-Schreibens und der Wirbelsäule beteiligt sind. Im Gegensatz zu Viren ist es für uns beispielsweise schwierig, mehrere HNA- oder mehrere Tonnen-Gene in derselben Zellpopulation zu kombinieren. Um mit der Verdünnung der DNA auf die gewünschten Konzentrationen in Wasser zu beginnen und schnell grünen Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % hinzuzufügenVerwenden Sie einen Mikro-Perpet-Abzieher, um Glasnadeln für die Injektion zu ziehen.

Legen Sie eine trächtige Maus in eine Narkose-Induktionskammer mit Fluor und öffnen Sie den Sauerstoff auf bis zu zwei Liter pro Minute. Wenn das Tier seinen Schreibreflex verliert, übertragen Sie ihn auf eine präoperative Maske. Geben Sie einen Tropfen IGEL auf jedes Auge und rasieren Sie mit einem Elektrorasierer die Haare am Bauch.

Reinigen Sie die rasierte Stelle einmal mit Chlorhexidin, um fliegende Haare zu sammeln. Setzen Sie das Tier mit dem Rücken auf dem Heizkissen in eine zweite Maske im Operationsbereich um. Beginnen Sie mit der Operation, wenn der Blütenreflex verloren gegangen ist.

Ziehen Sie eine Maske und sterile Handschuhe an und decken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch ab. Reinigen Sie die rasierte Stelle mindestens dreimal mit Chlorhexidin. Verwende ein Skalpell, um einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie durch die Haut zu machen.

Mit einer Schere. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt am Bauchmuskel entlang des linearen Ellenbogens. Auswahl der am besten zugänglichen Embryonen.

Legen Sie eine Ringzange zwischen zwei Embryonen und ziehen Sie die Embryonalkette vorsichtig aus der Bauchhöhle heraus. Halten Sie die Embryonen von diesem Zeitpunkt an mit sterilem, vorwarmem PBS hydratisiert. Mit einer Ringzange.

Manipulieren Sie vorsichtig die Position des Embryos im Fruchtwassersack und stabilisieren Sie den Kopf zwischen den Ringen. Drücken Sie sanft, um den Embryo näher an die Gebärmutterwand zu drücken. Nehmen Sie mit der anderen Hand den Kapillarhalter und führen Sie die Nadel vorsichtig in die Mitte der Halbkugel ein, um die Seitenkammer anzuvisieren.

Achten Sie darauf, die Bewegung der Nadel an der Oberfläche der Gebärmutterwand zu minimieren und ein Durchstechen von Blutgefäßen zu vermeiden, und drücken Sie das Pedal, um etwa 0,5 Mikroliter grüne DNA-Lösung zu injizieren. Platzieren Sie die Elektroden an den Seiten des Kopfes des Embryos, wobei sich das Pluspedal auf der gleichen Seite wie der injizierte Ventrikel für die Kortex-Elektroporation befindet, oder auf der gegenüberliegenden Seite des injizierten Ventrikels, der Hippocampus-Elektroporation. Legen Sie dann fünf elektrische 30-Volt-Impulse mit einer Dauer von 50 Millisekunden im Abstand von einer Sekunde an.

Vermeiden Sie es, Strom über die Plazenta anzulegen, da dies zum Tod des Embryos führt. Um die Überlebenschancen zu erhöhen, injizieren und betreiben Sie alle Embryonen in weniger als 30 Minuten, wenn sie bei PBS, der Bauchhöhle, abgeschlossen sind, und verwenden Sie die Ringzange, um das Gebärmutterhorn an seiner ursprünglichen Position zu ersetzen. Verwenden Sie vicryl resorbierbare Nähte, um den Bauch, die Wand und die Haut zu verschließen. Bringen Sie das Tier in eine Auffangkammer, bis es aufwacht.

Übertragen Sie es dann 24 und 48 Stunden nach der Operation in einen Käfig auf einem Heizkissen. Überprüfen Sie das Verhalten der Maus, um Schmerzen, Leiden oder Ängste zu beurteilen, und wiegen Sie das Tier, um das Gehirn zu analysieren. Im postnatalen Stadium verwenden Sie einen Vibrator, um zuvor durchblutete Gehirne zu schneiden, und postfixieren Sie die Schnitte in Aqua Poly Mount, um Dendriten und Stacheln abzubilden.

Diese Abbildung zeigt Beispiele von elektroporierten Zellen in der Großhirnrinde, dem Gyrus ca. one und dem Gyrus dentatus des Hippocampus, während Mausen des Typs bei E 14,5 elektroporiert wurden, wobei das GFP-Konstrukt und die Gehirne am postnatalen Tag 14 entnommen wurden. Durch die Injektion eines kleinen Volumens der DNA-Lösung werden einige Zellen markiert, was die Visualisierung der dendritischen Arborisation isolierter GFP-positiver Zellen sowie ihrer Stacheln bei höherer Vergrößerung ermöglicht. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, ein kleines Volumen an DNA zu injizieren, um nur wenige Zellen zu erreichen und in der Lage zu sein, das Don't Write in der Wirbelsäule oder die Elektroneuronen zu visualisieren und zu quantifizieren.