Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels In-utero-Elektroporation Dendriten und Dornfortsätze im zerebralen Kortex und Hippocampus der Maus sichtbar zu machen und genetisch zu verändern. Dies wird erreicht, indem zunächst die gewünschte Plasmid-DNA-Lösung in das Seitenventrikel von Embryonen in utero injiziert wird. Anschließend werden mithilfe unterschiedlicher Positionen der Palo-Elektroden elektrische Impulse appliziert.

Entsprechend der DNA-Injektion wird der Großhirnkortex oder das Hippocampus elektroporiert, anschließend zu einem gewünschten postnatalen oder adulten Zeitpunkt. Die Mäuse werden perfundiert und die Gehirne entnommen. Abschließend werden die Gehirne mit einem Vibroschnittgerät präpariert.

Schließlich können Dendriten und Dornfortsätze mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Die Technik der einheitlichen Elektroporation bietet im Vergleich zu den Methoden zur Untersuchung von Dendriten und Dornfortsätzen mehrere Vorteile. Tatsächlich ermöglicht diese Technik in erster Linie die direkte Untersuchung dieses Aspekts in vivo.

Außerdem ist die Elektroporation im Vergleich zur Erzeugung von Knockout-Mäusen ein schneller Ansatz, um die Wirkung der Genunterdrückung oder Genexpression in Dendriten und Synapsen nicht nur in spezifischen Zellstrukturen, sondern auch zu einem bestimmten Zeitpunkt der Entwicklung zu untersuchen. Die Verwendung eines induzierbaren Systems in der in utero-Elektroporation ist ebenfalls ein nützliches Werkzeug, um funktionelle Wechselwirkungen zwischen Genen zu identifizieren, die an der Dendriten- und Synapsenentwicklung beteiligt sind. Tatsächlich ist es im Gegensatz zu Viren beispielsweise für uns einfach, mehrere shRNAs oder mehrere Zielgene in derselben Zellpopulation zu kombinieren. Verdünnen Sie zunächst die DNA auf die gewünschten Konzentrationen in Wasser und fügen Sie Schnellgrünfärbung zu einer Endkonzentration von 0,05 % hinzu. Verwenden Sie einen Mikroperforationszieher, um Glasnadeln für die Injektion herzustellen.

Stellen Sie eine trächtige Maus in eine Narkoseinduktionskammer mit Isofluran und öffnen Sie den Sauerstofffluss auf bis zu zwei Liter pro Minute. Sobald das Tier seinen Wimpernreflex verliert, überführen Sie es zu einer Vormaskenbeatmung. Geben Sie einen Tropfen IGEL auf jedes Auge und rasieren Sie das Baarhaar mit einem Elektrorasierer ab.

Reinigen Sie den rasierten Bereich einmal mit Chlorhexidin, um lose Haare aufzunehmen. Überführen Sie das Tier in eine zweite Maske im Operationsbereich, wobei sein Rücken auf der Heizplatte liegt. Beginnen Sie die Operation, sobald der Wimpernreflex verloren gegangen ist.

Legen Sie eine Maske und sterile Handschuhe an und bedecken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch. Reinigen Sie den rasierten Bereich mindestens dreimal mit Chlorhexidin. Verwenden Sie ein Skalpell, um entlang der Mittellinie einen vertikalen Schnitt durch die Haut zu führen.

Mit einer Schere einen ähnlichen Einschnitt am Bauchmuskel entlang der linearen Elle vornehmen. Die am leichtesten zugänglichen Embryonen auswählen.

Platzieren Sie Ringzangen zwischen zwei Embryonen und ziehen Sie vorsichtig die Embryokette aus der Bauchhöhle heraus. Von diesem Zeitpunkt an halten Sie die Embryonen mit steriler, vorgewärmter PBS-Lösung feucht. Verwenden Sie Ringzangen.

Manipulieren Sie vorsichtig die Position des Embryos innerhalb der Fruchtblase und stabilisieren Sie den Kopf zwischen den Ringen. Drücken Sie leicht, um den Embryo näher an die Uteruswand heranzuschieben. Nehmen Sie mit der anderen Hand den Kapillarhalter und führen Sie vorsichtig die Nadel in die Mitte der Hemisphäre ein, um das Seitenventrikel anzusteuern.

Unter sorgfältiger Minimierung der Nadelbewegung an der Oberfläche der Uteruswand und unter Vermeidung von Blutgefäßen das Pedal betätigen, um etwa 0,5 µL grüne DNA-Lösung zu injizieren. Die Elektroden an den Seiten des embryonalen Kopfes anbringen, wobei das positive Pedal auf derselben Seite wie der injizierte Ventrikel für die Kortex-Elektroporation oder auf der gegenüberliegenden Seite des injizierten Ventrikels für die Hippocampus-Elektroporation platziert wird. Anschließend fünf elektrische Impulse mit 30 Volt und einer Dauer von 50 Millisekunden im Abstand von jeweils einer Sekunde anwenden.

Vermeiden Sie es, Strom durch die Plazenta zu leiten, da dies zum Embryotod führt. Um die Überlebenschancen zu erhöhen, injizieren Sie alle Embryonen und führen Sie die Elektroporation innerhalb von 30 Minuten durch. Sobald die Arbeit in PBS, der Bauchhöhle, abgeschlossen ist, verwenden Sie Ringzangen, um den Uterushorn an seine ursprüngliche Position zurückzubringen. Verschließen Sie den Bauch mit resorbierbaren Vicryl-Nähten, Wand und Haut. Stellen Sie das Tier in eine Erholungskammer, bis es aufwacht.

Überführen Sie das Tier anschließend 24 und 48 Stunden nach der Operation in einen Käfig auf einer Heizplatte. Überprüfen Sie das Verhalten der Maus, um Schmerzen, Leid oder Belastung zu beurteilen, und wiegen Sie das Tier, um die Gehirne zu analysieren. Verwenden Sie in den postnatalen Stadien einen Vibratome, um zuvor perfundierte und nachfixierte Gehirne zu schneiden; montieren Sie die Schnitte in Aqua-Poly-Mount, um Dendriten und Dornfortsätze abzubilden.

Diese Abbildung zeigt Beispiele für elektroporierte Zellen in der Großhirnrinde, dem CA1-Bereich und dem Gyrus dentatus des Hippocampus, wobei die Tiere am Embryonaltag 14,5 elektroporiert wurden und die GFP-Konstrukte sowie Gehirne am 14. Tag nach der Geburt entnommen wurden. Durch die Injektion eines kleinen Volumens an DNA-Lösung werden nur wenige Zellen markiert, was die Visualisierung der dendritischen Verzweigung isolierter, GFP-positiver Zellen sowie ihrer Dornfortsätze bei höherer Vergrößerung ermöglicht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, ein kleines Volumen an DNA zu injizieren, um nur wenige Zellen zu targeten und in der Lage zu sein, die Dornfortsätze oder die elektroporierten Neurone zu visualisieren und zu quantifizieren.