Synthetische Spinnenseide Produktion im Labormaßstab

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, synthetische Spinnenseide herzustellen, indem der natürliche Spinnenseiden-Spinnprozess nachgeahmt wird, um die Seidenproduktion im Labor zu replizieren. Große Mengen rekombinanter Seidenproteine werden in Bakterien exprimiert, anschließend mittels Chromatographie gereinigt und durch Lyophilisierung konzentriert. Das Protein wird solubilisiert, und die Spinnlösung wird durch eine Spritze mit einer Nadel geringen Durchmessers in ein entwässerndes Alkoholbad extrudiert.

Schließlich werden die synthetischen, als Spinnfasern hergestellten Fasern einer Nachspinnung unterzogen, um die molekulare Ausrichtung der Protein-Ketten zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Elektrospinnen oder Trockenspinnen liegt in den geringeren Kosten, der einfachen Handhabung und dem Potenzial, das Verfahren auf eine großtechnische Produktion auszudehnen. Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Entwicklung einer neuen Klasse von Biomaterialien.

Diese Materialien können für eine breite Palette unterschiedlicher Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise Nähte, Körperschutzausrüstung sowie Saiten für Musikinstrumente. Obwohl diese Methode Einblicke in die Materialeigenschaften von Spinnenseide ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung anderer Typen biologischer Polymere, die aus rekombinanten Proteinen gesponnen werden, angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da sie Fachkenntnisse in vielen Disziplinen erfordert, darunter Bioingenieurwesen, Biophysik, Zell- und Molekularbiologie sowie Biochemie.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir den natürlichen Spinnprozess der Spinne nachahmen mussten, um synthetische Fasern herzustellen. Um das Plasmid zu erzeugen, das für die Spinnenseidenproduktion verwendet wird, wird die gewünschte cDNA der Spinnenseide mittels spezifischer Primer-Sets amplifiziert und in einen prokaryotischen Expressionsvektor, wie beispielsweise pBA TOPO Thio Fusion, ligiert. Dieser Vektor verfügt über ein N-terminales Thioredoxin-Tag zur Verbesserung der Löslichkeit des Seidenproteins sowie ein C-terminales Sechs-mal-His-Tag zur Proteinreinigung.

Nach der Ligierung werden die Ligationsprodukte in kompetente E. coli-Zellen transformiert und ein Plasmid enthaltender Kolonie wird kultiviert. Die Expression des Spinnenseidenproteins wird dann durch Zugabe von Aose induziert, und die Zellen werden pelletiert und bei minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung gelagert, um die Bakterienzellen zu lysieren. Geben Sie 20 Milliliter eines 1x-Lysepuffers zum Zellpellet, um die Zellen vollständig zu resuspendieren. Fügen Sie anschließend Lysozym hinzu, um eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen, um die chromosomale DNA abzubauen, wodurch die Viskosität der Lösung bei 100 Mikrogramm DNA verringert wird.

Anschließend die Probe auf einen Rotationskorb stellen und 20 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung eine Minute lang bei Stufe 19 beschallen, um die Lösung zu klären, und dann 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit 16.000 Gs zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren überprüfen, ob der Überstand nicht viskos und klar ist; falls die Lösung viskos und trüb ist, mehr DNase hinzufügen, erneut beschallen und den Überstand erneut zentrifugieren.

Sobald das Überstand klar ist, überführen Sie ihn in eine saubere 25-Milliliter-BioRad-Poly-Präp-Säule für die Nickelnitrilotriessigsäure-(NTA-)Affinitäts-Chromatographie. Um das Fusionsprotein zu reinigen, geben Sie einen Milliliter Nickelnitrilotriessigsäure-(NTA-)Schlamm, der 0,5 Milliliter Kugeln enthält, in die Säule, verschließen Sie die Kappe und den Hahn sorgfältig und stellen Sie die Säule für eine Stunde auf einen Schüttler, um die Äquilibrierung durchzuführen und die Bindung des Sechsfach-His-Tags an die Nickelnitrilotriessigsäure-(NTA-)Kugeln zu ermöglichen. Stellen Sie die Säule aufrecht auf ein Stativ und lassen Sie die Nickelnitrilotriessigsäure-(NTA-)Kugeln etwa zwei Minuten lang absinken.

Wenn sich die Kügelchen vollständig abgesetzt haben, ist eine hellblaue Schicht am Boden sichtbar. Entfernen Sie die Kappe und lassen Sie die Lösung durch den Hahn laufen. Sammeln Sie die Lösung in einem 15-Milliliter-Kegelrohr.

Fügen Sie für weitere Analysen 20 Milliliter eines 1× Waschpuffers hinzu und lassen Sie die Rüben absetzen. Öffnen Sie den Hahn und sammeln Sie die Durchläufe in vier Portionen zu je fünf Milliliter. Zum weiteren Analysieren lagern Sie die Aliquots bei vier Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius für die kurz- bzw. langfristige Lagerung.

Beachten Sie, dass zusätzliche Waschvolumina verwendet werden können, um verunreinigendes Protein zu verringern; dies kann jedoch die Gesamtausbeute an Protein reduzieren. Als Nächstes geben Sie 20 Milliliter eines 1×-Elutionspuffers hinzu, lassen das Harz absinken, öffnen den Hahn und lassen die Lösung durchlaufen. Sammeln Sie diese Lösung, die 20 Milliliter umfasst, in vier Aliquots zu je fünf Milliliter für weitere Analysen.

Lagern Sie bei vier Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius für die kurz- bzw. langfristige Lagerung. Beachten Sie, dass zusätzliche Elutionsvolumina von der Nickel-NTA-Harze gegebenenfalls gesammelt werden können. Trennen Sie anschließend die Proteine entsprechend ihrer molekularen Massen.

Unter Verwendung der SDS-Page-Analyse die Proteine mit Silber oder Coomassie Brilliant Blau R 250 sichtbar machen; nur reine Fraktionen sollten für die folgenden Schritte verwendet werden. Die Identität des gereinigten Proteins durch Western-Blot-Analyse bestätigen. Um Salze zu entfernen und das Protein zu konzentrieren, Dialyse durchführen und die Probe gemäß den Anweisungen im beigefügten Dokument lyophilisieren. Die gefriergetrockneten Proben bei minus 80 Grad Celsius lagern. Der Zweck der nächsten Schritte besteht darin, die Dope und die Spritze für den Spinnprozess vorzubereiten, wobei unter einer Sicherheitshaube gearbeitet wird.

Fügen Sie vorsichtig die geeignete Menge HEXA Fluoro, ISOPROPANOL oder HFIP zu jedem Röhrchen mit getrocknetem Proteinpulver hinzu, um eine Konzentration von 200 Milligramm pro Milliliter bis 500 Milligramm pro Milliliter oder 20 % bis 50 % Gewicht pro Volumen zu erreichen. Verschließen Sie das Röhrchen unmittelbar nach dem Zugabe von HFIP, verschließen Sie die Röhrchen mit Folie und stellen Sie sie auf einen Schüttler, um die Proteinauflösung durch Vortexen zu unterstützen. Dies kann bis zu zwei Tage dauern.

Wenn das Protein gelöst ist, die Probe bei 16.000 Gs zwei bis drei Minuten lang zentrifugieren. Sobald das Protein in Lösung ist, wird es als Spinnmasse bezeichnet. Die Lösung ist äußerst viskos.

Stellen Sie sicher, dass keine Aggregate vorhanden sind, da diese die Spritze verstopfen könnten. Laden Sie im nächsten Schritt vorsichtig mindestens 25 Mikroliter der Spinnlösung in eine Hamilton-Gastdicht-Spritze mit einer Nadel von 127 Mikrometern Durchmesser, wobei die Spritze mit der Nadel nach oben gehalten wird, um den Kolben zu betätigen. Um Luftblasen zu entfernen, ist es sehr wichtig, alle Luftblasen zu beseitigen, da sie Unregelmäßigkeiten in der Faser verursachen würden.

Als Nächstes befestigen Sie die Spritze an einer Harvard-Apparatur, Modell 11 plus Spritzenpumpe. Stellen Sie einen 400-Milliliter-Becher, der mit 95%igem Isopropanol gefüllt ist, auf einen beweglichen Stativhalter, sodass die Spitze der Spritze gerade die Alkoholoberfläche durchbricht. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf 15 Mikroliter pro Minute ein und drücken Sie auf Start.

Die Extrusion der Faser. Sollte je nach Ausgangsvolumen der Spinnmasse etwa ein bis zwei Minuten dauern. Nachdem die gesamte Lösung zu Faser gesponnen wurde, sollte die Faser 20 Minuten lang in Isopropanol belassen werden, um sich vollständig einzustellen.

Anschließend wird die Probe mithilfe einer Spulvorrichtung gesammelt. Die hier verwendete Spulvorrichtung wurde hergestellt, indem Metallkämme auf einen digitalen Messschieber geklebt wurden. Wie in diesem Bild dargestellt, bringen Sie beidseitiges Klebeband auf beiden Seiten des Kamms an der Spulvorrichtung an.

Danach befestigen Sie die Spulvorrichtung an einem Motor. Stellen Sie den Motor so ein, dass die Fäden mit zwei U/min aufgespult werden. Anschließend greifen Sie mit einer Pinzette vorsichtig ein Ende der Faser und ziehen sie langsam aus dem Isopropanol heraus.

Befestigen Sie es an der Kante eines der Kammarme auf der Spule. Unter Verwendung des doppelseitigen Klebebands sollten die nächsten Schritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die Fasern austrocknen. Schalten Sie den Motor ein und führen Sie die Faser mit einem Glasstab vorsichtig auf die Aufwickelvorrichtung.

Vermeiden Sie es, dass sich die Faser falten und stapeln kann. Das doppelseitige Klebeband sollte ein Verrutschen der gesamten Faser verhindern und ermöglicht eine gezielte Dehnung der inneren Abschnitte der Fasern innerhalb der Messschenkel.

Wenn der gesamte Faden aufgespult ist, lösen Sie die Spule vom Motor und tragen Sie Klebstoff an den Rändern jedes Seidenfadens auf dem doppelseitigen Klebeband auf. Dadurch wird die Spinnenseide auf der Vorrichtung befestigt. Befestigen Sie die Spule am Linearantrieb, um die Nachspinnung zu durchführen.

Bestimmen Sie die anfängliche Länge der Fasern mithilfe des C. Dies ist die innere Länge der Faser. Sie schließt nicht die Länge ein, die verklebt und um die Spule gewickelt ist. Senken Sie die Spule in ein 75 %iges Isopropanolbad ab.

Lassen Sie die Fasern 10 Minuten lang equilibrieren. Stellen Sie die Geschwindigkeit des linearen Aktuators auf 1,5 Millimeter pro Sekunde ein. Berechnen Sie basierend auf der Anfangslänge die Endlänge für das gewünschte Ziehverhältnis nach dem Bin.

Die Dehnung kann je nach Aufbau anhand der Geschwindigkeit oder der Länge gesteuert werden. Wenn beispielsweise eine Anfangslänge von 15 Millimetern und ein gewünschtes Streckverhältnis nach dem Bin von drei x vorliegt, sollte die Endlänge 45 Millimeter betragen. Dies kann auch dadurch errechnet werden, dass der Linearantrieb 20 Sekunden lang mit einer Rate von 1,5 Millimetern pro Sekunde betrieben wird.

Zweitens, nachdem das Post-Bin-Ziehen abgeschlossen ist, die Spule langsam aus dem Isopropanol herausziehen. Die Isopropanoltropfen eine Minute lang verdunsten lassen, um Proben zu sammeln. Zuerst ein Ende der Faser abschneiden, während das andere Ende mit einer Pinzette gehalten wird.

Schneiden Sie dieses Ende ab und befestigen Sie die Faser zur Prüfung auf Karton- oder Folienrahmen. Falls weitere Nach-Dehnverhältnisse gewünscht sind, senken Sie die Spule erneut in das 75 %igen Isopropanolbad. Lassen Sie die Fasern 10 Minuten lang equilibrieren und fahren Sie anschließend mit dem nächsten Nach-Dehnbad fort.

Ziehverhältnis. Notieren Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur, da diese die Fasern beeinflussen können. Mechanische Eigenschaften.

Lassen Sie die gesammelten Proben mindestens eine Stunde lang an die Standard-Laborumgebung anpassen. Eine Luftfeuchtigkeit von 40 % und eine Temperatur von 25 Grad Celsius sind ideal, bevor die mechanische Prüfung durchgeführt wird. Befestigen Sie die Faser, die auf dem Kartonrahmen montiert ist, indem Sie Sekundenkleber an den Kanten des Kartons oder der Folie anbringen, um die Faser im Rahmen zu fixieren.

Achten Sie auf die Größe der Öffnung des Rahmens. Dies ist die anfängliche Länge der geprüften Faser. Hier wird ein Rahmen mit einer einzölligen Öffnung gezeigt, wobei mithilfe eines Lichtmikroskops mit einer 100-fachen oder höheren Vergrößerung Durchmesser entlang der Längsachse der Faser gemessen werden.

Es sollten mindestens drei Messungen aufgezeichnet werden. Je höher die verwendete Vergrößerung und je mehr Messungen durchgeführt werden, desto besser ist die Genauigkeit. Befestigen Sie den Pappeinrahmen an einem tenterförmigen mechanischen Prüfrahmen.

Schneiden Sie dann den Rahmen auf beiden Seiten durch, sodass die Spannung nur noch durch die Faser verläuft. Reißen Sie den Spannrahmen und sammeln Sie die Daten. Eine Standard-Dehnrate von 2 % pro Sekunde wird empfohlen.

Das Verfahren zur Erfassung mechanischer Daten kann je nach Marke des für die Untersuchungen verwendeten Kettentraktors variieren. Mithilfe der erfassten Daten zum mittleren Durchmesser kann eine Spannungs-Dehnungs-Kurve in Microsoft Excel erstellt werden. Die gebrochene Faser kann nun zur morphologischen Analyse und zur Durchmessermessung am Bruchpunkt in ein Rasterelektronenmikroskop (Stu) eingespannt werden.

Das Fasersegment abseits der Bruchstelle kann verwendet werden, um den mit dem Lichtmikroskop gemessenen Anfangsdurchmesser abzuschätzen und zu überprüfen. Das Spinnenseidenprotein MASP1 wurde aus Bakterien exprimiert und gereinigt, um die Reinheit des Proteins vor dem Fasern zu bestimmen; die Proteine wurden einer Größenfraktionierung unterzogen. Mithilfe einer SDS-Page-Analyse, gefolgt von der Visualisierung mittels Silberfärbung, wie hier gezeigt, zeigen die sechs Lösungen, dass der Großteil der Probe in den ersten vier Fraktionen eluiert wird.

Das Spinnenseidenprotein TUSP1 wurde ebenfalls gemäß dem hier vorgestellten Protokoll hergestellt und zu Fasern versponnen, um die mechanischen Eigenschaften synthetischer tubulärer Seidenfasern zu bestimmen. Die Fasern wurden versponnen, und anschließend wurden zunehmende Nachziehverhältnisse angewandt. Die Farben in diesem Bild zeigen Fasern, die unterschiedlichen Nachziehverhältnissen zwischen 2,5× und 6× unterzogen wurden. Die Fasern weisen eine geringe Variation innerhalb ihrer jeweiligen Verhältnisgruppe auf.

Wenn das Ziehverhältnis steigt, nimmt die Festigkeit der Faser zu, während die Dehnbarkeit abnimmt. Die Fasern zeigten jedoch vergleichbare Zähigkeitswerte. Zur Beurteilung der Ultrastruktur der Fasern wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie Aufnahmen von aus rekombinantem Tsp1-Proteinen gesponnenen Fasern angefertigt, wie hier zu sehen ist. Die glatte Oberfläche ist bei 500facher Vergrößerung sowie bei 5.000facher Vergrößerung erkennbar.

Der dichte innere Kern ist an einer natürlichen Faserunterbrechung sichtbar. Dies deutet darauf hin, dass sich die rekombinanten Proteine während des Extrusionsprozesses gut anordnen und verpacken. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Tagen durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, vor dem Einfrieren sämtliches Salz aus dem gereinigten rekombinanten Protein zu entfernen und sicherzustellen, dass die korrekte Spinnlösungskonzentration verwendet wird, um ein Verstopfen der Nadel während des Extrusionsprozesses zu verhindern. Nach dieser Anleitung können andere Fibroine, wie mes, P one TUSB one und P ysb one, zu einzelnen Fasern oder als Verbundwerkstoffe gesponnen werden, um eine breite Palette an Biomaterialien herzustellen. Diese Technik ebnete Forschern auf den Gebieten der Bioingenieurwissenschaft und Materialwissenschaft den Weg, den Einsatz synthetischer Spinnenseide für Anwendungen mit Bedeutung für das militärische und medizinische Feld, die Kunst, den Leistungssport und die Automobilindustrie zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man synthetische Seidenfasern oder Verbundmaterialien unter Verwendung aus Bakterien gereinigter Proteine herstellt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit AFib äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einem Abzug stets beachtet werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.