Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gesunde, intakte Muskeln zu isolieren, um deren kontraktilen Funktionsverlauf in vitro zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst der intakte Musculus extensor digitorum longus oder EDL sowie der Musculus soleus oder Wadenmuskel von der Maus isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Bänder und Sehnen der EDL- und Soleusmuskeln mit chirurgischem Nahtmaterial zu befestigen.

Als Nächstes befestigen Sie die isolierten Muskeln am Kraftsensor und in der Kontraktionskammer. Im letzten Schritt wird der Muskel mit elektrischen Feldimpulsen stimuliert, um Kontraktionen hervorzurufen. Schließlich werden die resultierenden Kräfte vom Kraftsensor erfasst und aufgezeichnet; zudem können verschiedene physiologische und pharmakologische Manipulationen durchgeführt werden, um deren Wirkungen auf die Muskelkontraktilität zu vergleichen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Beurteilung der Muskel­funktion, wie beispielsweise der Messung der Kontraktilität in situ, der Beurteilung der männlichen Leistung usw., besteht darin, dass mit dieser Methode die neuronalen und vaskulären Komponenten vom Skelettmuskel entfernt werden, wodurch eine direkte Bewertung der intrinsischen Eigenschaften des kontrahierenden Muskels möglich ist. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit dem Verfahren, da die Dissektion intakter Muskeln Geschicklichkeit und Geduld erfordert. Dieses Verfahren wird von einem Techniker in meinem Labor und einem Postdoktoranden in Dr. Jmas Labor demonstriert.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Muskelpräparation und Montage in die Kontraktionskammer schwierig durchzuführen ist. Daher hilft dieses Video, die anatomische Struktur des Muskels zu verstehen und die für die Montage des isolierten Muskels erforderliche Größenordnung einzuschätzen. Bei diesem Verfahren wird eine Wildtyp-C57-black-six-Maus oder ein Mausmodell der Krankheit durch Halsbruch getötet und in Seitenlage positioniert.

Um den EDL zu präparieren, führen Sie einen oberflächlichen Hautschnitt durch. Schneiden Sie die Faszie zwischen der vorderen Tibia und der hinteren Muskulatur auf. Lokalisieren Sie den proximalen Ursprung, an dem das Ligament mit dem lateralen Condylus der Tibia und mit dem oberen, drei Viertel der vorderen Fibula-Oberfläche verbunden ist.

Schneiden Sie anschließend das Ligament mit feinen Augenchirurgiescheren so weit wie möglich distal vom Muskel ab, um den proximalen Ursprung des EDL-Muskels freizulegen. Danach halten Sie das Ligament mit einer stumpfen Pinzette fest und ziehen langsam, um den EDL zu lösen. Möglicherweise müssen einige der das EDL und benachbarte Muskeln umgebenden Paramezien durchtrennt werden.

Dieser Schritt muss vorsichtig durchgeführt werden, um den EDL-Muskel nicht zu beschädigen. Danach im Insertionsbereich, an dem die vier distalen Sehnen in die mittleren und distalen Phalangen der Zehen zwei bis fünf einmünden, die Sehnen so weit wie möglich von den Muskeln entfernt durchtrennen. Den isolierten EDL-Muskel in eine Präparierschale mit kalziumfreier isotonischer Tyro-Lösung überführen.

Der EDL-Muskel ist ein schneller, glykolytischer Muskel mit blassrosa bis weißer Farbe, einer Länge von etwa 10 bis 13 Millimetern und einem Gewicht von acht bis 11 Milligramm. Als Nächstes binden Sie einen chirurgischen Knoten an beiden Enden des isolierten EDL-Muskels mit sechs-0er Nahtmaterial so weit wie möglich vom Muskel entfernt und leicht oberhalb der Längsmitte des Ligaments oder Sehnen. Danach überführen Sie den EDL-Muskel in die mit Sauerstoff gesättigte Gewebekammer.

Befestigen Sie den Muskel in der Probennut des Kraftaufnehmers und am feststehenden Haken am Boden der Badkammer. Wiederholen Sie den Isolierungs- und Montagevorgang für den EDL-Muskel aus dem anderen Bein, um den Musculus soleus an der posterolateralen Seite des Beins zu präparieren. Schieben Sie den Gastrocnemius-Muskel, der ihn normalerweise bedeckt, beiseite.

Die Musculus soleus ist ein langsam arbeitender oxidativer Muskel mit dunkelroter Färbung, etwa einen Millimeter kürzer als der Musculus extensor digitorum longus (EDL), wiegt jedoch leicht mehr als der EDL. Am proximalen Ursprung. Durchtrennen Sie das Band, das entlang der Soleallinie mit der proximalen Hälfte der hinteren Tibia und mit dem proximalen Drittel der hinteren Fibula verbunden ist.

Schneiden Sie anschließend am distalen Ansatz die Achillessehne durch, die am hinteren Fersenbein ansetzt. Lösen Sie danach vorsichtig die Fußsohle. Befestigen Sie den Musculus soleus ordnungsgemäß in der Badkammer.

Nachdem die Muskeln in einzelnen Gewebekammern montiert sind, beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten. Denken Sie daran, die Basislinie des Kraftaufnehmers auf Null zu stellen. Dies erleichtert die Beobachtung von Änderungen der Basislinie und vereinfacht den Vergleich von Muskelkontraktionen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Danach die isolierten Muskeln mit Rechteckimpulsen stimulieren. Elektrische Ströme im Bereich von 60 bis 300 Milliampere verwenden, individuelle Rechteckimpulsdauern zwischen 0,3 und einer Millisekunde sowie Stimulationsdauern der Impulsfolgen von 350, 500 oder 1000 Millisekunden. Der nächste Schritt besteht darin, eine Stimulationsfrequenz auszuwählen, die maximale tetanische Kraft erzeugt, wenn der isolierte Muskel bei Raumtemperatur auf seine optimale Länge gedehnt ist.

Diese Frequenz liegt typischerweise bei etwa 100 Hertz für EDL und 60 Hertz. Für Soul dehnen Sie den Muskel langsam und warten 30 Sekunden, anschließend stimulieren Sie ihn mit 100 Hertz oder 60 Hertz. Danach dehnen Sie ihn erneut.

Warten Sie weitere 30 Sekunden und stimulieren Sie erneut nach dem Dehnen. Wenn die Kraft nicht weiter ansteigt, bedeutet dies normalerweise, dass die maximale Kraft erreicht wurde. In der Zwischenzeit deutet bei wiederholten Dehnungs- und Stimulationszyklen eine Abnahme der Kraft darauf hin, dass die Muskeln überdehnt wurden. In dieser Situation lösen Sie die Dehnung auf das vorherige Niveau zurück und stimulieren den Muskel erneut, bis die maximale Kraft beobachtet wird.

Stellen Sie nun die Beziehung zwischen Kraft und Frequenz her. Reizen Sie den Muskel mit Frequenzen von eins bis 140 Hertz in Schritten von fünf bis zehn Hertz und einer Periodizität von 30 bis 60 Sekunden. Führen Sie die Experimente bei 25 Grad Celsius durch; werden sie bei 37 Grad Celsius durchgeführt, erweitern Sie die FF auf höhere Frequenzen von bis zu 300 Hertz für den Zwerchfellmuskel, 180 bis 200 Hertz für Soleus und 220 bis 250 Hertz für EDL.

Anschließend durch den Vergleich der von jeder Reizfrequenz erzeugten Kraft die Frequenz ermitteln, die die maximale tetanische Kraft und etwa die halbmaximale tetanische Kraft erzeugt. Tmax liefert wichtige Informationen zur Modulation des kontraktilen Apparats. Während das halbe Tmax Informationen liefert, die eher für die Kalziumregulation und den EKK-Prozess relevant sind.

Der Muskel wird anschließend mit der Tmax-Frequenz im Abstand von einer Minute über einen Zeitraum von 30 Minuten stimuliert, ein Vorgang, der als Equilibrierung bezeichnet wird, um den Beitrag des sarkoplasmatischen Retikulums an der Muskelkontraktilität zu untersuchen. Nach der Equilibrierung wird die Kalziumfreisetzung zur Muskelkontraktion untersucht, wobei die Muskeln durch die Gabe von jeweils einer halben Tmax-Stimulation im Abstand von zwei Sekunden über fünf Minuten ermüdet werden. Hier verwendeten wir eine Zugdauer von 500 Millisekunden, sodass der Tastgrad 25 % beträgt. Anschließend wird der Muskel mit einer halben Tmax-Stimulation im Abstand von einer Minute erholt.

Für 30 Minuten oder bis die Kraft stabil ist, kann ein zusätzlicher ermüdender Protokollschritt durchgeführt werden. Mittlerweile gilt es als genau, den Zustand der kontraktilen Apparatur durch Ermüdung bei Tmax mit tmax zu testen. Anschließend sollten die Verfahren zur Bestimmung von FF wiederholt werden, um die phänotypischen Unterschiede zwischen verschiedenen Stämmen, Krankheitsmodellen oder pharmakologischen Behandlungen beobachten zu können.

Durch die Analyse der FF vor und nach Ermüdung, um den Beitrag des extrazellulären Calciumeinstroms zur Muskelkontraktilität zu untersuchen, kann die Badelösung gegen eine kalziumfreie Lösung mit 0,1 Millimolar EGTA ausgetauscht werden. Alternativ können verschiedene Blocker speicheroperierter Kanäle in der Badelösung zugegeben werden. Am Ende des Experiments messen Sie die experimentelle Länge der Muskeln, wiegen diese anschließend einzeln mit einer Analysenwaage ab, schockgefrieren die Muskeln in flüssigem Stickstoff und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius für biochemische Analysen ein.

Kalibrieren Sie nun den Kraftaufnehmer. Wandeln Sie die aufgezeichnete Muskelkraft in Millivolt basierend auf den Kalibrierungsergebnissen in Gramm-Kraft um. Anschließend normalisieren Sie sie auf die physiologische Querschnittsfläche.

Diese Abbildung zeigt die kontraktilen Kräfte, die durch fünf Hertz, 20 Hertz und maximale tetanische Kraft hervorgerufen werden; hier ist eine Spur der Kontraktionskraft eines geschädigten Muskels dargestellt. Hier sehen Sie ein repräsentatives Beispiel, das die einzelnen Kontraktionen einer Kraft-Frequenz-Beziehung in EDL sowie die resultierende Kurve aus der ff zeigt. Dies ist ein typisches Profil mit schnellem Abfall für die Ermüdung des EDL-Muskels und ein Profil mit langsamem Abfall für die Ermüdung des Musculus soleus.

Die ermüdende Stimulation führt zum Auftreten mechanischer Alternanzen in einem Trick, einem Knockout-Muskel mit gestörten Kalzium-Handhabungseigenschaften. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Bei korrekter Durchführung wird das gesamte Experiment länger dauern und von der Anzahl der durchgeführten Interventionen abhängen. Während Sie dieses Verfahren durchführen, ist es sehr wichtig, den DL-Muskel so schnell wie möglich zu isolieren und zu montieren, da die hypoxische In-vitro-Umgebung irreversible Schäden am schnellen Muskelgewebe verursachen kann.

Mithilfe dieses Verfahrens können Genanalysen, Western Blotting, Immunhistochemie und strukturelle Untersuchungen an denselben Versuchsmuskeln durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Beispielsweise die Expressionslevel und Lokalisation eines bestimmten Proteins oder von Bestandteilen der Muskelproteine, die die Kontraktilität oder Calciumsignalgebung regulieren, sowie morphologische oder ultrastrukturelle Veränderungen in Muskeln, die aus spezifischen Bedingungen nach ihrer Entwicklung resultieren. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Muskelphysiologie, genetische Defekte, die die Funktion von Skelettmuskeln in verschiedenen Modellen – einschließlich Mäusen, Ratten und Hamstern – beeinflussen, zu untersuchen.