Name: Profiling Veränderungen in Rezeptor Tyrosin Kinase-Phosphorylierung mit Antikörper Arrays - Werbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit dem Human Phospho-RTK Array Veränderungen der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung in Krebszelllinien analysieren. Diese Methode ermöglicht die simultane Profilerstellung mehrerer RTKs zur Bewertung gezielter Inhibitoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von R &amp; D Systems, Inc. finanziert

Ein. Probenvorbereitung <ol><li> Sammle Lysaten aus unbehandelten, Ligand behandelt, oder Inhibitor und Ligand behandelten Zellen nach den Richtlinien im Human Phospho-RTK Array Datenblatt. Der Lysepuffer hat für dieses Kit optimiert. Die Substitution von anderen Lysepuffern kann sich auf die endgültige Leistung des Arrays. Einen proteolytischen Abbau Probe zu verhindern, fügt 10 ug / ml Aprotinin, 10 ug / ml Leupeptin und 10 ug / ml Pepstatin A zum Volumen Lysepuffer für jede Zelle Lysat-Zubereitung frischer für jede Anwendung nicht erforderlich. </li><li> Lysat Konzentration sollte unter Verwendung eines Bicinchoninsäure (BCA)-Assay werden. Probenkonzentration kann empirisch für eine optimale Empfindlichkeit und einen niedrigen Hintergrund eingestellt werden. Ein Bereich von 100-300 ug Lysat wird als eine anfängliche Startpunkt empfohlen. </li><li> Einfrieren / Auftauen der Proben sollte vermieden werden und fachgerechte Lagerung von Lysaten wird für eine optimale Leistung benötigt. Eingefrorene Lysatproben auf Eis. </li></ol><ol><li> Bringen Sie alle Kit-Komponenten auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Um Verunreinigungen zu vermeiden, tragen Sie Handschuhe während der Durchführung der Verfahren. </li><li> Pipette 2,0 ml Array Buffer 1 in jedes Well der 4-Well Multi-Teller verwendet werden. Array Puffer 1 dient als Blockpuffer. </li><li> Mit Flachbild-Spitze Pinzette jede Membran aus zwischen den Schutzfolien und in einen Brunnen der 4-Well Multi-Gericht verwendet werden. Die Array-Nummer muss nach oben zeigen. </li><li> Beim Kontakt mit Array Puffer 1 wird der blaue Farbstoff aus den Flecken verschwinden, aber die die Fang-Antikörper in ihrem spezifischen Stellen beibehalten. </li><li> Inkubieren für 1 Stunde auf einem schaukelnden Plattform. Richten Sie das Fach, so dass jedes Array rocks Ende in seiner gut enden. Die Oberfläche des Array sollte vollständig benetzt werden und fallen unter Blockpuffer. </li><li> Während die Membranen sperren, verdünnte die gewünschte Menge des zellulären Lysats auf ein Endvolumen von 1,5 ml mit Puffer 1 Array. </li> &lt;li&gt; Aspirate Array Buffer 1 aus den Brunnen der 4-Well Multi-Schüssel und fügen verdünnten Lysats Lösungen. Setzen Sie den Deckel auf dem 4-Well Multi-Gericht. <li> Inkubieren über Nacht bei 2-8 ° C auf einem Schüttler Plattform. Eine kürzere Inkubationszeit kann verwendet werden, wenn eine optimale Empfindlichkeit nicht erforderlich ist. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig jede Membran aus dem 4-Well Multi-Teller und Ort in einzelne Kunststoff-Behälter mit 20 ml 1X Waschpuffer. Das 4-Well Multi-Gericht kann nicht verwendet werden, um Waschschritte abzuschließen. Spülen Sie das 4-Well Multi-Schale mit destilliertem Wasser und trocknen. </li><li> Waschen Sie jede Membran mit 1X Waschpuffer für 10 min auf einem Wippschüttler Shaker. Wiederholen Sie zwei Mal für insgesamt 3 Wäschen. </li><li> Verdünnen Sie die Anti-Phospho-Tyrosin-Meerrettichperoxidase (HRP) Detektionspuffer in 1X Array Buffer 2 mit dem Verdünnungsfaktor auf dem Flaschenetikett. Pipette 2,0 ml der verdünnten Lösung in jede Vertiefung der 4-Well Multi-Gericht. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig jede Membran aus ihrer Wäsche-Container.Überschüssige Puffer von der Membran abtropfen und gibt die Membran an der 4-Well Multi-Schale mit der verdünnten Anti-Phospho-Tyrosin-HRP. Die Vertiefungen mit dem Deckel. </li><li> Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem schaukelnden Plattform. </li><li> Waschen jedes Array wie zuvor beschrieben. </li><li> Führen Sie die verbleibenden Schritte ohne Unterbrechung. Entfernen Sie vorsichtig jede Membran aus ihrer Wäsche-Container. Überschüssige Puffer aus der Membran durch Blotten der unteren Kante auf Saugpapier abzulassen. Platzieren Sie jede Membran auf eine Plastikfolie Protektor mit der Identifikationsnummer nach oben. </li><li> Je 1 ml der vorbereiteten Chemi Reagenzienmix gleichmäßig auf jeder Membran. Verwendung von weniger als 1 ml Reagenz Chemi-Mischung pro Membran kann zu einer unvollständigen Membran Deckung kommen. Substitution einiger hoher Intensität Chemilumineszenz Reagenzien für Chemi Reagenzien 1 und 2 kann entweder erhöht Hintergrund oder verminderten Abhängigkeit von dem Reagenz. </li><li> Vorsichtig mit einer KunststoffabdeckungKlarsichthülle. Gently glätten alle Luftblasen und sicherzustellen, Chemi Reagent Mix gleichmäßig in alle Ecken jeder Membran verteilt. Inkubation für 1 min. </li><li> Position Papierhandtücher auf der Oberseite und Seiten aus Kunststoff Klarsichthülle mit den Membranen und sorgfältig auspressen Chemi Reagent Mix. </li><li> Entfernen Sie die obere Plastikfolie Beschützer und legen Sie es vorsichtig eine absorbierende lab on top der Membranen abtupfen alle verbleibenden Chemi Reagent Mix wischen. </li><li> Verlassen Membranen auf der Unterseite Plastikfolie Beschützer, decken die Membranen mit Plastikfolie kümmert sanft glätten alle Luftblasen. Wickeln des überschüssigen Plastikfolie um die Rückseite des Blattes, so daß die Schutzfolie Membranen und Klarsichthülle vollständig umwickelt. </li><li> Platzieren Sie die Membranen mit den Identifikationsnummern nach oben, in einer Autoradiographie Filmkassette, die nicht mit radioaktiven Isotop Detektion verwendet wird. </li><li> Aussetzen Kodak BioMax Light Film für 1-10 min. Mehrfachbelichtungen sind empfbeendet. Alternativ können die Bilder gesammelt, indem ein Chemilumineszenz kompatibel Imager wie die Carestream Health werden Image Station 4000mm PRO. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Positive Signale zur entwickelten Film gesehen kann schnell, indem die Transparenz Überlagerung auf dem Array Bild und dass es in die Paare von Referenzspots in den Ecken zu diesem Zweck bedruckt identifiziert werden. Die abgestempelte Identifikationsnummer auf dem Array sollte auf der linken hatten platziert werden. Die Lage der Kontrollen und Fänger-Antikörper befindet sich im Anhang des Human Phospho-RTK Array Datenblatt aufgeführt. </li><li> Pixel Dichten auf entwickelten Film können mithilfe einer Übertragung-mode-Scanner wie dem Epson Perfection V750 PRO werden. </li><li> Erstellen Sie eine Vorlage zur Pixeldichte in jedem Punkt des Arrays unter Verwendung eines geeigneten Bildanalyse-Software-Programm zu analysieren. Kompatiblen Programmen gehören ImageQuant oder ArrayVision Software von GE, Western Vision software mit Vorlagen spezifische Profiler Arrays, BioRad Quantity One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ und Protein Einfache AlphaView Proteome. </li><li> Exportieren Signalwerte eine Spreadsheet-Datei für die Manipulation in einem Programm wie Microsoft Excel. </li><li> Ermitteln der durchschnittlichen Signalleistung (Pixeldichte) des Paares von doppelten Spots Darstellen jedes RTK. </li><li> Subtrahieren einer gemittelten Signal von jedem Ort. Verwenden eines Signals von einer freien Fläche des Arrays oder negative Kontrolle Spots als Hintergrund-Wert. </li><li> Vergleichen entsprechender Signale auf unterschiedlichen Arrays, um die relative Änderung der RTK Phosphorylierung Ebenen zwischen den Proben zu bestimmen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie das Human Phospho-RTK-Array verwendet werden, um die Wirkungen von Ligand Stimulation und Inhibitoren auf RTK Phosphorylierung screenen. In Abbildung 1 sind die Daten für MDA-MB-453-Zellen, die unbehandelt gezeigt, mit 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) für 5 min, oder mit bekannten ErbB-Familie Inhibitoren 8-11 vor HRGβ1 Behandlung vorbehandelt werden. Für Inhibitor Experimente wurden die Zellen mit 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153.035 oder 158.780 PD 200 nM in SFM für drei Stunden inkubiert. Jedes Array wurde mit 100 ug Lysat inkubiert. Eine Zunahme der Phosphorylierung ist für ErbB2, ErbB3 beobachtet und ErbB4 Capture Flecken beim Vergleich mit unbehandelten Zellen HRG-β1 behandelt MDA-MB-453-Zellen. Die Behandlung der Zellen mit allen drei ErbB-Familie selektive Inhibitoren vor HRG-β1 Inkubation verursachte Verringerung der ErbB2, ErbB3, ErbB4 und Phosphorylierung. In Abbildung 2 sind die Daten für Kato III-Zellen bekannt, die RTK FGF R2 überexprimieren gezeigt. In diesem Satz von Experimenten waren Kato III-Zellen unbehandelte, mit 100 ng / ml rhFGF sauer (FGF) und 1 ug / ml Heparin, oder vorbehandelt mit FGF R selektive Inhibitoren 12-15 vor der Behandlung mitFGF und Heparin. Die Inhibitoren PD173074, PD 161.570, 166.285 und PD wurden bei einer Konzentration von 1 uM verwendet und inkubiert mit den Kato III-Zellen für 3 h in serumfreiem Medium. Während es konstitutiven Phosphorylierung von sowohl EGF und FGF R R2 in unbehandelten KATO III-Zellen, einem Anstieg der FGF R2 Phosphorylierung wurde auf FGF Behandlung beobachtet. Inkubieren der Zellen mit PD 173.074 ergab PD 161.570 oder 166.285 PD einer verringerten FGF R2 und EGF R Phosphorylierung. Obwohl diese bekannten Inhibitoren auf die Phosphorylierung von FGF R Familienmitglieder zeigen diese Ergebnisse, die Nützlichkeit des Human Phospho-RTK-Array für das Überwachen der Wirkung einer bestimmten Konzentration des Inhibitors auf andere RTKs, wie EGF R in diesem Fall haben kann. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Induktion und Hemmung der Rezeptorentor Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung in Brustkrebszellen. Array Bilder von Proteome Profiler Menschliche Phospho-RTK-Arrays sowie die entsprechenden Histogramm Profilen gezeigt. MDA-MB-453-Zellen waren unbehandelt oder mit Inhibitoren RTK gefolgt von Behandlung mit NRG-β1/HRG-β1. Das Array wurde verwendet, um die Auswirkungen der Inhibitoren auf die Kinase-Phosphorylierung in MDA-MB-453-Zellen zu überwachen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Induktion und Hemmung der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung in Magenkarzinomzellen. Array von Bildern von einem Proteome Profiler Menschliche Phospho-RTK-Array und den entsprechenden Histogramm-Profile angezeigt. Kato III-Zellen waren untreated oder behandelt mit RTK-Inhibitoren durch Behandlung mit FGF saurer und Heparin gefolgt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Referenzen <ol><li> Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., &amp; Palmqvist, aktivieren R. Darmkrebs benachbarten Zellen Fibroblasten resultierenden in FGF1/FGFR3 Signalisierung und erhöhten Invasion. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011). </li><li> Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., &amp; Masaki, T. Die Verwendung von Protein-Arrays zu identifizieren anzielbare Rezeptortyrosinkinasen zur Behandlung von menschlichen Dickdarmkrebs. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010). </li><li> Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T., Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., &amp; Antonescu, CR Molekulare Charakterisierung der pädiatrischen gastrointestinalen Stromatumoren. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215 (2008). </li><li> Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., &amp; DePinho wirkt RA Koaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen die Reaktion von Tumorzellen an zielgerichtete Therapien. Science. 318, 287-290 (2007). </li><li> Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, &amp; Stern, DF Verband konstitutiv aktivierte Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (Met) mit einer Resistenz gegen ein Dual EGFR/Her2 Inhibitor in non-small-cell lung cancer Zellen. Br. J. Cancer. 100, 941-949 (2009). </li><li> Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schöffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., &amp; Debiec-Rychter, M. Co-activated PDGFRA und EGFR sind potentielle therapeutische Targets in der Intima-Sarkom. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010). </li><li> Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, &amp; Kim, TY Kombination von EGFR und MEK1 / 2 Inhibitor synergistische Effekte durch Unterdrückung EGFR/HER3-dependent AKT-Aktivierung in menschlichen Magen Krebszellen. Mol. Cancer Ther. 8, 2526-2536 (2009). </li><li> Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., &amp; Brücken, AJ biochemische und antiproliferativen Eigenschaften von 4 - [Ar (alk) yl-amino] Pyridopyrimidine, eine neue Wirkstoffklasse potenter und spezifischer epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997). </li><li> Bos,M., Mendelsohn, J., Kim verhindert, YM, Albanell, J., Fry, DW, und Baselga, J. PD153035, einem Tyrosinkinase-Inhibitor, den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Aktivierung und hemmt das Wachstum von Krebszellen in einem Rezeptor zahlenmittleren abhängigen Weise. Clin. Cancer Res.. 3, 2099-2106 (1997). </li><li> Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, &amp; Elder, JT Differential Auslastung und Lokalisierung von ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen in der Haut im Vergleich zu normalen und malignen Keratinozyten. Neoplasie. 3, 339-350 (2001). </li><li> Klutchko, SR, Zhou, H., Winter, RT, Tran, TP, Bridges, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., Smaill, JB, Denny, WA, &amp; Showalter, HD Tyrosin-Kinase-Inhibitoren. 19. 6-Alknyamides von 4-Anilinochinazoline und 4-anilinopyrido [3,4-d] pyrimidine als irreversible Hemmstoffe der ErbB-Familie von Tyrosinkinase-Rezeptoren. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006). </li><li> Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., &amp; Lutterbach, B. FGFR2-verstärkt Magenkrebs Zelllinien erfordern FGFR2 und ErbB3 Signalisierung für Wachstum und Überleben. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008). </li><li> Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . &amp; Gray, NS Struktur-geführte Ansatz zur Schaffung kovalente FGFR Inhibitoren. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010). </li><li> Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., &amp; RL Panek Inhibition der FGF-1-Rezeptor-Tyrosinkinase-Aktivität durch PD 161.570 , ein neues Protein-Tyrosinkinase-Inhibitor. Life Sci. 62 143-150 (1998). </li><li> Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, &amp; Keiser, JA In vitro pharmakologische Charakterisierung von PD 166285, ein neues nanomolaren wirksame und breit aktives Protein-Tyrosin-Kinase-Inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997). </li></ol>

The Human Phospho-RTK ist eine kostengünstige und schnelle Alternative zu traditionellen Methoden wie Immunpräzipitation (IP) Western für das Screening Veränderungen im RTK-Phosphorylierung. Mit dieser Methode wurden die relativen Spiegel von 42 phospho-RTKs gleichzeitig unter Verwendung einer einzelnen Probe von MDA-MB-453 oder Kato III Zelllysat gescreent. Darüber hinaus benötigt dieses Array Assay 2,5 h hands-on Zeit, so dass diese Methode viel mehr Zeit-wirksamer als die Durchführung mehrerer IP-Westerns. Durch Verwendung eines Chemilumineszenz Nachweisverfahrens, wurde keine spezielle Ausrüstung hinaus, was in der Regel verwendet, um Daten zu sammeln westlichen erforderlich. Arrays sind empfindlich und können verwendet werden, um Änderungen in der Phosphorylierung von beiden Ligand und Inhibitor Behandlung verursacht vergleichen. Diese Methode ermöglicht auch die Auswertung der Inhibitor Selektivität vorbei RTKs. Positive Ergebnisse kann weiter ausgewertet werden unter Verwendung eines quantitativen Assays wie ELISA. Um effektiv arbeiten Arrays zur Früherkennung vonin der Phosphorylierung, sollten einige wichtige experimentelle Richtlinien befolgt werden. Zunächst sollten Experimente umfassen geeignete Kontrollproben. Zum Beispiel wird in diesen Experimenten wurde die Wirkung von Inhibitoren auf MDA-MB-453 oder Kato III Lysate wurden auf Lysatproben am selben Tag hergestellt gemessen. Nur Arraydaten, die innerhalb des gleichen Experiment gesammelt wird untersucht, um zu Variationen der Signalstärke aufgrund von Unterschieden bei der Probenhandhabung, Inkubationszeit Pipette Technik oder Wash-Technik zu minimieren. Vergleichen Signalintensitäten zwischen zwei Analyten auf der gleichen Membran ist nicht zu empfehlen, da Fängerantikörpern nicht ausgewählt wurden, um parallele Affinitäten aufweisen.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank">Human Phospho-RTK Array Kit</a></td><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> R&amp; D Sytems</a></td><td>ARY001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Tocris</td><td>1167</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Tocris</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-453 Zellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kato III</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zellen<a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=396-hb" target="_blank">Rekombinante humane NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domäne</a></td><td>R&amp; D Systems</td><td>396-HB-050&lt;</td><td></td></tr><tr><td>a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=232-fa" target="_blank"&gt;Rekombinantes humanes FGF sauer (aa 16-155)</td><td>F&amp; D Systems</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td>Sigma H4784</td><td></td></tr><tr><td>HDS 029</td><td>Tocris</td><td>2646</td><td></td></tr><tr><td>PD 153035</td><td>Tocris</td><td>1037</td><td></td></tr><tr><td>PD 158780</td><td>Tocris</td><td>2615</td><td></td></tr><tr><td>PD 173074</td><td>Tocris</td><td>3044</td><td></td></tr><tr><td>PD 161570</td><td>Tocris</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>PD 166285</td><td>Tocris</td><td>3785</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Assay</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten und Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes oder destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td>mit flacher Spitze</tr><tr><td>Schaukelplattform Schüttler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter mit einem Fassungsvermögen von 50 ml</td><td></td><td></td><td>Zum Waschen von Arrays</td></tr><tr><td>Transparenter Blattschutz</td><td></td><td></td><td></td>aus Kunststoff</tr><tr><td>Plastikfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saugfähige Labortücher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoradiographie-Kassette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filmentwickler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak BioMax Light Film</td><td>Carestream Health</td><td>178 8207</td><td></td></tr><tr><td>Filmentwickler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Station 4000MM PRO</td><td>Carestream Health</td><td></td><td>Chemilumineszenz-Imager, der mit der Erfassung westlicher Daten kompatibel ist, kann anstelle von Film und Film verwendet werden Entwickler.</td></tr><tr><td>Epson Perfection Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 PRO</td><td>Flachbettscanner mit Durchlichtadapter, der für den Übertragungsmodus geeignet</td></tr><tr><td>ist Bildanalysesoftware</td><td>GE, WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple usw</td><td></td>. <td>ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView oder andere kompatible Programme</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer, auf dem Bildanalysesoftware und Microsoft Excel ausgeführt werden können.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profiling veränderungen in rezeptor tyrosin kinase-phosphorylierung mit antikörper arrays - werbung

Profiling Changes in Receptor Tyrosine Kinase Phosphorylation using Antibody Arrays - ADVERTISEMENT

Die Fehlregulation von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Expression und Phosphorylierung wird häufig mit der Entwicklung und Metastasierung von Krebszellen assoziiert. 1-3 erhebliche Anstrengungen auf die Entwicklung von Inhibitoren konzentriert auf bestimmte RTKs gezielt unterbrechen die aberrante Signalwege mit der Krankheit assoziierten Staaten . 4-7 Der Zweck dieser Studie war es, die Auswirkungen einer ausgewählten Anzahl von Inhibitoren auf RTK Phosphorylierung messen. In dieser Studie wurden die Human Phospho-RTK-Array, das eine Membran basierten Sandwich-Immunoassay Erhöhungen oder Verminderungen der Phosphorylierung für zahlreiche RTKs gleichzeitig überwachen in einer einzigen Probe ist. In diesem Assay präsentieren beide phosphorylierten und unphosphorylierten RTKs in einem Lysat Probe werden durch diskrete Antikörpern in Doppelbestimmung über eine Nitrocellulosemembran der Größe eines Mikroskop-Objektträger gedruckt eingefangen. Nach dem Waschen werden die Arrays mit Anti-Phospho-Tyrosin-Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert,die Sandwiches mit phosphorylierten RTKs auf dem Array erfasst. Nach einer zweiten Waschschritt werden die Arrays mit chemilumineszierenden Reagenzien inkubiert. Signal an jedem Array-Spot erzeugt wird, proportional zu der Menge an Phospho-Proteins durch jedes Fangantikörper gebunden. In diesen Experimenten wurden Arrays verwendet, um Erhöhungen der Phosphorylierung nach Ligandenstimulation von entweder MDA-MB-453 Brustkrebs oder KATO III Magenkarzinomzellen sowie zur Abnahme der Phosphorylierung bei der Behandlung von Zellen mit Inhibitoren selektiv gegenüber ErbB zugeordnet charakterisieren messen oder FGF R Familienmitglieder.

Proteome Profiler Antikörper-Arrays sind eine bequeme und kostengünstige Möglichkeit zum Screening auf Veränderungen in Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Phosphorylierung ohne Durchführung zahlreicher Immunpräzipitation (IP) Westerns. Die ARY001 Menschliche RTK-Reihe läßt zur qualitativen Messung mehrerer RTKs in einer einzelnen Probe unter Verwendung von Chemilumineszenz-Detektion.

Profiling Veränderungen in Rezeptor Tyrosin Kinase-Phosphorylierung mit Antikörper Arrays - Werbung

The dysregulation of receptor tyrosine kinase (RTK) expression and phosphorylation is frequently associated with the development and metastatic spread of ...

profiling-changes-receptor-tyrosine-kinase-phosphorylation-using

Without Section

Die technischen Aspekte der Durchführung LIPS (Luciferase Immunpräzipitation Systems) beschrieben sind. Das Gesamtkonzept beinhaltet Ausdruck chimären Gene Antigene fusioniert an Renilla Luziferase (RUC) in Säugerzellen. Crude Ruc-Antigen-Extrakte werden dann aufbereitet und ohne Reinigung eingesetzt in Immunpräzipitationsassays, um Antikörper zu quantifizieren.

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

Western-Blot ist eine analytische Technik verwendet, um bestimmte Proteine ​​in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt zu erkennen.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Mutationen in den kisspeptin Rezeptor (KISS1R) sind mit reproduktiven Störungen bei Patienten assoziiert. Hier beschreiben wir, wie Mutationen der Interesse an der GC-reiche Sequenz von KISS1R sowie die Verwendung von KISS1R Konstrukte einzuführen, um die Abbauweg des Rezeptors durch Immunpräzipitation und Western-Blot...

Mutagenese und Analyse von genetischen Mutationen in den GC-reichen KISS1 Rezeptor-Sequenz in Menschen mit Fortpflanzungsstörungen Identified

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem...

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren...

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Die Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an den Synapsen stark beeinflusst geclusterten synaptischen Stärke. Diese Methode quantifiziert fluoreszenzmarkierten Neurotransmitter-Rezeptoren in drei Dimensionen mit Single-Auflösung in...

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Wir entwickelten und validierten ein small-footprint Reihe von Miniatur Chemostate aus leicht verfügbaren Teile für niedrigen Kosten gebaut. Physiologische und experimenteller Evolution Ergebnisse waren ähnlich größeres Volumen Chemostate. Die ministat Array bietet eine kompakte, kostengünstige und leicht zugängliche Plattform für traditionelle Chemostatexperimenten, funktionaler Genomik und chemische Screening-Anwendungen.

Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Erfahren Sie, wie Sie mit dem Human Phospho-RTK Array Veränderungen der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Phosphorylierung in Krebszelllinien analysieren. Diese Methode ermöglicht die simultane Profilerstellung mehrerer RTKs zur Bewertung gezielter Inhibitoren.

Profiling Veränderungen in Rezeptor Tyrosin Kinase-Phosphorylierung mit Antikörper Arrays - Werbung

Weitere Videos entdecken