Imaging Gliom Initiation In Vivo Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anfangsstadien der Gliom-Initiierung aus einzelnen injizierten Glioblastomzellen in vivo sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Bereich des Mausschädels auf eine Dicke abgeschliffen wird, die für die in-vivo-Bildgebung geeignet ist. Anschließend wird der dünne Schädelbereich poliert.

Dann werden GFP-markierte Glioblastomzellen in das Maushirn injiziert und das Schädelfenster wird zur In-vivo-Bildgebung versiegelt. Schließlich werden die injizierten Glioblastomzellen täglich abgebildet, um die Gliom-Initiierung aus den injizierten Glioblastomzellen in vivo zu visualisieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die in vivo Gliom-Initiierung nach einer einzigen Injektion von Glioblastomzellen sowie deren Beziehung zu vaskulären endothelialen Zellen mittels zweifarbiger In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigen.

Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Krebsstammzellen beantwortet werden, beispielsweise die entscheidende Rolle der Interaktion zwischen Gliomstammzellen und vaskulären Endothelzellen sowie die In-vivo-Initiierung von Gliomen. Das Verfahren wird unter der Leitung von JAK Surgical Services und postal in meinem Labor durchgeführt. Um sich auf die Operation vorzubereiten, werden alle chirurgischen Instrumente, einschließlich des Zahnbohrers, im Autoklaven mit Wasserdampf sterilisiert, nachdem die Maus mit Ketamin und Xylazin anästhesiert und ein Analgetikum verabreicht wurde. Überprüfen Sie den Anästhesiegrad durch einen Zehenquetschtest mithilfe eines kleinen elektrischen Rasierers. Entfernen Sie das Fell vom dorsalen Kopfbereich in etwa dreieckiger Form, etwa drei Millimeter, kaudal zur Nasenöffnung und kaudal bis zu den Halswirbeln reichend.

Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf. Legen Sie die Maus in Bauchlage und verwenden Sie chirurgisches Jod, gefolgt von 70 % Ethanol. Um die Haut zu desinfizieren, stellen Sie das Tier auf ein Wattepad und übertragen es auf eine Heizplatte.

Um eine Körpertemperatur von etwa 37 Grad Celsius aufrechtzuerhalten, tragen Sie ein topisches Analgetikum auf das Periost und die exponierten Gewebe der Wunde auf. Entfernen Sie mithilfe einer Skalpellklinge das Periost, indem Sie vorsichtig über den Schädel kratzen. Dies trägt dazu bei, dass der Cyanoacrylat-Kleber am Knochen haftet.

Verwenden Sie anschließend einen Markierstift, um den kortikalen Bereich von Interesse abzugrenzen, und achten Sie darauf, Nähtelinien zu vermeiden, um die darunterliegenden großen Gefäße nicht zu beschädigen. Tragen Sie dann eine dünne Schicht aus Cyanoacrylat-Klebstoff auf die Wundränder auf, um das Austreten serosanguinöser Flüssigkeit zu verhindern, sowie auf den Schädel, ausgenommen den Bereich von Interesse, bevor Sie den Schädel mit lichtaktiviertem Zahnzement verschließen. Behandeln Sie die gesamte freiliegende Schädeloberfläche, mit Ausnahme des für das Ausdünnen vorgesehenen Bereichs, mit Primer und anschließendem Bonding-Agent. Sobald der Bonding-Agent getrocknet ist, bedecken Sie den Schädel mit Zahnzement, um den Kopf der Maus zu stabilisieren.

Bei chirurgischen Eingriffen und bildgebenden Verfahren wird eine Sechskantmutter der Größe doppelt null Strich 90 in den Zahnzement eingebettet, wobei ein gewisser Abstand zum Bereich, der abgeschliffen werden soll, eingehalten wird. Sobald die Herstellung des Zahnzements abgeschlossen ist, wird dieser mit sichtbarem Licht ausgehärtet. Anschließend wird mithilfe einer Schraubhalterung der Größe null null Strich 90 der Kopfstückhalter des stereotaktischen Geräts an der Sechskantmutter befestigt.

Als Nächstes platzieren Sie den Kopf der Maus unter ein Stereomikroskop und geben einen Tropfen sterilem, isotonischem Salin (0,9 %) bei Raumtemperatur auf den Bereich des Schädels, der abgeschliffen werden soll. Dünneren Sie mithilfe eines Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrers einen kreisförmigen Bereich des Schädels über einer Region von Interesse ab. Um thermische Schädigungen des darunterliegenden Gehirngewebes zu vermeiden, unterbrechen Sie das Bohren intermittierend und tragen Salin auf.

Der Mausschädel besteht aus zwei dünnen Schichten kompakten Knochens, zwischen denen sich eine dicke Schicht von schwammigem Knochen befindet. Entfernen Sie mit dem Bohrer die obere dünne Schicht und den größten Teil des schwammigen Knochens. Nachdem der größte Teil des schwammigen Knochens entfernt wurde, sind die verbleibenden Hohlräume im schwammigen Knochen unter dem Stereomikroskop sichtbar, was darauf hinweist, dass das Bohren die innere Schicht des kompakten Knochens erreicht hat.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Schädelstärke noch über 50 Mikrometer liegen. Fahren Sie vorsichtig mit dem Ausdünnen des Schädels fort, um eine sehr dünne und glatte Präparation zu erhalten. Um den Schädel weiter auszudünnen, verwenden Sie eine speziell angefertigte Silikonpeitsche und Diamantpaste, um ihn etwa 10 Minuten lang zu polieren.

Polieren Sie den Schädel weitere 10 Minuten mit feinkörnigem Zinnoxid. Spülen Sie das Zinnoxid mit Kochsalzlösung ab, bis das dünne Schädelstück sauber erscheint. Um eine Injektion durchzuführen, verwenden Sie eine 26-Gauge-Spritzennadel, um unter dem Mikroskop eine kleine Öffnung auf einer Seite des polierten Fensters zu erzeugen.

Senken Sie die Pipettenspitze mithilfe des Mikromanipulators durch das Loch im Schädel Fenster und in das Gehirn, 100 bis 200 Mikrometer tief. Injizieren Sie anschließend ein Mikroliter Zellsuspension mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrolitern pro Minute.

Nach dem Entfernen der Nadel zur Abdichtung des kranialen Fensters den Schädel trocknen und einen kleinen Tropfen klaren Cyanacrylat-Kleber sowie ein 3 mm großes Deckglas der Nummer eins auftragen. Cyanacrylat-Kleber verwenden, um den Spalt zwischen Deckglas und angrenzendem Zahnzement abzudichten.

Nach der Operation das Maus subkutan mit einem Milliliter warmer steriler Kochsalzlösung injizieren und zusätzliche Wärmezufuhr bereitstellen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, bis die Maus sich vollständig von der Anästhesie erholt hat. Täglich subkutan Analgetika über fünf Tage nach der Operation verabreichen und die Maus täglich beobachten, um sicherzustellen, dass die Wunde ordnungsgemäß verheilt und dass die Maus frisst, trinkt und sich normal verhält, um zu bilden. Nach der Anästhesie der Maus mit Ketamin und Xylazin immobilisieren Sie diese mithilfe einer individuellen stereotaktischen Halterung unter dem Mikroskop.

Eine erfolgreiche Schädeldeckenfenster-Operation ermöglicht es, dass das Schädeldeckenfenster über Wochen bis Monate hinweg klar bleibt. Diese Abbildung zeigt die Gefäßstruktur zwischen dem Schädeldeckenfenster eines Ports, dargestellt mittels rückgestreutem Licht. Diese Gefäßbilder wurden als Orientierungspunkte verwendet, um dieselben Hirnareale bei wiederholten Bildgebungsverfahren zu lokalisieren.

Um sowohl die vaskulären endothelialen Zellen als auch die GBM-Zellen sichtbar zu machen, wurden Mäuse erzeugt, bei denen die vaskulären endothelialen Zellen mit dem roten fluoreszierenden Protein TD-Tomato markiert waren. Nach dem portalen Kraniotomieverfahren wurden GFP-markierte GBM-Zellen in ihre Gehirne injiziert, und eine in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung wurde durchgeführt. Dargestellt ist hier ein Beispiel in vivo für die Gliominitiierung ausgehend von injizierten GBM-Zellen in der Nähe der Gefäßwand.

Diese Abbildung zeigt GFAP-Färbungen von kortikalen Schnitten eines Mäuses ohne Port-Operation, eines Mäuses sieben Tage nach Port-Operation und eines Mäuses sieben Tage nach Port-Operation mit Salzinjektion. Aus den Bildern ist ersichtlich, dass das Maus ohne Operation und das Maus mit Port-Operation keine Gliose aufweisen. Hingegen tritt nach Salzinjektion aufgrund der Pipetteneindringung und der Injektion von Salzlösung ins Gehirn eine Gliose im Gehirngewebe des Mäuses auf.

Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Gliose unter dem Schädel-Fenster des Ports nicht auftritt. Dies liefert eine unabhängige Bestätigung dafür, dass das hier beschriebene Schädel-Fenster des Ports nicht zu der Gliose führt, die typischerweise mit einem offenen Schädel-Fenster bei chronischen Präparaten assoziiert ist. Hier werden hochauflösende Aufnahmen von dendritischen Dornfortsätzen vom selben Mausindividuum am Tag der Operation (Tag null) sowie 32 Tage nach der Herstellung des Port-Fensters gezeigt.

Es wird gezeigt, dass das Fenster des Ports ebenfalls eine hervorragende Wahl für die hochauflösende In-vivo-Bildgebung darstellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Gliom-Initiierung durch die Injektion von Glioblastomzellen durch ein poliertes und verstärktes Schädelfenster bildlich dargestellt werden kann.