Name: Imaging Gliom Initiation In Vivo Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung von Gliomentstehung in vivo durch ein poliertes und verstärktes dünnkalottiges Schädelfenster. Diese Methode ermöglicht Langzeitbeobachtungen von Tumorinteraktionen mit Gefäßendothelzellen.

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Diese Arbeit wird von The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant und The Maine Cancer Foundation unterstützt.

Ein. Protokoll <ol><li> Anästhesieren die Maus mit Ketamin und Xylazin in einer Dosis von 0,1 mg Ketamin und 0,01 mg Xylazin pro 1 g Körpergewicht. Carprofen (0,005 mg pro 1 g Körpergewicht) wird zur Analgesie verwendet und wird präoperativ verabreicht. </li><li> Alle der chirurgischen Instrumente einschließlich des dentalen Bohrers, sind Dampf in einem Autoklaven sterilisiert. Wenn Batch Operationen durchgeführt werden sollen, müssen die Spitzen der chirurgischen Instrumente mit einer Glasperle Sterilisator (Fine Science Tools FST 250) werden vor jeder erneuten Operation erneut sterilisiert. </li><li> Sobald die Maus eine chirurgische Ebene der Anästhesie, durch Fehlen einer Antwort auf eine Zehe Pinch beurteilt erreicht hat, wird es auf einem Wattebausch, die dann auf einem Heizkissen gelegt, um eine Körpertemperatur von ~ 37 ° C zu halten platziert Die Tiefe der Anästhesie wird häufig während der Operation überwacht. </li><li> Fell ist aus dem dorsalen Kopf in einer etwa dreieckigen Bereich ~ 3 mm kaudal der Nase entfernt und erstreckt kaudal des cervical Wirbel. Augensalbe wird die Augen aufgetragen, um sie vor dem Austrocknen und Irritationen zu schützen. </li><li> Die Maus wird in ventralen recumbancy gelegt und die Haut wird mit chirurgischen Jod, 70% Ethanol, und sterile Tupfer desinfiziert. Ein 0,8 x 1,0 cm Hautlappen für den dorsalen Aspekt der frontalen und parietalen Knochen des Schädels entfernt mit einer feinen Schere. </li><li> Topische analgetische, 0,5% Lidocain, lokal an der Knochenhaut und den freiliegenden Gewebe am Umfang der Wunde aufgebracht wird. Das Periost wird durch leichtes Kratzen der Schädel mit einem Skalpell entfernt, dies wird die Sekundenkleber an den Knochen haften helfen. </li><li> Die kortikalen Bereich von Interesse auf dem Schädel mit einem Marker beschrieben. Das Gebiet von Interesse sollte nicht über Schädel Nahtlinien liegen, um Schäden an zugrunde liegenden großen Gefäße zu vermeiden. </li><li> Eine dünne Schicht aus Cyanacrylat-Klebstoff wird auf die Wundränder aufgebracht, um das Einsickern von serosanguinous Fluids zu verhindern, und der Schädel ausgenommender Bereich von Interesse. </li><li> Lichtaktivierten Dentalzement ist in unserem Protokoll zum Abdichten des Schädels eingesetzt. Vor dem Aufbringen der Dentalzement werden alle freiliegenden Schädels mit Ausnahme des Bereichs zum Verdünnen mit den Primern bestimmt und anschliessend mit dem Bindemittel aus der lichtaktivierten Dentalzement Kits behandelt. Sobald das Bindemittel getrocknet, das lichtaktivierte Dentalzement angelegt, um den Schädel bedecken. Um den Kopf der Maus für die nachfolgende Operation und Bildgebung zu stabilisieren, wird eine sterile # 00-90 Mutter in die Zahnzement in einem Abstand von dem Bereich verdünnt werden eingebettet. Der Einsatz von Licht-aktivierte Zahnzement ermöglicht es uns, den Schädel, ohne zu hetzen, um den gesamten Vorgang zu beenden vorzubereiten. Sobald die zahnärztliche Zement-Zubereitung am Schädel abgeschlossen ist, wird die zahnärztliche Zement mit sichtbarem Licht ausgehärtet werden. </li><li> Nachdem die zahnärztliche Zement ausgehärtet ist, wird ein Halter aus dem Kopfstück stereotaktischen Gerät zum Sechskantmutter an der Maus Kopf unter Verwendung eines # 00-90 Schraube montiert. </li><li> A drop Raumtemperaturlagerung, wird 0,9% steriler Kochsalzlösung zum Schädel Bereich verdünnbar aufgebracht. Mit Hilfe eines Stereomikroskops, wird eine Hochgeschwindigkeits-Mikro-Bohrer verwendet werden, um eine kreisförmige Fläche des Schädels (typischerweise ~ 4-5 mm Durchmesser) über den Bereich von Interesse zu verdünnen. Bohr und die Anwendung von Kochsalzlösung zu dem gebohrten Gebiet intermittierend während der Ausdünnung Verfahren durchgeführt, um thermische Schädigung der darunterliegenden cerebralen Gewebe zu vermeiden. Saline Wärme absorbiert und hilft auch erweichen die Knochen. </li><li> Die Maus Schädel besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen, zwischen denen eine dicke Schicht von Spongiosa. Die äußere Schicht aus kompaktem Knochen und die meisten der Spongiosa entfernt werden mit dem Bohrer. </li><li> Nachdem der größte Teil der Spongiosa entfernt wird, können die verbleibenden Hohlräume innerhalb des schwammigen Knochen unter einem Präpariermikroskop gesehen werden, was darauf hinweist, dass die Bohrungen nähert sich der interne kompakten Knochen Schicht. In diesem Stadium sollte Schädel Dicke noch mehr als 50 um betragen. Schädel Ausdünnung sollteweiterhin genau, um eine sehr dünne (~ 20 um) und glatte Zubereitung zu erhalten. </li><li> Sobald die gewünschte Dicke des Schädels erreicht wird (~ 20 Mikrometer), wird der Schädel ersten poliert mit eine maßgeschneiderte Silikon-Peitsche mit Diamantpaste (6-15 um) für ca. 10 min. Der Diamant-Paste Polieren dient zwei Zwecken. Erstens ist es weiter verdünnt das Schädel ohne Ausüben von Druck auf den verdünnten Schädels, wodurch zufällige Beschädigung des darunter liegenden Hirngewebe. Zweitens dient sie als Anfangswert Polierschritt für die ausgedünnten Schädels bevor das feinkörnige Zinnoxid zur weiteren Schädel Polieren verwendet wird. </li><li> Nach der Diamant-Paste Polieren wird die ausgedünnten Schädel mit Zinnoxid für etwa 10 min poliert. Nachdem der Schädel ist poliert, die Zinn-Oxid weg mit Kochsalzlösung gespült, bis die ausgedünnten Schädels scheint sauber. </li><li> Bei diesem Schritt, wenn der craniale Fenster ist, um in Längsrichtung in vivo-Bildgebung verwendet werden, wird das gereinigte dünnen Schädelbereich getrocknet. Ein kleiner Tropfen klarerCyanoacrylat Kleber aufgebracht wird, um den kranialen Fenster abzudichten. Die Schicht aus Sekundenkleber zwischen dem Schädel und dem ausgedünnten Deckplättchens sollte so dünn wie möglich. </li><li> Wenn eine Einspritzung nach Erstellung eines Ports kranialen Fensters ausgeführt werden, in diesem Schritt wird eine 26-Gauge-Nadel Spritze verwendet, um eine kleine Öffnung auf einer Seite des polierten dünnen Schädel-Fenster zu erzeugen. Diese Öffnung ist für GBM Zellinjektion verwendet. </li><li> Ein steriler Glaspipette mit einer Bahnöffnung etwa 50 um im Durchmesser gezogen wird mit einer Pipette abziehen. Diese Pipette für GBM Zellinjektion verwendet werden, und wird auf eine Mikromanipulator geladen. Die Pipette wird in einem 30-Grad-Winkel, so dass die GBM Zellinjektion Website wird von der endgültigen Imaging Website geladen. Die Spitze der Pipette unter einem Dissektionsmikroskop entfernt. Der GBM Zellsuspension Front-loaded in die Pipette durch Ansaugen mit Hilfe einer Spritzenpumpe. </li><li> Sobald die Injektionspipette mit GBM Zellen geladen wird, wird die Maus wieder unter th verschobene Mikroskop. Die Injektionspipette in Richtung der kleinen Öffnung in der kranialen Fenster abgesenkt und schließlich in das Gehirn durch die Öffnung mit einem Mikromanipulator eingesetzt. 1 ul einer GBM Zellsuspension wird in das Gehirn 100-200 um aus dem Gehirn Oberfläche (: 0,1 ul / min, Dauer: 10 min Geschwindigkeit) injiziert. </li><li> Der Schädel getrocknet wird, wird ein kleiner Tropfen klare Sekundenkleber auf das getrocknete Schädels angelegt wird, und ein Stück von 3 mm Größe Nr. 1 Deckglas an dem dünnen und poliert Schädelbereich haftet. Der Raum zwischen dem Deckglas und benachbart Dentalzement ist mit Sekundenkleber abgedichtet. </li><li> Nach der Operation wird die Maus subkutan mit 1 ml warmem sterilen Kochsalzlösung injiziert und mit zusätzlicher Hitze, um die Körpertemperatur zu halten, bis sie vollständig aus der Narkose zurückgewonnen. </li><li> Zum Abbilden sind Mäuse mit Ketamin und Xylazin in einer Dosierung von 0,1 mg Ketamin und 0,01 mg Xylazin pro 1 g Körpergewicht. Mäuse immobilisiert sind mit einem benutzerdefinierten stereotaktischen Rahmenunter dem Mikroskop. Wenn wiederholte in-vivo-Bildgebung auf täglicher Basis durchgeführt wird, werden Isofluoran eine bessere Option sein, da Mäuse Anzeichen von Abhängigkeit mit dem serienmäßigen Einsatz von Ketamin zu zeigen. </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Eine erfolgreiche Ports kranialen Fensters Chirurgie erlaubt die kraniale Fenster frei bleiben für Wochen bis Monate. Abbildung 1 zeigt das Gefäßsystem unter einer Ports kranialen Fenster visualisiert rückgestreuten Lichts. Diese Gefäße Bilder wurden als Landmarken für die Lokalisierung der gleichen Hirnareale für sich wiederholende Bildgebung verwendet. Um sowohl die Blutgefäße Endothelzellen und GBM-Zellen visualisieren, überquerten wir die B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J-Maus, die vaskulären Endothelzellen mit Etiketten versieht, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J-Maus und erzeugten Mäuse mit vaskulären Endothelzellen mit dem roten fluoreszierenden Protein tdTomato beschriftet. Wir haben dann durchgeführt den Häfen Kraniotomie Verfahren auf diese mice und GFP-markierten GBM Zellen ins Gehirn injiziert durch eine kleine Öffnung auf der Seite eines Schädel-Fenster. Wir haben dann in vivo durchgeführt Zwei-Photonen-Imaging in Längsrichtung auf den injizierten Mäusen. Der Laser wurde Anregungswellenlänge bei 910 nm, die bei der Erregung von sowohl GFP und tdTomato Folge eingestellt. Zwei-Photonen-Imaging wurde auf einem custom-built Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit zwei Detektoren für die gleichzeitige grün / rot Fluoreszenzdetektion Fähigkeit durchgeführt. Abbildung 2 zeigt eine in vivo Beispiel Gliom Einweihung von injiziert GBM-Zellen in der Nähe des Gefäßsystems. Die Ports kranialen Fenster ist auch eine ausgezeichnete Wahl für chronische Zeitraffer in vivo-Bildgebung. Abbildung 3 zeigt GFAP Färbung der kortikalen Bereiche von einer Maus ohne Anschlüsse Chirurgie, eine Maus 7 Tage folgende Ports Chirurgie, und eine Maus 7 Tage folgende Ports Chirurgie und Injektion von Kochsalzlösung. Es ist aus den Bildern, dass die Maus ohne Operation und der Maus mit PoR evidentTS Operation nicht Gliose, wohingegen nach Kochsalzinjektion Gliose im Hirngewebe der Maus beobachtet wird, durch Eindringen und Kochsalzinjektion im Gehirn pipettieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass Gliose nicht unter den Häfen kranialen Fensters auftreten, unabhängige Bestätigung dafür, dass die Ports kranialen Fensters hier beschriebenen nicht der Gliose, die typischerweise mit einer &quot;offenen Schädel&quot; chronische kranialen Fensters verbunden führen. Abbildung 4 zeigt hochauflösende Bildgebung von dendritischen Dornen aus der gleichen Maus auf den Tag der Operation (Tag 0) und 32 Tage nach der Ports Fenster Schöpfung (Tag 32), die zeigen, dass die Ports-Fenster ist auch eine ausgezeichnete Wahl für hochauflösende in vivo-Bildgebung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" /> Abbildung 1. Visualisierung von Gefäßen unter einem polierten und verstärkte ausgedünnt Schädel Schädel Fenster mit rückgestreuten Lichts. Tage stellen t<html> Er Anzahl von Tagen nach der Operation; Aufnahmen wurden beginnend mit dem Tag der Operation unmittelbar nach Abschluss der GBM Zellinjektion. Maßstab:. 0,5 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" /> Abbildung 2. Visualisierung injiziert GBM Zellen und Gefäße in vivo. Mäuse, die sowohl Tek-Cre und ROSA26 CAG-tdTomato wurden für GBM Zellinjektion verwendet. Vaskulären Endothelzellen wurden mit tdTomato (rot) markiert, und GBM-Zellen wurden mit GFP (grün) bezeichnet. Die Bilder wurden beginnend 24 Stunden nach GBM Zellinjektion. Eine Gesamtzahl von 10 bis 12 benachbarten Sichtfelder wurden entnommen und benachbart zusammengebaut, um einander mit den identifizierten injiziert GBM Zellen in der Mitte des gesamten Feldes, um die endgültigen Bilder zu erzeugen. Tage stehen für die Anzahl der Tage nach der Operation. Maßstab: 100 um.href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" /> Abbildung 3. Gliose nicht folgende Ports kranialen Fensters Operation auftreten. Obere Platten: Mouse Gehirn koronalen Abschnitt unter geringer Vergrößerung. Linkes Feld: eine Maus ohne kranialen Fensters Operation, keine GFAP Aktivierung im Hirngewebe beobachtet. Mitte: eine Maus mit einem Anschlüsse kranialen Fenster auf der rechten Seite des Gehirns erzeugt werden, keine GFAP Aktivierung im Hirngewebe beobachtet. Rechts: eine Maus mit einem Anschlüsse kranialen Fenster und Injektion von Kochsalzlösung aus der Seite der Anschlüsse Fenster. GFAP-Aktivierung auf der Seite des Ports Fenster beobachtet, aber nicht auf der Seite des intakten Hirngewebe. Maßstab: 1 mm. Unten: höherer Leistung Bilder von Hirngewebe in Bereichen wie in das weiße Feld der oberen Panel-Bilder angezeigt. Maßstab: 100 um. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" /> Abbildung 4. High-resolution imaging von dendritischen Dornen von Thy-1 YFPH Mäusen. Bilder wurden am Tag der Operation Ports erworben, und 32 Tage nach der Operation Ports. Es ist offensichtlich, von den Bildern, dass die meisten Stacheln präsentieren am Tag 0 deutlich sichtbar 32 Tage folgende Ports Operation sind. Maßstab: 2 um.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Ports kranialen Fensters ist die Ausdünnung und Polieren. Während der anfänglichen Verdünnung schnell durchgeführt werden kann, sollte darauf geachtet werden, homogene Ausdünnung des Schädels großflächig werden. Wir typischerweise eine dünne Schicht von Kochsalzlösung am Schädel und dann dünn der Schädel einem Durchlauf zu einem Zeitpunkt, so daß die Salzlösung verdampft kurz nachdem der Mikrobohrers hat über dem Schädel einmal durchlaufen. Dies ermöglicht uns, langsam aber homogen w...

<table border="1"><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM/F12 (1:1) mit Natriumpyruvat </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SH3026101 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Serum Kostenlose Zusatz (50x) </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-1 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin-Lösung </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Accutase-Enzyme Zellablösung Medium </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> T25-Kolben-Entlüftungskappe grün </td><td> SARSTEDT </td><td> 83.1810.502 </td><td></td></tr><tr><td> 70% Alkohol </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% Povidon-Iod topische Lösung </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Butler Animal Health Versorgung </td><td> NDC # 11695-0550-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Akorn, Inc. </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augensalbe </td><td> Dechra Veterinary Products </td><td> 17033-211-38 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5% Lidocain HCl </td><td> REGENT, Inc. </td><td> NDC 0517-0625-25 </td><td></td></tr><tr><td> Sekundenkleber </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Tupfer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-114 </td><td></td></tr><tr><td> Diamantpaste </td><td> Widget Versorgung </td><td> BBE60 </td><td></td></tr><tr><td> Zinn-Oxid </td><td> LORTONE, Inc. </td><td> 591-038 </td><td></td></tr><tr><td> Liner Bond 2V </td><td> Kuraray Medical Inc. </td><td> 1921-KA </td><td></td></tr><tr><td> Clearfil AP-X </td><td> Kuraray Medical Inc. </td><td> 1721-KA </td><td></td></tr><tr><td> Salzhaltig </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0720 </td><td></td></tr><tr><td> Sechskantmutter </td><td> Small Parts, Inc. </td><td> HNX-0090-C </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Syringepump.com </td><td> NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zwei-Photonen-Imaging-System </td><td> Custom built (Jegliche kommerzielle System würdearbeiten) </td><td></td><td></td></tr></table>

imaging gliom initiation<em&gt; in vivo</em&gt; durch eine poliert und reinforced thin-skull cranial fenster

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Gliom ist das eine der tödlichsten Formen von Krebs beim Menschen. Die effektivste Gliom Therapie date-Operation durch Strahlung gefolgt Behandlungs-Patienten bietet nur bescheidene Vorteile, da die meisten Patienten nicht überleben länger als fünf Jahre nach der Diagnose aufgrund Gliom Rückfall 1,2. Die Entdeckung von Krebsstammzellen in menschlichen Hirntumoren hält Versprechen für einen enormen Einfluss auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für Gliome 3. Krebsstammzellen sind durch ihre Fähigkeit sowohl sich selbst zu erneuern und zu differenzieren definiert und sind gedacht, um die einzigen Zellen in einem Tumor, der die Fähigkeit zur Initiierung neuen Tumoren 4 verfügen. Gliom Rezidiv nach Strahlentherapie wird angenommen, dass aus dem Widerstand von Gliomen Stammzellen (GSCs) auf die Therapie ergeben 5-10. In vivo werden GSCs gezeigt, dass in einer perivaskulären Nische, die wichtig ist für den Erhalt ihrer Stammzell-ähnliche Eigenschaften 11-14 befinden . Zentral für die Organisationsierung der GSC Nische vaskulären Endothelzellen 12. Hinweise darauf, dass bestehende GSCs und deren Wechselwirkung mit den vaskulären endothelialen Zellen wichtig sind für die Tumorentwicklung und identifizieren GSCs und ihre Wechselwirkung mit Endothelzellen als wichtige therapeutische Ziele für Gliom. Die Anwesenheit von GSCs wird experimentell durch ihre Fähigkeit, neue Tumoren nach orthotopen Transplantation 15 einzuleiten bestimmt. Dies wird typischerweise durch Einspritzen einer bestimmten Anzahl von GBM Zellen aus menschlichen Tumoren in die Gehirne von stark immuno-defizienten Mäusen oder von Maus-GBM-Zellen in die Gehirne von Mäusen isoliert kongenen Host erreicht. Assays für das Tumorwachstum werden dann nach einer ausreichenden Zeit, damit GSCs unter den injiziert GBM Zellen zu neuen Tumoren-Regel mehrere Wochen oder Monate zu ergeben. Daher müssen bestehende Assays nicht zulassen Prüfung der wichtigsten pathologischen Prozess der Tumorinitiation von einzelnen GSCs in vivo. Folglich wesentliche insights in die spezifischen Aufgaben der GSCs und deren Interaktion mit den vaskulären Endothelzellen in den frühen Stadien der Tumorinitiation fehlen. Solche Einblicke sind entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Gliome und wird große Auswirkungen zu verhindern Gliom Rückfall in Patienten haben. Hier haben wir angepasst den Häfen kranialen Fenster-Prozedur 16 und in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Visualisierung des Tumors Einweihung von injizierten GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus ermöglichen. Unsere Technik wird den Weg ebnen für zukünftige Bemühungen um die wichtigsten Signal-Mechanismen zwischen GSCs und vaskuläre Endothelzellen während Gliom Einleitung aufzuklären.

Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Das Gliom ist eine der tödlichsten Formen von menschlichen Krebserkrankungen. Die bislang wirksamste Gliomtherapie – eine chirurgische Operation gefolgt von einer Strahlentherapie – bietet ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anfangsstadien der Gliom-Initiierung aus einzelnen injizierten Glioblastomzellen in vivo zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Bereich des Mausschädels auf eine Dicke abgedünnt wird, die für die in vivo-Bildgebung geeignet ist. Anschließend wird der dünne Schädelbereich poliert.Dann werden GFP-markierte Glioblastomzellen in das Maushirn injiziert und das Schädelfenster wird zur In-vivo-Bildgebung versiegelt. Schließlich werden die injizierten Glioblastomzellen täglich abgebildet, um die Gliom-Initiierung aus den injizierten Glioblastomzellen in vivo zu visualisieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die in vivo Gliom-Initiierung nach einer einzigen Injektion von Glioblastomzellen sowie deren Beziehung zu vaskulären endothelialen Zellen mittels zweifarbiger In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigen.Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Krebsstammzellen beantwortet werden, beispielsweise die entscheidende Rolle der Interaktion zwischen Gliom-Stammzellen und vaskulären endothelialen Zellen sowie die In-vivo-Initiierung von Gliomen. Das Verfahren wird unter der Leitung von JAK Surgical Services und postal in meinem Labor durchgeführt. Um sich auf den chirurgischen Eingriff vorzubereiten, werden alle chirurgischen Instrumente, einschließlich des Zahnbohrers, im Autoklaven mit Wasserdampf sterilisiert, nachdem die Maus mit Ketamin und Xylazin anästhesiert und ein Analgetikum verabreicht wurde. Überprüfen Sie den Anästhesiegrad durch einen Zehenquetschtest mithilfe eines kleinen elektrischen Rasierers. Entfernen Sie das Fell vom dorsalen Kopfbereich in etwa dreieckiger Form, etwa drei Millimeter, kaudal zur Nasenöffnung und kaudal bis zu den Halswirbeln reichend.Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf. Legen Sie die Maus in Bauchlage und verwenden Sie chirurgisches Jod, gefolgt von 70 % Ethanol. Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie das Tier auf ein Wattepad legen und es auf eine Heizplatte überführen.Um eine Körpertemperatur von etwa 37 Grad Celsius aufrechtzuerhalten, tragen Sie ein topisches Analgetikum auf das Periost und die exponierten Gewebe der Wunde auf. Entfernen Sie mithilfe einer Skalpellklinge das Periost, indem Sie vorsichtig über den Schädel kratzen. Dies trägt dazu bei, dass der Cyanoacrylat-Klebstoff am Knochen haftet.Verwenden Sie anschließend einen Markierstift, um den kortikalen Bereich von Interesse abzugrenzen, und achten Sie darauf, Nähtelinien zu vermeiden, um die darunterliegenden großen Gefäße nicht zu beschädigen. Tragen Sie dann eine dünne Schicht aus Cyanoacrylat-Klebstoff auf die Wundränder auf, um das Austreten serosanguinöser Flüssigkeit zu verhindern, sowie auf den Schädel, mit Ausnahme des Bereichs von Interesse, bevor Sie den Schädel mit lichtaktiviertem Zahnzement verschließen. Behandeln Sie die gesamte freiliegende Schädeloberfläche, ausgenommen den für das Ausdünnen vorgesehenen Bereich, mit Primer und anschließendem Bonding-Agent. Sobald der Bonding-Agent getrocknet ist, bedecken Sie den Schädel mit Zahnzement, um den Kopf der Maus zu stabilisieren.Bei chirurgischen Eingriffen und der Bildgebung wird eine Doppelnulleinschraubmutter (90-Hex) in den Zahnzement eingebettet, wobei ein gewisser Abstand zum Bereich, der abgeschliffen werden soll, eingehalten wird. Sobald die Herstellung des Zahnzements abgeschlossen ist, wird dieser mit sichtbarem Licht ausgehärtet. Anschließend wird mithilfe einer Null-Null-Schraubhalterung (90) der Kopfstückhalter des stereotaktischen Geräts an der Einschraubmutter befestigt.Als Nächstes platzieren Sie den Kopf der Maus unter ein Stereomikroskop und geben einen Tropfen sterilem, 0,9%igem Salzlösung bei Raumtemperatur auf den Bereich des Schädels, der abgeschliffen werden soll. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer, um einen kreisförmigen Bereich des Schädels über einer Region von Interesse zu dünneren. Um eine thermische Schädigung des darunterliegenden Gehirngewebes zu vermeiden, unterbrechen Sie das Bohren intermittierend und tragen Salzlösung auf.Der Mausschädel besteht aus zwei dünnen Schichten kompakten Knochens, zwischen denen sich eine dicke Schicht von schwammigem Knochengewebe befindet. Entfernen Sie mit dem Bohrer die obere dünne Schicht und den größten Teil des schwammigen Knochens. Sobald der Großteil des schwammigen Knochens entfernt ist, können die verbleibenden Hohlräume im schwammigen Knochengewebe unter dem Stereomikroskop sichtbar gemacht werden, was darauf hinweist, dass das Bohren die innere Schicht des kompakten Knochens erreicht hat.Zu diesem Zeitpunkt sollte die Schädelstärke noch über 50 Mikrometer liegen. Fahren Sie vorsichtig mit dem Ausdünnen des Schädels fort, um eine sehr dünne und glatte Präparation zu erhalten. Um den Schädel weiter auszudünnen, verwenden Sie eine speziell angefertigte Silikonpeitsche und Diamantpaste, um ihn etwa 10 Minuten lang zu polieren.Polieren Sie den Schädel weitere 10 Minuten mit feinkörnigem Zinnoxid. Spülen Sie das Zinnoxid mit Kochsalzlösung ab, bis das dünne Schädelstück sauber erscheint. Um eine Injektion durchzuführen, verwenden Sie eine 26-Gauge-Spritzennadel, um unter dem Mikroskop eine kleine Öffnung auf einer Seite des polierten Fensters zu erzeugen.Senken Sie die Pipettenspitze mithilfe des Mikromanipulators durch das Loch im Schädel Fenster und in das Gehirn, 100 bis 200 Mikrometer tief. Injizieren Sie anschließend ein Mikroliter Zellsuspension mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrolitern pro Minute.Nachdem die Nadel entfernt wurde, um das Schädel Fenster zu verschließen, den Schädel trocknen und einen kleinen Tropfen klaren Cyanoacrylat-Kleber sowie ein 3 mm großes Deckglas der Nummer eins auftragen. Mit Cyanoacrylat-Kleber den Spalt zwischen dem Deckglas und dem angrenzenden Zahnzement verschließen.Nach der Operation das Maus subkutan mit einem Milliliter warmer steriler Kochsalzlösung injizieren und zusätzliche Wärmezufuhr bereitstellen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, bis die Maus sich vollständig von der Narkose erholt hat. Täglich subkutane Injektionen eines Analgetikums über fünf Tage nach der Operation verabreichen und die Maus täglich beobachten, um sicherzustellen, dass die Wunde ordnungsgemäß heilt und dass die Maus isst, trinkt und sich normal verhält, um abzubilden. Nach der Narkotisierung der Maus mit Ketamin und Xylazin diese mithilfe eines individuell angefertigten stereotaktischen Halterungsrahmens unter dem Mikroskop fixieren.Eine erfolgreiche Ports-Schädeldeckenfenster-Operation ermöglicht es, dass das Schädeldeckenfenster über Wochen bis Monate klar bleibt. Diese Abbildung zeigt die Gefäßstruktur zwischen dem Schädeldeckenfenster eines Ports, dargestellt mittels rückgestreutem Licht. Diese Gefäßbilder wurden als Orientierungspunkte verwendet, um dieselben Hirnareale bei wiederholten Bildgebungsverfahren zu lokalisieren.Um sowohl die vaskulären endothelialen Zellen als auch die GBM-Zellen sichtbar zu machen, wurden Mäuse erzeugt, bei denen die vaskulären endothelialen Zellen mit dem roten fluoreszierenden Protein TD-Tomato markiert waren. Nach dem portalen Kraniotomieverfahren wurden GFP-markierte GBM-Zellen in ihre Gehirne injiziert, und eine in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung wurde durchgeführt. Dargestellt ist hier ein Beispiel in vivo für die Gliominitiierung aus injizierten GBM-Zellen in der Nähe der Gefäßwand.Diese Abbildung zeigt GFAP-Färbungen von kortikalen Schnitten eines Mäuses ohne Port-Operation, eines Mäuses sieben Tage nach Port-Operation und eines Mäuses sieben Tage nach Port-Operation mit Salzinjektion. Aus den Bildern ist ersichtlich, dass weder das Tier ohne Operation noch das Tier mit Port-Operation eine Gliose aufweist. Dagegen tritt nach Salzinjektion eine Gliose im Gehirngewebe des Mäuses aufgrund der Pipettenpenetration und der Injektion von Salzlösung im Gehirn auf.Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Gliose unter dem Schädel-Fenster des Ports nicht auftritt. Dies liefert eine unabhängige Bestätigung dafür, dass das hier beschriebene Schädel-Fenster des Ports nicht zu der Gliose führt, die typischerweise mit einem offenen Schädel-Fenster bei chronischen Präparaten assoziiert ist. Hier werden hochauflösende Aufnahmen von dendritischen Dornen desselben Mäuses am Tag der Operation, am Tag null sowie 32 Tage nach der Herstellung des Port-Fensters gezeigt.Es wird gezeigt, dass das Fenster des Ports ebenfalls eine hervorragende Wahl für die hochauflösende In-vivo-Bildgebung darstellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Gliom-Initiierung durch die Injektion von Glioblastomzellen durch ein poliertes und verstärktes Schädelfenster bildlich dargestellt werden kann.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

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