Heterotypische Dreidimensionale In Vitro Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, dreidimensionale typische Modelle für die Entwicklung von Eierstockkrebs im Frühstadium zu generieren. Zuerst werden H-turt-immortalisierte Zelllinien erzeugt, die aus primärem, normalem Eierstockepithel- und Fibroblastengewebe stammen. Um die in vivo-Architektur und die komplexen Zellinteraktionen, die in der Co-Kultur der Eierstöcke vorhanden sind, nachzubilden, fahren Epithel- und Stromazelllinien in dreidimensionalen S-Sphäroidmodellen fort, um die Organoidkulturen zu fixieren und zu färben und die Expression spezifischer Marker zu analysieren, um die molekularen Merkmale von Stromaepithelinteraktionen zu untersuchen.

Die erzielten Ergebnisse zeigen, wie Veränderungen im Stromazellkompartiment von 3D-typischen Modellen den Phänotyp von co-kultivierten Epithelzellen beeinflussen können. Dreidimensionale typische Modelle können helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Eierstockkrebsforschung zu beantworten, wie z. B. die Erforschung der Ursprünge dieser Krankheit und die Aufklärung der Rolle der stromalen Mikroumgebung bei der Tumorentstehung und -entwicklung. Die Anwendungen dieser Techniken erstrecken sich im Vergleich zu anderen 3D-Kultivierungsmethoden auf die Diagnose und Therapie von Krankheiten.

Diese Technik kann auf ein breiteres Spektrum von Zellkulturvolumina und Downstream-Anwendungen angewendet werden. So können beispielsweise 3D-Homo- und typische Kulturen für In-vitro-Wirkstofftests verwendet werden. Dieser Ansatz kann auch auf andere Modellsysteme angewendet werden, z. B. bei der Untersuchung anderer solider Tumorarten oder bei gutartigen Erkrankungen.

Transportieren Sie das frische Eierstockgewebe in immortalisiertem normalem Ovarialfibroblasten-Wachstumsmedium, das mit zusätzlichen Antibiotika und Antibiotika ergänzt wird, zum Zellkulturlabor. Waschen Sie die Probe dreimal mit fünf Millilitern PBS, um alle Epithelzellen zu entfernen, die lose am Gewebe haften. Übertragen Sie anschließend die Probe plus PBS in eine saubere P 100-Kulturschale. Übertragen Sie das Gewebe mit sterilen Instrumenten in eine zweite trockene P 100-Reinkulturschale.

Das Taschentuch in 0,5 Quadratzentimeter große Stücke schneiden und jedes Stück in eine separate P 100 Schale geben. Schneide das Taschentuch weiter in Stücke, die weniger als einen Quadratmillimeter groß sind. Fügen Sie dann 20 Milliliter INOF GM-Medien hinzu und kultivieren Sie den Monitor für das Zellwachstum mittels Phasenmikroskopie.

Vergewissern Sie sich, dass die Zellen innerhalb von 24 Stunden an der Schale haften. Überwachen Sie das Zellwachstum mit Phasenmikroskopie Die Zellen haften in der Regel innerhalb von 24 Stunden nach einer Woche an der Schale. Entfernen Sie nicht anhaftendes Gewebe durch Aspiration, füllen Sie das Medium auf und füttern Sie die Kulturen danach zweimal pro Woche innerhalb von ein bis drei Wochen, wenn die Zellkolonien etwa 500 Mikrometer groß sind.

Isolieren Sie die Klone mit Hilfe von Auslösern und beschichteten Klon-Discs. Um 100% fibroblastische Zellen zu bestätigen. Plattieren Sie eine Probe der Zelllinie auf gläserne Deckgläser und führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung für einen fibroblastischen Marker, einen Epithelmarker und einen Endothelzellmarker durch.

Einen Tag vor der retroviralen Transduktion der H Turt-Passage isoliert sich die normale Ovarialfibroblastenzelle aus einer einzigen P 100-Schale in drei P 100-Schalen. Vorgefertigtes virales SUP natan kann unter Verwendung von Standardprotokollen für die Transfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen erworben oder im eigenen Haus hergestellt werden. Um die Poly-Hema-Lösung herzustellen, wiegen Sie 1,5 Gramm Poly-Hema ab und geben Sie sie in eine sterile Flasche.

Fügen Sie 95 Milliliter Molekularbiologie, absolutes Ethanol und fünf Milliliter destilliertes Wasser in Zellkulturqualität hinzu. Legen Sie die Poly-Hema-Lösung in ein Wasserbad bei 65 Grad Celsius, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Bestreichen Sie die Gewebekulturschalen mit frisch hergestellter Poly-Hema-Lösung.

Trocknen Sie die Zellkulturschalen an der Luft in der Laminar-Flow-Haube. Durch sanftes Schaukeln auf einer Wippplattform kann eine gleichmäßige Beschichtung von größeren Schalen oder Kolben gewährleistet werden. Wenn die Polyuslösung zu schnell trocknet, wird die Oberfläche nicht glatt.

Falls gewünscht, behandeln Sie die Fibroblasten vor der 3D-Kultur, z. B. zur Induktion der Seneszenz, und behandeln Sie die Zellen mit subletalen Dosen von Wasserstoffperoxid vor. Gewinnung und Erweiterung der INOF- und Epithelzellkulturen in vitro, um genügend Zellen für die Etablierung von heterotopen 3D-Steroiden vorzubereiten. Nach einer fünfminütigen PBS-Wäsche gibst du 15 Milliliter Medium in die Poly-Häma-Platte.

In der Zwischenzeit fügen Sie den immortalisierten normalen Fibroblastenzellen der Eierstöcke Trypsin hinzu, um sie von der Kulturschale zu lösen. Nach drei bis fünf Minuten neutralisieren Sie das Trypsin mit einem gleichen Volumen Kulturmedium und ernten die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Medium und mischen Sie es gut, indem Sie auf und ab pipettieren oder vorsichtig vortexen.

Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter-Probe, um lebensfähige Zellen mit Trianblau zu zählen. Fügen Sie nun 4 Millionen INOF-Zellen zu dem Medium hinzu, das bereits in die Poly-Häma-beschichtete Platte dosiert wurde. Füllen Sie das Volumen des Nährmediums auf 20 Milliliter auf und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid.

Überwachen Sie die zelluläre Aggregation zu mehrzelligen Steroiden durch Phasenmikroskopie, um die S-Sphäroidkulturen alle zwei bis drei Tage neu zu füttern. Legen Sie die Platten schräg auf eine Pipette. Lassen Sie die Sphäroide sich absetzen und entfernen Sie vorsichtig etwa 16 Milliliter des erschöpften Mediums mit einer Fünf-Milliliter-Pipette.

Geben Sie 16 Milliliter frisches Medium in die Kultur und kehren Sie am siebten Tag in den Inkubator zurück. Erstellen Sie heterotypische Kulturen, indem Sie den Fibroblasten phe Epithelzellen hinzufügen. Bereiten Sie zunächst Suspensionen von Eierstockepithelzellen durch Trypsin vor, wie zuvor beschrieben, nachdem Sie Zellen aufgezählt haben.

Einmal in INOF GM-Medium waschen, um zu verhindern, dass Wachstumsfaktoren aus dem epithelialen Wachstumsmedium übertragen werden. Nach dem Auffüllen des Mediums mit den Fibroblasten-OID-Kulturen werden die Epithelzellen in einem Verhältnis von vier zu eins Fibroblasten in die Epithelzellkultur gegeben. Die heterotopen OIDs in INOF GM füttern typische Kulturen alle zwei bis drei Tage für weitere 14 Tage.

Für die Immunhistochemie fixieren Sie das PHE mit neutralem gepuffertem Formin, pelletieren Sie das PHE und ersetzen Sie das Formalin durch 70%iges Ethanol. Fahren Sie mit der Verarbeitung zu Paraffin unter Verwendung von Standardprotokollen fort, die für menschliches Gewebe verwendet werden. In Paraffin eingebettete Steroide können unter Verwendung der immunhistischen Chemie mit h und e spezifischer molekularer Marker geschnitten und gefärbt werden.

Alternativ können Sie die Steroide in PBS waschen und in 4%para-Formaldehyd fixieren. Anschließend betten Sie die Proben in OCT-Medium und Snap-Freeze für Kryostatenschnitte und Immunfluoreszenzfärbungen für die Analyse durch Durchflusszytometrie ein. Waschen Sie die Steroide in PBS und dissoziieren Sie durch Trypsin- oder Accutane-Verdauung bei 37 Grad Celsius.

Die vollständige Dissoziation von Steroiden in eine Einzelzellsuspension kann gefördert werden, indem die Lösung mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf und ab pipettiert wird. Achten Sie darauf, die Zellen nicht zu überdimensionieren, neutralisieren Sie die Reaktion mit einem gleichen Volumen des Kulturmediums und entfernen Sie Zellklumpen, indem Sie die Suspension durch ein 40 bis 70 Mikrometer Zellsieb leiten. Pelletieren Sie dann die Zellen und waschen Sie sie mit PBS und zählen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen auf, puffern und färben Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers. In unserem Labor haben wir Eierstockepithelzellen teilweise transformiert und diese Zellen mit normalen und seneszenten Eierstockfibroblasten cokultiviert, um die Entwicklung von Eierstockkrebs im Frühstadium nachzuahmen.

In einer prämenopausalen Immunfluoreszenzfärbung von h hert immortalisierten normalen ovariellen Fibroblasten zeigen, dass sowohl primäre normale ovarielle Fibroblasten als auch immortalisierte normale ovarielle Fibroblasten fibroblastenspezifisches Protein exprimierten, aber sie exprimierten kein Cytokeratin sieben und exprimieren kein Menton. Normale ovarielle Fibroblastenzellen, die allein in 3D-Form PHE kultiviert werden, weisen eine spindelförmige Morphologie und eine reichlich vorhandene extrazelluläre Matrix auf. Hier wurden normale ovarielle Fibroblasten sieben Tage lang Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um die Seneszenz zu induzieren, und dann 14 Tage lang mit teilweise transformierten Ovarialepithelzellen kultiviert.

Zur Unterscheidung der beiden Zelltypen wurden die resultierenden Steroide immungefärbt für mim eins als Proliferationsmarker und pan cytokeratin als epithelialen Marker. Die Quantifizierung der Daten deutet darauf hin, dass die alternde Mikroumgebung neoplastische Merkmale von teilweise transformierten Epithelzellen fördert, während eine normale Mikroumgebung die neoplastische Progression hemmt, histologische Merkmale normaler und bösartiger Zellen, die nicht nachweisbar sind, wenn die Zellen kultiviert werden, da Monoschichten wiederhergestellt werden. Wenn die Zellen beispielsweise in eine Sphäroidkultur überführt werden, können histologische Merkmale von klarzelligem Eierstockkrebs in 3D-Kulturen von klarzelligen Eierstockkrebszelllinien nachgewiesen werden, nicht jedoch in Monolayer-Kulturen derselben Zellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dreidimensionale typische Kulturen einrichten, mit denen Sie die Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Stromazellen untersuchen können. Während der frühen Tumorgenese. Bei der Einrichtung einer 3D-Kultur ist es wichtig, die Zellzahlen entsprechend der nachgelagerten Anwendung anzupassen, was zu einem gewissen Materialverlust während der Verarbeitung führt.

Einmal gemeistert, können 3D-Kulturen nach diesem Verfahren in einer Stunde eingerichtet werden. Andere Methoden, wie z. B. die Durchflusszytometrie in Kombination mit der Erstellung von Mikrostrahlenprofilen der Genexpression, können durchgeführt werden, um die globalen Veränderungen der Genexpression zu analysieren, die in 3D-typischen Kulturen auftreten, aber unter Monolayer-Kulturbedingungen nicht nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die Entschlüsselung der bidirektionalen Signalwege, die spezifisch unter einer 3D-Kernkultur auftreten. Mikroumgebung.