Name: Heterotypische Dreidimensionale In Vitro Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung heterotypischer 3D-Kulturen zur Untersuchung stromal-epithelialer Interaktionen beim Eierstockkrebs. Diese Methode ermöglicht die Analyse früher Tumorentwicklung und Mikroumgebungseinflüsse.

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Diese Arbeit wurde an der Keck School of Medicine, University of California, USA, und am University College London, UK durchgeführt. KL wird von National Institute of Health Gewährung 5 U19 CA148112-02 finanziert. BG wurde von einer Projektgruppe Zuschuss aus dem Eve Appeal gynäkologische Onkologie Charity (UK) finanziert. Einige dieser Arbeiten am UCLH / UCL durchgeführt wurde teilweise Finanzierung aus dem Department of Health NIHR Biomedical Research Centre Förderprogramm.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Biologie der Early-Stage-epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist wenig bekannt. Vielleicht eines der Haupthindernisse in diesem Bereich seit vielen Jahren war der Mangel an Verständnis für die Gewebe-spezifische Ursachen der Krankheit und die Bedeutung der Rolle der Mikroumgebung in EOC Entwicklung. In den letzten Jahren hat sich herausgestellt, dass sich EOC eine heterogene Erkrankung mit mehreren unterschiedlichen Subtypen histopathologischen, wahrscheinlich mit verschiedenen zellulären Ursprung für verschiedene Su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> PolyHEMA, geeignet für die Zellkultur </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P3932 </td></tr><tr><td> Molekularbiologie Ethanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> Sterilem Wasser für die Zellkultur </td><td> VWR </td><td> 12001-356 </td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M6395 </td></tr><tr><td> Medium 199 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M2154 </td></tr><tr><td> Hyclone Fötales Rinderserum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30088.03 </td></tr><tr> &lt;td&gt; Gentamicin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1397 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td></tr><tr><td> pBABE-Hygro-hTERT </td><td> Addgene </td><td> 1773 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> VWR </td><td> 12001-766 </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-072 </td></tr><tr><td> Zellsieb (40 oder 70 m) </td><td> VWR </td><td> 21008-949 21008-952 </td></tr><tr><td> Anti-Fibroblasten Oberflächenprotein Antikörper, Klon 1B10 </td><td> Sigma </td><td> F4771 </td></tr><tr><td> Anti-pan-Zytokeratin Antikörper (C11) </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8018 </td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimethrinbromid) </td><td> Sigma </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS </td><td> Roche </td><td> 12013789001 </td></tr><tr><td> TeloTAGGG Telomere Länge Assay </td><td> Roche </td><td> 12209136001 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien und Geräte im Sinne dieser Studie.

heterotypische dreidimensionale<em&gt; in vitro</em&gt; modellierung von stromal-epithelial interaktionen beim eierstockkrebs initiation und progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelialen Eierstockkrebs (EOC) sind die häufigste Todesursache bei gynäkologischen Malignomen in westlichen Gesellschaften. Trotz der Fortschritte in der chirurgischen Behandlungen und verbesserten Platin-basierten Chemotherapie, hat es wenig Verbesserung EOC Überlebensraten für mehr als vier Jahrzehnten 1,2. Während im Stadium I Tumoren haben 5-Jahres-Überlebensraten&gt; 85%, sind die Überlebensraten für Stufe III / IV der Krankheit &lt;40%. So konnten die hohen Sterblichkeitsraten für EOC deutlich verringert werden, wenn die Tumore bei früheren, mehr behandelbar, Stufen 3-5 nachgewiesen wurden. Derzeit wird die molekulare genetische und biologische Grundlage der frühen Stadium der Erkrankung die Entwicklung nur unzureichend verstanden. Genauer gesagt, ist nur wenig über die Rolle der Mikroumgebung während Tumorinitiation bekannt, aber bekannten Risikofaktoren für EOC (zB Alter und Parität) legen nahe, dass die Mikroumgebung eine zentrale Rolle spielt in der frühen Entstehung der EOC. Wir entwickelten deshalb dreidimensionale heterotypische Modellesowohl der normalen Ovar und frühzeitig Eierstockkrebs. Für den normalen Ovar, wir co-kultivierten normalen Ovarien Oberflächenepithelzellen (IOSE) und normalen Stromazellen Fibroblasten (Inof) Zellen durch Transduktion retrovrial der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase Holoenzym (hTERT), um die Lebensdauer dieser Zellen in Kultur immortalisierten erstrecken. Um die frühesten Stadien der Ovarialepithelzellen Zelltransformation Überexpression des CMYC Onkogen in IOSE Zellen, wieder mit Inof Zellen co-kultiviert modellieren. Diese heterotypische Modelle wurden verwendet, um die Auswirkungen des Alterns und der Seneszenz der Transformation und Invasion von Epithelzellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die methodischen Schritte Entwicklung dieser dreidimensionalen Modells; diese Methoden sind nicht spezifisch für die Entwicklung einer normalen Ovar und Eierstockkrebs Geweben und könnte verwendet werden, um andere Gewebearten zu untersuchen, wo stromalen und epithelialen Zell-Wechselwirkungen sind ein grundlegendes Aspekt des Gewebes Wartung und diSease Entwicklung.

Wir beschreiben Methoden zur Gründung<em&gt; In vitro</em&gt; Heterotypische dreidimensionalen Modellen, umfassend ovariellen normalen Fibroblasten und Eierstock Oberfläche oder Eierstockkrebs Epithelzellen. Wir diskutieren den Einsatz dieser Modelle Stroma-Epithel-Interaktionen, die während Eierstockkrebs Entwicklung auftreten studieren.

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Epitheliale Ovarialkarzinome (EOCs) sind die häufigste Todesursache aufgrund gynäkologischer Malignome in westlichen Gesellschaften. Trotz Fortschritten in der chirurgischen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dreidimensionale typische Modelle der frühen Ovarialkarzinomentwicklung zu erzeugen. Erzeugen Sie zunächst H turt-immortalisierte Zelllinien, die aus primären, normalen ovariellen Epithel- und Fibroblastengeweben stammen. Anschließend werden die in vivo vorhandene Architektur sowie die komplexen Zell-Zell-Interaktionen im Eierstock durch eine Kokultur von epithelialen und stromalen Zelllinien in dreidimensionalen S-Sphäroidmodellen nachgebildet. Danach werden die Organoidkulturen fixiert und gefärbt, um die Expression spezifischer Marker zu analysieren und molekulare Merkmale der Strom-Epithel-Interaktionen zu untersuchen.Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, wie Veränderungen im stromalen Zellkompartiment dreidimensionaler typischer Modelle den Phänotyp ko-kultivierter epithelialer Zellen beeinflussen können. Dreidimensionale typische Modelle können dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Ovarialkarzinom-Forschung zu beantworten, beispielsweise die Erforschung der Entstehungsursachen dieser Erkrankung sowie die Aufklärung der Rolle der stromalen Mikroumgebung bei der Tumorentstehung und -entwicklung. Die Anwendung dieser Techniken reicht im Vergleich zu anderen 3D-Kultivierungsmethoden bis hin zur Diagnose und Therapie von Erkrankungen.Diese Technik kann auf ein breiteres Spektrum an Zellkulturvolumina und nachgeschaltete Anwendungen angewendet werden. Beispielsweise können 3D-homo- und typische Kulturen für die In-vitro-Wirkstoffprüfung verwendet werden. Der Ansatz kann auch auf andere Modellsysteme angewendet werden, wie beispielsweise bei der Untersuchung anderer solider Tumortypen oder bei gutartigen Erkrankungen.Transportieren Sie das frische Ovarialgewebe in einem Wachstumsmedium für immortalisierte normale Ovarialfibroblasten, das mit zusätzlichen Antibiotika und Antimykotika angereichert ist, in das Zellkulturlabor. Waschen Sie die Probe dreimal mit je fünf Milliliter PBS, um eventuell locker am Gewebe anhaftende epitheliale Zellen zu entfernen. Danach überführen Sie die Probe zusammen mit dem PBS in eine saubere P-100-Kulturschale. Übertragen Sie das Gewebe mithilfe steriler Instrumente in eine zweite trockene, saubere P-100-Kulturschale.Schneiden Sie das Gewebe in Stücke von 0,5 Quadratzentimetern und überführen Sie jedes Stück in eine separate P-100-Schale. Setzen Sie das Zerschneiden des Gewebes fort, bis die Stücke kleiner als ein Quadratmillimeter sind. Geben Sie dann 20 Milliliter INOF-GM-Medium hinzu und kultivieren Sie; überwachen Sie das Zellwachstum mittels Phasenkontrastmikroskopie.Überprüfen Sie, ob die Zellen innerhalb von 24 Stunden an der Schale haften. Überwachen Sie das Zellwachstum mittels Phasenkontrastmikroskopie. Normalerweise heften sich die Zellen innerhalb von 24 Stunden an. Nach einer Woche entfernen Sie jegliches nicht-angewachsene Gewebe durch Absaugen, erneuern das Medium und füttern die Kulturen danach ein- bis dreimal pro Woche, sobald die Zellkolonien eine Größe von etwa 500 Mikrometern erreichen.Isolieren Sie die Klone mithilfe von Triplicaten und beschichteten Klonierungsscheiben. Um fibroblastische Zellen zu 100 % zu bestätigen, geben Sie eine Probe der Zelllinie auf Glasdeckgläser und führen eine immunfluoreszenzchemische Färbung für einen fibroblastischen Marker, einen epithelialen Marker und einen endothelialen Zellmarker durch.Ein Tag vor der retroviralen Transduktion von H Turt-Passagen werden die normalen ovariellen Fibroblasten-Zellisolate von einer einzelnen P-100-Schale in drei P-100-Schalen überführt. Vorgefertigte virale Überstände können gekauft oder im Labor mithilfe standardisierter Protokolle zur Cotransfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen hergestellt werden. Um die Poly-Hema-Lösung vorzubereiten, wiegen Sie 1,5 Gramm Poly Hema ab und geben Sie es in eine sterile Flasche.Geben Sie 95 Milliliter absoluten Ethanol der Molekularbiologie-Reinheit und 5 Milliliter destilliertes Wasser der Zellkulturreinheit hinzu. Stellen Sie die Poly-Hema-Lösung in ein Wasserbad bei 65 Grad Celsius, bis sie vollständig gelöst ist. Beschichten Sie die Zellkulturschalen mit frisch hergestellter Poly-Hema-Lösung. Trocknen Sie die Zellkulturschalen in der laminaren Luftwerkbank luftdicht. Ein sanftes Schaukeln auf einer Schüttelplattform kann verwendet werden, um eine gleichmäßige Beschichtung von größeren Schalen oder Kolben sicherzustellen. Wenn die Polyus-Lösung zu schnell trocknet, wird die Oberfläche nicht glatt sein.Falls gewünscht, können die Fibroblasten vor der 3D-Kultur vorbehandelt werden, beispielsweise durch Gabe subletaler Dosen von Wasserstoffperoxid zur Induktion von Zellalterung. Gewinnen und vermehren Sie die INOF- und epithelialen Zellkulturen in vitro, um eine ausreichende Zellzahl für die Herstellung von 3D-heterotopen Steroiden zu erhalten. Nach einem fünfminütigen PBS-Spülschritt fügen Sie 15 Milliliter Medium in die Poly-Hema-Platte hinzu.Unterdessen Trypsin zu den immortalisierten normalen ovariellen Fibroblasten hinzufügen, um sie von der Kulturschale zu lösen. Nach drei bis fünf Minuten das Trypsin mit einem gleichen Volumen Kulturmedium neutralisieren und die Zellen durch Zentrifugation gewinnen. Den Zellpellet in fünf Milliliter Medium resuspendieren und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder vorsichtiges Vortexen gut mischen.Verwenden Sie anschließend eine 10-Mikroliter-Probe, um lebensfähige Zellen mit Trypanblau zu zählen. Geben Sie nun 4 Millionen INOF-Zellen in das Medium, das bereits in die mit Poly-Hema beschichtete Platte pipettiert wurde. Ergänzen Sie das Kulturmedium auf ein Volumen von 20 Millilitern und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Überwachen Sie die zelluläre Aggregation zu multizellulären Steroiden mittels Phasenkontrastmikroskopie, um die S-Sphäroidkulturen alle zwei bis drei Tage erneut zu versorgen. Stellen Sie die Platten schräg auf eine Pipette. Lassen Sie die Sphäroide absinken und entfernen Sie vorsichtig etwa 16 Milliliter des erschöpften Mediums mit einer 5-Milliliter-Pipette.Geben Sie 16 Milliliter frisches Medium zur Kultur hinzu und kehren Sie am siebten Tag in den Inkubator zurück. Erstellen Sie heterotypische Kulturen, indem Sie epitheliale Zellen zu den Fibroblasten phe hinzufügen. Bereiten Sie zunächst Suspensionen von ovariellen epithelialen Zellen durch Trypsin wie zuvor nach der Zellzählung beschrieben vor.Einmal mit INOF-GM-Medium waschen, um sicherzustellen, dass keine Wachstumsfaktoren aus dem epithelialen Wachstumsmedium übertragen werden. Nach dem Erneuern des Mediums der Fibroblasten-OID-Kulturen die epithelialen Zellen im Verhältnis von vier Fibroblasten zu einer epithelialen Zelle hinzufügen. Die heterotopen OIDs in INOF GM werden typischerweise alle zwei bis drei Tage umgefrischt und weitere 14 Tage kultiviert.Bei der Immunhistochemie fixieren Sie das PHE mit neutral gepuffertem Formalin, pelletieren das PHE und ersetzen das Formalin durch 70 % Ethanol. Fahren Sie fort, indem Sie das Material gemäß Standardprotokollen für humanes Gewebe in Paraffin einbetten. In Paraffin eingebettete Steroide können geschnitten und mit H und E oder spezifischen molekularen Markern mittels Immunhistochemie gefärbt werden.Alternativ waschen Sie die Steroide in PBS und fixieren Sie sie in 4 % Paraformaldehyd. Anschließend werden die Proben in OCT-Medium eingebettet und schnell eingefroren, um Schnitte im Kryostaten herzustellen und immunfluoreszenzfärbungen für die Analyse per Durchflusszytometrie durchzuführen. Waschen Sie die Steroide in PBS und lösen Sie sie durch Trypsin- oder Accutase-Digestion bei 37 Grad Celsius auf.Die vollständige Dissoziation von Steroiden in eine Einzelzell-Suspension kann durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren der Lösung mit einer 1-mL-Pipettenspitze gefördert werden. Achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stark zu belasten. Neutralisieren Sie die Reaktion mit einem gleichen Volumen an Kulturmedium und entfernen Sie Zellklumpen, indem Sie die Suspension durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von 40 bis 70 µm geben. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert, mit PBS gewaschen, die gewünschte Anzahl an Zellen in FACS-Puffer resuspendiert und gemäß den Herstelleranweisungen gefärbt. In unserem Labor haben wir partiell transformierte ovarielle Epithelzellen hergestellt und diese mit normalen sowie seneszenten ovariellen Fibroblasten kultiviert, um die Entwicklung eines Ovarialkarzinoms im Frühstadium nachzuahmen.In einer prämenopausalen Ovar-Immunfluoreszenzfärbung zeigen h hert immortalisierte normale ovarielle Fibroblasten, dass sowohl primäre normale ovarielle Fibroblasten als auch immortalisierte normale ovarielle Fibroblasten das fibroblastenspezifische Protein exprimieren, jedoch weder Zytokeratin sieben noch Menton exprimieren. Normale ovarielle Fibroblastenzellen, allein in 3D-kultiviert mit PHE, weisen eine spindelförmige Morphologie und eine reichliche extrazelluläre Matrix auf. Hier wurden normale ovarielle Fibroblasten sieben Tage lang Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um Seneszenz hervorzurufen, und anschließend 14 Tage lang gemeinsam mit teilweise transformierten ovariellen Epithelzellen kultiviert.Um die beiden Zelltypen zu unterscheiden, wurden die resultierenden Steroide immunhistochemisch mit Mim-1 als Proliferationsmarker und Panzytokeratin als epithelialem Marker gefärbt. Die Quantifizierung der Daten legt nahe, dass die alternde Mikroumgebung neoplastische Merkmale teilweise transformierter epithelialer Zellen fördert, während eine normale Mikroumgebung das neoplastische Fortschreiten hemmt. Histologische Merkmale von normalen und malignen Zellen, die nicht nachweisbar sind, wenn die Zellen als Monolayer kultiviert werden, werden wiederhergestellt. Wenn die Zellen beispielsweise in eine Sphäroidkultur überführt werden, können histologische Merkmale von klarzelligem Ovarialkarzinom in 3D-Kulturen von klarzelligem Ovarialkarzinom-Zelllinien nachgewiesen werden, nicht jedoch in Monolayer-Kulturen derselben Zellen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale typische Kulturen einrichtet, um die Wechselwirkungen zwischen epithelialen und stromalen Zellen während der frühen Tumorgenese zu untersuchen. Bei der Einrichtung einer 3D-Kultur ist es wichtig, die Zellzahlen entsprechend der nachgeschalteten Anwendung anzupassen, wobei ein gewisser Materialverlust während der Aufarbeitung berücksichtigt werden sollte.Wenn einmal beherrscht, können 3D-Kulturen innerhalb einer Stunde nach dieser Anleitung eingerichtet werden. Andere Methoden wie die Durchflusszytometrie in Kombination mit der Genexpressions-Mikroarray-Profilierung können durchgeführt werden, um die globalen Genexpressionsänderungen zu analysieren, die in 3D-typischen Kulturen auftreten, jedoch unter Monolayer-Kulturbedingungen nicht nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die Aufklärung der bidirektionalen Signalwege, die spezifisch unter einem 3D-Kernkultur-Mikroumfeld auftreten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Mesothelzellen-Clearance-Test hier beschriebenen nutzt die Vorteile der fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Video-Mikroskopie zu visualisieren und quantitativ zu messen die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Test modelliert die frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

In diesem Video demonstrieren wir die Entwicklung eines in vitro dreidimensionalen Modells der Auskleidung der Bauchhöhle. Diese organotypische Kultur kann helfen, die Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen zu untersuchen.

Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion eines dreidimensionalen in vitro Modells der Auskleidung der Bauchhöhle, bestehend aus primären menschlichen Mesothelzellen und Fibroblasten, die mit extrazellulärer Matrix überlagert sind, als Werkzeug zur Untersuchung der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen.

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung von 3D-Brustkrebs-Surrogaten, die mit einem Perfusionsbioreaktorsystem kultiviert werden können, um Sauerstoff und Nährstoffe zu liefern. Nach dem Wachstum werden Surrogate fixiert und zu Paraffin verarbeitet, um die interessierenden Parameter zu bewerten. Die Auswertung eines solchen Parameters, der Zelldichte, wird erläutert.

Herstellung und Analyse von<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates

ovarian Tumorprogression in einem physiologisch relevanten Modell, mehrzelligen Sphäroiden wurden in einem Mikroeinrichtung unter simulierten Fluidstrom zu studieren. Diese dynamische 3D-Modell emuliert die intraperitoneale Umgebung mit den zellulären und mechanischen Komponenten, bei denen Ovarialkarzinom Metastasen auftreten.

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSC) sind verantwortlich für Krebsentstehung, Rezidiv, therapeutische Resistenz und Metastasen. Es wird angenommen, dass die OCSC-Gefäßnische die Selbsterneuerung von OCSCs fördert, was zu Chemoresistenz führt. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für die Etablierung eines reproduzierbaren OCSC-Gefäßnischenmodells in vitro.

Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

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Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Mausmodellen (HGSOC) in vitro und in vivo. Von der Gewinnung von murinen Eileiter-Organoiden über ihre genetische Modifikation zur Rekapitulation der menschlichen HGSOC-Genetik bis hin zu ihrer Einführung in den Eierstockschleimbeutel syngener Mäuse für die in vivo-Entwicklung von Tumoren.

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Heterotypische Dreidimensionale

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