Name: Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Knochenmarktransplantation zur Untersuchung von Colitis bei Mäusen mittels Dextran-Sulfat-Induktion und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Mechanismen bei entzündlichen Darmerkrankungen.

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Diese Arbeit wurde von Pilot-und Machbarkeitsstudie Zuschuss von UCLA-CURE Center, der Morbus Crohn und Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) und National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) Mittel zur Hon Wai Koon finanziert. Knochenmark Bestrahlung Operation wurde von Bernard Levin und Scott Kitchen of UCLA Center for AIDS Research Maus / Human Chimera Core-Anlage unterstützt. Durchflusszytometrie Operation wurde von UCLA Vector Core-Anlage unterstützt.

Ein. Before-you-Start Technische Überlegungen <ol><li> Wir empfehlen die Verwendung sowohl C57/BL6 Wildtyp-Mäusen und-Knockout-Mäusen für das Experiment, weil Mäuse mit entsprechenden CD-Moleküle von den großen Maus-Anbieter erworben werden kann. </li><li> Da es schwierig ist, die Wildtyp-Mäusen und Knockout-Mäusen gewonnen Spenderzellen nach Knochenmarktransplantation zu verfolgen, ist es notwendig, CD45.1 Mäuse verwenden, um Wildtyp-Mäusen darstellen. (CD45.1 C57/SJL WT Mäusen Jackson Laboratories stock # 002014). </li><li> Die meisten Mauskolonien sind CD45.2. Unsere Knockout-Mäuse gehören CD45.2 Genotyp (alternativ ein CD45.2 WT Mäusen Quelle: Jackson Laboratories stock # 000664). Die Bestimmung der CD45.1 oder CD45.2 Genotyp kann mit Durchflusszytometrie von Knochenmark und peripheren Blut, wie in Abschnitt 7 in diesem Protokoll erwähnt werden. </li><li> Mäuse nach der Bestrahlung wurden Immunität beeinträchtigt. Halten Mäuse in pathogenfreien Einrichtung. </li><li> Betrieb der Strahler erfordert besondere Sicherheit clearance und Ausbildung. Um Zeit im Training und Genehmigungsprozesse zu sparen, ist es am besten mit einem Labor mit qualifizierten Techniker in der Lage, um die Strahler bedienen ist zusammenzuarbeiten. </li><li> Viele Institutionen haben Durchflusszytometrie Labors mit erfahrenen Technikern. Um Probleme mit der Durchflusszytometrie zu minimieren, ist es besser, Ihre Durchflusszytometrie Experiment Plan mit dem erfahrenen Techniker besprechen, bevor Sie beginnen. </li><li> Mäuse wurden auf diese Weise (10 Mäuse pro Gruppe) zugeordnet: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Gruppe </td><td></td><td> Knochenmark Spender zum Empfänger </td><td> Behandlung </td></tr><tr><td> A </td><td> BM Austausch </td><td> CD45.1 WT CD45.2 KO </td><td> DSS Kolitis </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr><tr><td> C </td><td> BM Austausch </td><td> CD45.2 KO CD45.1 WT </td><td> DSS ulcerosa </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr><tr><td> E </td><td> Schein </td><td> CD45.1 WT CD45.1 WT </td><td> DSS Kolitis </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr><tr><td> G </td><td> Schein </td><td> CD45.2 KO CD45.2 KO </td><td> DSS Kolitis </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr></tbody></table> * Eine kurze Darstellung Versuchsprotokoll ist in Abbildung 1 gezeigt. 2. Empfängermäuse Bestrahlung <ol><li> Mäuse gezüchtet und gehalten Erreger-einrichtung. Ort Mäuse in autoklavierten Bestrahlung pie mit Filter. Legen Sie eine Maus in jedem Steckplatz der Bestrahlung pie. Setzen Sie den Kuchen in den Strahler und vergewissern Sie sich die Drehscheibe und Kuchen drehen. </li><li> Schalten Sie die Luftpumpefür die Belüftung. Schließen Sie den Strahler Tür und verriegeln Sie ihn. </li><li> Bestrahlen der Mäuse mit 1000 rad (was äquivalent zu 10 Gy) etwa 10 min (je nach Strahlungsquelle und Halbwertszeit). Von diesem Zeitpunkt sind die bestrahlten Mäusen immunschwache und schwach Immunität gegen Infektion. Nach der Bestrahlung, nehmen Sie den Kuchen aus und legen Sie in einem sterilen Behälter für den Transport zum Biosicherheitswerkbank in Tierhaltung. Vermeiden Sie es, die Mäuse zu externen Umfeld Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu minimieren. </li><li> In Biosicherheitswerkbank, übertragen Sie die Mäuse in autoklavierten Mäusekäfige mit autoklaviertem Betten (4 Mäuse pro Käfig Neuen steriles Wasser mit sulfatrim Federung -. 3,12 ml pro 100 ml Wasser). </li><li> Wickeln Sie die Wasserflasche mit Aluminiumfolie als die Antibiotika lichtempfindlich sind. Schütteln Sie die sulfatrim Flasche mit gut mischen, bevor Sie ihn in den Käfig. </li></ol> 3. Spender-Knochenmark Extraction <ol><li> Opfern Mäusen mit Kohlendioxid oder isoflurANCE und dann eintauchen in 1:200 Lysol Lösung. Sprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol, um die Haut befeuchten und zu sezieren offenen Knochen. </li><li> Weichen Sie die Dissektion Instrumente in 70% Ethanol für die Sterilisation. </li><li> Führen Sie die Dissektion in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Verwenden Sie die sterile Präparation Instrumente, um die Humerus, Femur, Tibia und Fibula Knochen, frei von Befestigung Muskeln und Bänder aussetzen. </li><li> Schneiden Sie beide Enden der Knochen, die rote Knochenmark zeigen. Halten die Knochen mit einer Pinzette. Spülen Sie das rote Knochenmark mit kaltem PBS mit 3 ml Spritze und 25G Nadeln in eine Petrischale. Spülen von beiden Enden der Knochen mehr Knochenmarkszellen ergeben. </li><li> Verwenden Sie 6 ml Spritzen und 18G1 / 2 Nadeln rotes Knochenmark Stecker durch wiederholtes Aufsaugen und brechen. Übertragen Knochenmark mit 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie das Knochenmark in 1.800 rpm für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, Pellet resuspendieren durch Vortexen für 5-10 sec. </li><li> Verdünnte 10X RBC Lysepuffer mit sterilem Wasser. Anzeiged 1X RBC-Lyse-Puffer (5 ml pro Donor-Maus), Wirbel wieder für 5 sec und halten genau 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 3 min, füllen Sie die Röhrchen mit 20 ml kaltem PBS, um die Lyse und mischen zu stoppen. Gießen Sie den Inhalt durch ein 40 um Zellsieb direkt in ein neues 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Spülen Sie die Original-Röhren mit 5 ml PBS und Transfer zum Zellsieb als gut. Anfang bis zu 50 ml mit PBS und mischen. </li></ol> 4. Zählen Bone Marrow Donor Cells <ol><li> Fügen Sie 100 ul Trypanblau in ein Eppendorf-Röhrchen und 100 ul des Knochenmarks Suspension auf einem Eppendorf-Röhrchen und mischen. Pipettieren Sie die gefärbte Zelle Mischung auf eine Zählkammer. </li><li> Die Menge der Zellen wird durch Gesamtwohnfläche Knochenmark Zellzahl im Falconröhrchen = ungefärbten Zellzahl in 16 Quadrate x 2 (aufgrund Trypanblau Verdünnung) x 10.000 x 50 ml berechnet </li><li> Abzentrifugieren der Knochenmarkzellen in 50 ml Falcon-Röhrchen bei 2.000 UpM für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Basierendauf die gesamten Zellzahlen, das Pellet mit PBS auf 1 x 10 8 Zellen pro ml </li></ol> 5. Infusion Empfängermäuse <ol><li> Wärmen Sie die Empfänger-Mäuse auf einem Heizkissen und unter einer Wärmelampe. Legen Sie die Empfänger-Mäuse in restrainer. Jeweils 1 x 10 7 Zellen pro Maus in 100-200 ul intravenös. </li><li> Die Injektion von Spender-Knochenmark muss zwischen 4-24 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt werden. </li><li> Halten Sie sich auf 4 injizierten Mäusen pro Käfig. Pflegen Sie die injiziert Empfängermäuse in autoklavierten Käfige mit Antibiotika behandelte Wasser für die ersten 4 Wochen in pathogenfreien Tierhaltung und ließ die Mäuse wieder Immunität. Veränderung Käfigen, Antibiotika-behandelten Wasser und Nahrung alle 4 Tage auf Hygiene zu halten. </li></ol> 6. Induktion von Colitis und Evaluierung von Colitis <ol><li> 4 Wochen nach der Bestrahlung und Knochenmarktransplantation, regelmäßig Wasser zu wechseln, ohne Antibiotika und halten die Mäuse für weitere 2 Wochen zu ihrer normalen zurückgewinnenDarmflora. </li><li> 6 Wochen nach der Knochenmark-Injektion zu messen ursprünglichen Körpergewichts. Einige Mäuse sind 5% Dextransulfat im Trinkwasser ad libitum zu Colitis induziert gegeben. Einige Mäuse werden regelmäßig Trinkwasser nur als normale Kontrollgruppe gegeben. </li><li> 5 Tage später, zurückzutreten peripheren Blut, Transfer zum Heparin-beschichteten Röhrchen (Vacutainer) und halten im Eis. Pool das Blut aus 4 Mäusen 1 Tube. Kombinieren Sie 300 ul Blut mit 300 ul Zellfärbung buffer = 600 ul. Teilen Sie das Blut bis 5 Eppendorf-Röhrchen mit jeweils 100 ul. </li><li> Opfern die Mäuse mit Kohlendioxid oder Isofluran. Bewerten makroskopischen Schäden Noten (siehe anderen JOVE Video Veröffentlichung für Details 1). Messen Veränderung des Körpergewichts. Measure Darm Länge und Dicke mit digitalen Messschieber. Beachten Hocker Textur (hart, weich oder blutig). Bestimmen Sie auf okkultes Blut im Stuhl mit Hemooccult. Dissect Doppelpunkt Gewebe und fixieren Formalin für H &amp; E-Färbung. </li><li> Dissect 1 Femur bone pro Maus, extrahieren Knochenmark und spülen das Knochenmark mit kaltem PBS über 25G Nadel und 1 ml Spritze. Pool 4 Knochenmark-Stecker an ein Rohr und halten im Eis. </li><li> Gießen Sie das Knochenmark zur Petrischale, Scher das Knochenmark Stecker mit 18G Nadel und 5 ml Spritze mehrmals, bis kein Knochenmark-Stecker vorhanden ist. </li><li> Spin down mit 1.500 rpm für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren mit 600 ul Zellfärbung Puffer. Teilen Sie die resuspendierten Knochenmark 5 Eppendorf-Röhrchen mit jeweils 100 ul. </li></ol> 7. Quality Inspection of Bone Marrow Transplantation mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Beschriften Sie jedes Probenröhrchen von Blut oder Knochenmark # 1-5: </li><li> Vorbereiten der Antikörpermischung für jede jeweilige Rohr in der Dunkelheit. </li></ol> Nr. 1 Kein Antikörper # 2 30 ul FITC Isotypenkontrolle + 30 ul PE Isotypenkontrolle + 15 ul CD16/32 Blockierung # 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung # 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung # 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung <table border="1"><tbody><tr><td> Fügen Sie nichts zu Blut oder Knochenmark Probe Nr. 1 </td></tr><tr><td> Add 5 ul Antikörper Mischung Nr. 2 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 2 </td></tr><tr><td> Add 3 ul Antikörper Mischung # 3 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 3 </td></tr><tr><td> Add 3 ul Antikörper Mischung # 4 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 4 </td></tr><tr><td> Add 5 ul Antikörper Mischung Nr. 5 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Halten Sie im Dunkeln in Eis für 30 min. </li><li> 2 ml 1X RBC Lysepuffer in jedes Röhrchen. Halten Sie im Dunkeln auf Eis für 15 min. </li><li> Abzentrifugieren der Zellen bei 1500 rpm, 5 min bei 4 ° C. (GH 3,8 Rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Überstand entfernen. Das Pellet mit 500 ul Zell-Färbepuffer bei Dunkelheit, dann Wirbel kurzzeitig. </li&gt; <li> Überprüfen Sie die CD45.1 (entspricht WT) und CD45.2 (die KO) in der immungefärbten Blut und Knochenmark-Proben mittels Durchflusszytometrie. Wählen FITC zu WT CD45.1 und PE darstellen KO CD45.2 darstellen. </li><li> Analysieren Sie die Durchflusszytometrie Ergebnisse FlowJo Software. Berechnen Sie das Verhältnis von FITC: PE-Verhältnis oder PE: FITC-Verhältnis zu ermitteln, ob Donorgenotyp dominanten Genotypen in Blut und Knochenmark. </li></ol>

<ol><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).</li>
<li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li>
<li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice%3A+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li>
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<li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow-derived+monocytes%2Fmacrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and%2For+anticancer+drugs+in+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145(2010).</li>
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<li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14%2B+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li>
<li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li>
<li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP%28%2B%29+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Knochenmarktransplantation Ansatz ist geeignet für immunologische Forschung von Colitis, Infektionen, Krebs, Fettleibigkeit und andere Krankheiten. Dieses Experiment Knochenmarktransplantation ist erforderlich, wenn das Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammen und nicht-Knochenmark stammende Zellen und das Gen-von-Interesse vermutet wird, um Krankheiten durch Zellen aus entweder Population vermitteln exprimiert wird. Zum Beispiel wird gezeigt, antimikrobiellen Peptids Cathelizidin zu modulieren akute Koliti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Zelle Färbepuffer </td><td> BioLegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X RBC Lysispuffer </td><td> BioLegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC Maus Isotyp-Kontrolle </td><td> BioLegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE Maus Isotyp-Kontrolle </td><td> BioLegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE-anti-Maus CD45.2 </td><td> BioLegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC-Anti-Maus CD45.1 </td><td> BioLegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD16/32 blockieren </td><td> BioLegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (Fischer) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Scientific </td><td> NC9745686 (Fischer) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Maus restrainer </td><td> Braintree Scientific </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> JL Shepherd and Associates </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer Reagenzglas </td><td> Falke </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Digitaler Messschieber </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult ICT </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

differenziert functional roles of gene expression von immun-und nicht-immunzellen in mouse colitis von bone marrow transplantation

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Um die Rolle von einem Gen in der Entwicklung einer Kolitis verstehen, verglichen wir die Antworten von Wildtyp-Mäusen und Gen-von-Interesse-defizienten Knockout-Mäuse zu ulcerosa. Wenn die Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen des Wirts exprimiert wird, jedoch ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse in Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark differenzieren abgeleiteten Zellen durch Knochenmarktransplantation Technik. Um das Knochenmark stammende Zellen Genotyps von Mäusen zu verändern, wurden die ursprünglichen Knochenmark des Empfängers Mäusen durch Bestrahlung zerstört und dann durch neue Spender-Knochenmark verschiedener Genotypen ersetzt. Wenn Wildtyp-Mäusen Spender-Knochenmark, um Knockout-Mäuse transplantiert wurde, konnten wir erzeugen knockout Mäuse mit Wildtyp-Gen-Expression in Knochenmark stammende Zellen. Alternativ wurde bei Knockout-Mäusen Spender-Knochenmark zu Wildtyp-Empfängermäuse, Wildtyp-Mäusen ohne Gen-of-interest Ausdruck transplantiertaus Knochenmark stammenden Zellen produziert wurden. Allerdings kann eine Knochenmarktransplantation nicht 100% abgeschlossen. Daher verwendeten wir cluster of differentiation (CD) Moleküle (CD45.1 und CD45.2) als Marker von Spender und Empfänger-Zellen, den Anteil der Spender-Knochenmark-abgeleiteten Zellen in Empfängermäuse und der Erfolg der Knochenmarktransplantation verfolgen. Wildtyp-Mäuse mit CD45.1 Genotyp und Knockout-Mäusen mit CD45.2 Genotyps verwendet wurden. Nach der Bestrahlung des Empfängers Mäusen wurden die Donor Knochenmarkzellen von unterschiedlichen Genotypen in die Empfänger-Mäuse infundiert. Wenn der neue Knochenmark zu übernehmen ihre Immunität regeneriert wurden die Mäuse durch chemische Mittel (Dextran Natriumsulfat, 5% DSS) herausgefordert, Kolitis zu induzieren. Hier zeigten auch die Methode ulcerosa in Mäusen zu induzieren und zu bewerten, die Rolle des Gens von Interesse aus dem Knochenmark stammenden Zellen exprimiert. Wenn die Gen-von-Interesse aus den Knochen abgeleiteten Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Erkrankung (z. B. colitis) kann der Phänotyp der Empfängermäuse mit Knochenmarktransplantation signifikant verändert werden. Am Ende der Colitis Experimenten abgeleitete das Knochenmark Zellen in Blut und Knochenmark mit Antikörper wurden gegen CD45.1 und CD45.2 bezeichnet und deren Mengenverhältnis der Existenz könnte verwendet werden, um den Erfolg der Knochenmarktransplantation mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Erfolgreiche Knochenmarktransplantation sollte eine überwiegende Mehrheit der Donorgenotyp (in der Bezeichnung des CD-Molekül Marker) über Empfänger Genotyp sowohl im Knochenmark und Blut des Empfängers Mäusen.

Wenn das Gen-of-Interest spielt eine bedeutende Rolle in Immunzellen bei der Entwicklung ulcerosa, Empfangen die Mäuse Knochenmark von unterschiedlichen Genotyp durch Knochenmarktransplantation (WT KO oder KO zu WT) sollte eine veränderte Reaktion auf DSS Kolitis. Einer der wichtigsten Parameter zur Bestimmung der Schwere von ulcerosa ist die H &amp; E-Färbung der Colon-Geweben. Colongewebe Struktur ändert und Entzündungszeichen kann quantitativ durch H &amp; E Histologie Scoring-System ausgewertet werden. Kriterien für...

Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Um die Rolle eines Gens bei der Entstehung einer Colitis zu verstehen, haben wir die Reaktionen von Wildtyp-Mäusen und Gen-defizienten Knockout-Mäusen verglichen ...

Das übergeordnete Ziel des in diesem Video gezeigten Experiments besteht darin, zu untersuchen, ob das antimikrobielle Peptid Lyin eine Rolle bei der Verbesserung der durch Dextransulfat induzierten Kolitis bei Mäusen spielt. Dies wird erreicht, indem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen in bestrahlte licit- und Knockout-Mäuse sowie Knochenmark von Knockout-Mäusen in bestrahlte Wildtyp-Mäuse injiziert wird. Das transplantierte Knochenmark wird im Empfänger neue Blutzellen des Spender-Genotyps bilden.Die Empfänger-Mäuse werden dann vier Wochen lang Dextran-Sulfat ausgesetzt, um eine Kolitis zu induzieren. Die erfolgreiche Transplantation wird mittels Durchflusszytometrie überprüft, und die Schädigung des kolorektalen Gewebes wird histologisch beurteilt. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Kolitis abgeschwächt wird, wenn Wildtyp-Knochenmark in Knockout-Mäuse transplantiert wird.Umgekehrt verschlimmert sich die Kolitis, wenn knock-ausgeschlagenes Knochenmark in Wildtyp-Mäuse transplantiert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Bestimmung der Genexpressionen aus Knochenmark-abstammenden oder nicht aus Knochenmark abstammenden Zellen bei Entzündungen oder Infektionen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Bestimmung Donorzelle Transplantation stellt eine Herausforderung in der Maus Knochenmarktransplantation Modelle, die gut definierte phänotypische Marker fehlen. Wir beschrieben eine Methode zur männlichen Spenders Engraftment bei weiblichen Transplantatempfängers Mäusen zu quantifizieren. Dieses Verfahren kann in allen Mausstämmen zur Untersuchung von HSC-Funktionen verwendet werden.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Dieser Artikel wird detailliert die Verfahren zur Messung der Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Knochenmarktransplantation zur Untersuchung von Colitis bei Mäusen mittels Dextran-Sulfat-Induktion und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Mechanismen bei entzündlichen Darmerkrankungen.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation (Video) | JoVE Journal

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

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