Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Das übergeordnete Ziel des in diesem Video gezeigten Experiments ist es, zu beurteilen, ob das antimikrobielle Peptid Lyin eine Rolle bei der Verbesserung der Dextransulfat-induzierten Kolitis bei Mäusen spielt. Dies wird durch die Injektion von Knochenmark von Wildtyp-Mäusen in bestrahlte legale und Knockout-Mäuse und Knochenmark von Knockout-Mäusen in bestrahlte Wildtyp-Mäuse erreicht. Das transplantierte Knochenmark erzeugt neue Blutzellen beim Empfänger des Spendergenotyps.

Die Empfängermäuse werden dann Dextransulfat ausgesetzt, um nach vier Wochen eine Kolitis auszulösen. Die erfolgreiche Transplantation wird durch Durchflusszytometrie validiert und die Schädigung des Dickdarmgewebes durch Histologie beurteilt. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass Colitis gebessert wird, wenn Wildtyp-Knochenmark in Knockout-Mäuse transplantiert wird.

Umgekehrt verschlimmert sich die Kolitis, wenn knockout-Knochenmark in Wildtyp-Mäuse transplantiert wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Bestimmung der Genexpression von Knochenmarkzellen oder nicht aus Knochenmark gewonnenen Zellen bei Entzündungen oder Infektionen zu beantworten. Für dieses Experiment werden C 57-, Black-Six-, Wildtyp- und C-induzierte Knockout-Mäuse empfohlen, um die Verfolgung der Wildtyp-Mäuse und Knockout-Mäuse zu ermöglichen.

Spenderzellen nach Knochenmarktransplantation. Verwenden Sie CD 45.1-Mäuse, um Wildtyp-Mäuse darzustellen, und CD 45.2 für die Knockout-Mäuse. Die hier gezeigte Grafik beschreibt den Versuchsaufbau: Jeder Gruppe werden fünf Spendermäuse und 10 Empfängermäuse zugeordnet.

Für die Gruppen A und B wird Knochenmark von den Wildtyp-Mäusen auf die Knockout-Mäuse transplantiert. Kolitis wird in Gruppe A induziert, aber nicht in Gruppe B.Für Gruppe C und D.Knochenmark wird von den Knockout-Mäusen in den Wildtyp transplantiert, und Colitis wird in Gruppe C nur für E und F induziert.Die Transplantation erfolgt vom Wildtyp zum Wildtyp und für die Gruppen G und H. Die Transplantation erfolgt von Knockout zu Knockout. Um Spenderknochenmark für den Transfer auf bestrahlte Mäuse vorzubereiten, beginnen Sie mit der Extraktion von Knochenmark aus den Knochen geopferter Mäuse in einer Biosicherheitswerkbank.

Verwenden Sie sterile Präparierinstrumente, um den Oberarmknochen, den Oberschenkelknochen, die Tibia und die Wadenbeinknochen von anhaftenden Muskeln und Bändern freizulegen und in eine Petrischale zu übertragen. Schneide beide Enden der Knochen auf, um das rote Knochenmark zu sehen. Dann griff er mit einer Zange nach einem der Knochen.

Spülen Sie das rote Knochenmark mit kaltem PBS mit einer Drei-Milliliter-Spritze und 25-Gauge-Nadeln in eine andere Petrischale. Spülen Sie dann den Knochen vom anderen Ende aus, um mehr Knochenmarkzellen zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit jedem der Knochen.

Das Knochenmark des Wildtyps zusammenlegen und Mäuse separat ausschalten. Verwenden Sie eine Sechs-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel von einem halben Zoll, um rote Knochenmarkpfropfen durch wiederholtes Ansaugen und Ausstoßen zu brechen. Anschließend wird das entnommene Knochenmark mit einer serologischen Pipette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Sobald das gesamte Knochenmark übertragen wurde, schleudern Sie das Knochenmark fünf Minuten lang bei 740 g bei vier Grad Celsius nach unten. Entsorgen Sie nach dem Schleudern den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es fünf bis 10 Sekunden lang vortexen. Geben Sie dem Pellet erneut fünf Milliliter eines XRBC-Lysepuffers pro Spendermaus-Vortex für fünf Sekunden und inkubieren Sie genau drei Minuten bei Raumtemperatur.

Geben Sie nach drei Minuten 20 Milliliter kaltes PBS in jedes Röhrchen und mischen Sie es durch Inversion, um die Lyse zu stoppen. Gießen Sie dann den Inhalt durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das Originalröhrchen mit fünf Millilitern PBS und geben Sie die Lösung in das Zellsieb.

Sammeln Sie den Durchfluss weiter in dem konischen Rohr. Dann das Volumen mit PBS auf 50 Milliliter bringen und durch Inversion mischen. Bestimmen Sie anschließend die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trianblau-Ausschluss mit einem Hämozytometer.

Ist die Zellzahl bestimmt, schleudern Sie die Knochenmarkzellen bei 913 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand basierend auf der Gesamtzahl der Zellen. Reanimation suspendieren Sie das Pellet in PBS bei einmal 10 bis zu den achten Zellen pro Milliliter.

Die Knochenmarkzellen sind nun bereit für den Transfer in bestrahlte Empfängermäuse. Die Empfänger-Wildtyp- und Knockout-Mäuse für dieses Experiment wurden mit 1000 rad bestrahlt, wie im Begleitdokument beschrieben, die Mäuse werden gezüchtet und vier bis 24 Stunden nach der Bestrahlung in einer pathogenfreien Anlage untergebracht. Die Empfängermäuse wurden auf einem Heizkissen unter einer Wärmelampe erwärmt, um das Spenderknochenmark zu injizieren. Legen Sie eine Empfängermaus in einen Fixierbehälter, wischen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol ab, um die Injektionsstelle zu sterilisieren und die lokale Vasodilatation für eine einfache Injektion zu fördern.

Injizieren Sie nach der Injektion mit einer Insulinspritze mit einer 28,5-Gauge-Nadel einmal 10 bis 10 an die siebten Zellen in einem bis 200 Mikrolitern in die Schwanzvene jeder Maus. Setzen Sie die Maus in den ersten vier Wochen nach der Injektion mit bis zu drei anderen injizierten Mäusen in einen Käfig. Halten Sie die injizierten Empfängermäuse in Autoklavenkäfigen mit Wasser, das das Antibiotikum Sulfa-Trim enthält.

Dies gibt den Tieren Zeit, ihre Immunität wiederzuerlangen, alle vier Tage die Käfige, das mit Antibiotika behandelte Wasser und das Futter zu wechseln, um die Hygiene aufrechtzuerhalten. Wechseln Sie vier Wochen nach der Bestrahlung und Knochenmarktransplantation zu normalem Wasser ohne Antibiotika und halten Sie die Mäuse zwei weitere Wochen lang, um ihre normale Darmflora wiederzuerlangen. Sechs Wochen nach der Knochenmarkinjektion ist das Anfangskörpergewicht zu messen, um eine Kolitis auszulösen.

Geben Sie den Mäusen in der Colitis-Versuchsgruppe 5%Dextransulfat ins Trinkwasser. Fünf Tage später wird das periphere Blut von vier Mäusen in einem mit Vacutainer Heparin beschichteten Röhrchen zusammengefasst und auf Eis gelegt. Kombinieren Sie dann in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 300 Mikroliter Blut mit 300 Mikrolitern Zellfärbung, puffern und aliquotieren Sie das Blut in fünf Durchflusszytometrie-Reagenzgläser, die mit jeweils 100 Mikrolitern auf Eis beschriftet sind.

Nachdem Sie die Mäuse geopfert haben, messen Sie erneut das Körpergewicht und berechnen Sie die Veränderung. Präparieren Sie Dickdarmgewebe und dosieren Sie es in Formalin für die h- und d-Färbung. Dann erhalten Sie wie bisher Knochenmarkzellen.

Teilen Sie das resuspendierte Knochenmark in fünf Mikrozentrifugenröhrchen auf, die mit je 100 Millilitern beschriftet sind. Zur Vorbereitung der Analyse mittels Durchflusszytometrie ist das Antikörpergemisch für jedes jeweilige Röhrchen im Dunkeln vorzubereiten, wie im Begleitdokument beschrieben, Blut- und Knochenmarkproben mit der Bezeichnung Nummer eins dienen als Kontrollen und werden nicht als Blut- und Knochenmarkproben gefärbt. Die Bezeichnung Nummer zwei wird mit fitzy isotype control, PE isotype control und CD 16 slash 32 blocking solution gefärbt.

Diese Isotypkontrollen werden verwendet, um die Spezifität von primären Antikörperbindungsproben zu bestätigen. Die Bezeichnung Nummer drei wird mit FZ CD 45.1 und CD 16 Schrägstrich 32 befleckt. Blockierungslösungsproben mit der Bezeichnung Nummer vier werden mit CD 45.2 und CD 16 Schrägstrich 32 gefärbt.

Blockierende Lösung. Eine einfarbige Markierung kann das Vorhandensein von Spender- oder Empfängerzellen im Blut oder Knochenmark anzeigen. Es ist klar, dass Samples mit der Bezeichnung Nummer fünf für CD 45.1, CD 45.2 und CD 16 Schrägstrich 32 gefärbt werden.

Blockierend hierbei zeigt die zweifarbige Markierung das relative Verhältnis von Spender- und Empfängerzellen im Blut oder Knochenmark. Geben Sie fünf Mikroliter der Antikörpermischung zwei und fünf in die jeweiligen Probenröhrchen. Geben Sie dann drei Mikroliter der Antikörpermischung drei und vier in die jeweiligen Probenröhrchen.

Inkubieren Sie alle Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis. Geben Sie nach der Inkubation zwei Milliliter und einen XRBC-Lysepuffer in jedes Röhrchen. Dann inkubieren Sie die Proben weitere 15 Minuten auf Eis im Dunkeln.

Schleudern Sie die Zellen bei 350 Mal G herunter, fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern Zellfärbepuffer im Dunkeln. Dann kurz vortexen.

Führen Sie anschließend eine Durchflusszytometrie an den Blut- und Knochenmarkproben der Immunfärbemittel durch. Wählen Sie FZ aus, um den Wildtyp CD 45.1 darzustellen, und PE, um den Knockout-CD 45.2 darzustellen. Analysieren Sie die Ergebnisse der Durchflusszytometrie mit der Software von Flo Joe.

Berechnen Sie das Verhältnis von Fit E zu PE oder von PE zu Fit e, um zu bestimmen, ob der Spendergenotyp ein dominanter Genotyp in Blut und Knochenmark ist. Dieses Bild zeigt Beispielbilder von h und e von Dickdarm mit normaler Histologie und DSS-Kolitis. Die histologischen Bilder werden auf der Grundlage der Schädigung des Schleimhautgewebes und der Infiltration von Neutrophilen in das Schleimhaut- und Submukosalgewebe bewertet.

Ein höherer histologischer Score deutet also auf eine schwerere Kolitis hin, um zu testen, ob Lyin eine Rolle bei der Vorbeugung von Kolitis spielt. Knochenmark wurde zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen ausgetauscht, wie in diesem Video beschrieben. Anschließend wurde die Histologie ausgewertet und bewertet, wie hier gezeigt.

Die Histologie-Scores waren signifikant erhöht, wenn Knockout-Mausknochenmark in bestrahlte Wildtyp-Mäuse eingeführt wurde. Umgekehrt waren die Scores signifikant niedriger, wenn Wildtyp-Knochenmark in Knockout-Mäuse eingeführt wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass endogenes C aus Knochenmarkzellen entzündungshemmend wirkt und die Kolitis lindert, um zu bestätigen, dass die Transplantation bei diesen Mäusen erfolgreich war.

Die Durchflusszytometrie wurde auch an Knochenmark und Blut der Mäuse nach der Transplantation durchgeführt. Wildtyp-Knochenmark färbt stark auf Fitz CD 45.1, aber nicht auf PE, CD 45.2 wie hier gezeigt, Knockout-Knochenmark färbt stark auf PE, aber nicht auf Fitz, wie hier gezeigt. Nach der Transplantation waren jedoch sowohl das Knochenmark als auch das Blut von Wildtyp-Mäusen, die Knockout-Knochenmark erhielten, stark für PE, aber nicht für Fitz gefärbt, was darauf hindeutet, dass die überwiegende Population der gefärbten Zellen vom Spender stammte.

Ebenso färbten sich Knochenmark und Blut von Knockout-Mäusen, die Wildtyp-Knochenmark erhielten, stark auf Fitzy, aber nicht wieder auf PE, was bestätigt, dass die vorherrschenden gefärbten Populationen von Spendern stammten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ein Knochenmarktransplantationsexperiment durchzuführen und Kolitis über aus dem Knochenmark gewonnene Zellen zu modifizieren.