Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Das übergeordnete Ziel des in diesem Video gezeigten Experiments besteht darin, zu untersuchen, ob das antimikrobielle Peptid Lyin eine Rolle bei der Verbesserung der durch Dextransulfat induzierten Kolitis bei Mäusen spielt. Dies wird erreicht, indem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen in bestrahlte licit- und Knockout-Mäuse sowie Knochenmark von Knockout-Mäusen in bestrahlte Wildtyp-Mäuse injiziert wird. Das transplantierte Knochenmark wird im Empfänger neue Blutzellen des Spender-Genotyps bilden.

Die Empfänger-Mäuse werden dann vier Wochen lang Dextran-Sulfat ausgesetzt, um eine Kolitis zu induzieren. Die erfolgreiche Transplantation wird mittels Durchflusszytometrie überprüft, und die Schädigung des kolorektalen Gewebes wird histologisch beurteilt. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Kolitis abgeschwächt wird, wenn Wildtyp-Knochenmark in Knockout-Mäuse transplantiert wird.

Umgekehrt verschlimmert sich die Kolitis, wenn knock-ausgeschlagenes Knochenmark in Wildtyp-Mäuse transplantiert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Bestimmung der Genexpressionen aus Knochenmark-abstammenden oder nicht aus Knochenmark abstammenden Zellen bei Entzündungen oder Infektionen zu beantworten. Für dieses Experiment werden C57, black six, Wildtyp- und C-aktivierter Knockout-Mäuse empfohlen, um eine Unterscheidung zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen zu ermöglichen.

Donorzellen nach Knochenmarktransplantation. Verwenden Sie CD 45.1-Mäuse, um Wildtyp-Mäuse darzustellen, und CD 45.2-Mäuse für die Knockout-Mäuse. Das hier gezeigte Diagramm beschreibt den experimentellen Aufbau: fünf Donor-Mäuse und zehn Empfänger-Mäuse werden jeder Gruppe zugewiesen.

Für die Gruppen A und B wird das Knochenmark von Wildtyp-Mäusen auf Knockout-Mäuse transplantiert. Bei Gruppe A wird Kolitis induziert, bei Gruppe B hingegen nicht. Für die Gruppen C und D erfolgt die Transplantation des Knochenmarks von Knockout-Mäusen auf Wildtyp-Mäuse, wobei Kolitis nur bei Gruppe C induziert wird. Für die Gruppen E und F erfolgt die Transplantation von Wildtyp auf Wildtyp, und für die Gruppen G und H erfolgt die Transplantation von Knockout auf Knockout. Um das Spenderknochenmark für die Übertragung auf bestrahlte Mäuse vorzubereiten, beginnen Sie mit der Extraktion des Knochenmarks aus den Knochen geopferter Mäuse in einem Biosafety-Schrank.

Verwenden Sie sterile chirurgische Instrumente, um die Knochen des Humerus, Femur, Tibia und Fibula von anhängenden Muskeln und Bändern zu befreien, und überführen Sie sie in eine Petrischale. Schneiden Sie beide Enden der Knochen auf, um das rote Knochenmark freizulegen. Halten Sie dann einen der Knochen mit einer Pinzette fest.

Spülen Sie das rote Knochenmark mit kaltem PBS unter Verwendung einer Dreimilliliter-Spritze und 25-Gauge-Nadeln in eine andere Petrischale aus. Spülen Sie dann den Knochen von der anderen Seite aus, um weitere Knochenmarkzellen zu gewinnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit jedem der Knochen.

Vereinigen Sie das Knochenmark von Wildtyp- und Knockout-Mäusen separat. Zerstören Sie mithilfe einer sechs Milliliter fassenden Spritze mit einer 18-Gauge-einhalb-Zoll-Nadel wiederholt rote Knochenmarkpfropfen durch mehrfaches Aufsaugen und Ausstoßen. Anschließend überführen Sie das gesammelte Knochenmark mit einer serologischen Pipette in ein 50-Milliliter-Kegelrohr.

Nachdem das gesamte Knochenmark übertragen wurde, zentrifugieren Sie das Knochenmark fünf Minuten lang bei 740 G und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet durch Vortexen für fünf bis 10 Sekunden. Geben Sie zum Pellet fünf Milliliter eines XRBC-Lysepuffers pro Spendermaus hinzu, vortexen Sie erneut für fünf Sekunden und inkubieren Sie genau drei Minuten bei Raumtemperatur.

Nach drei Minuten 20 Milliliter kalte PBS zu jedem Röhrchen hinzufügen und durch Vorsichtiges Umstülpen mischen, um die Lyse zu stoppen. Anschließend den Inhalt durch ein 40-Mikrometer-Zellfilter in ein neues 50-Milliliter-Konischrohr gießen. Das ursprüngliche Röhrchen mit fünf Milliliter PBS ausspülen und die Lösung auf den Zellfilter übertragen.

Fortsetzen des Sammelns des Durchflusses im kegelförmigen Reagenzglas. Dann das Volumen mit PBS auf 50 Milliliter auffüllen und durch Inversion mischen. Anschließend die Anzahl lebensfähiger Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss und eines Hämozytometers bestimmen.

Nach der Bestimmung der Zellanzahl die Knochenmarkzellen bei 913 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstandsvolumen entsprechend der Gesamtzellzahl entfernen. Den Zellpellet in PBS resuspendieren, mit einer Konzentration von einer mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter.

Die Knochenmarkzellen sind nun bereit zur Übertragung in bestrahlte Empfängermäuse. Die empfänglichen Wildtyp- und Knockout-Mäuse für dieses Experiment wurden wie im begleitenden Dokument beschrieben mit 1000 rad bestrahlt; die Tiere werden in einer pathogenfreien Anlage gehalten und vier bis 24 Stunden nach der Bestrahlung zum Einspritzen des Spenderknochenmarks auf einer Heizplatte unter einer Wärmelampe erwärmt. Platzieren Sie eine Empfängertmaus in einer Fixiervorrichtung, wischen Sie den Schwanz mit 70 %igem Ethanol ab, um die Injektionsstelle zu sterilisieren und eine lokale Vasodilatation zur Erleichterung der Injektion zu fördern.

Unter Verwendung einer Insulinspritze mit einer Nadel der Stärke 28,5 werden je Maus ein mal 10 hoch 7 Zellen in einem Volumen von 1 bis 200 µL in die Schwanzvene injiziert. Die Maus wird zusammen mit bis zu drei weiteren injizierten Mäusen in eine Käfiggruppe für die ersten vier Wochen nach der Injektion gestellt. Die injizierten Empfängermäuse werden in Autoklaviertierkäfigen gehalten und erhalten Wasser, das das Antibiotikum Sulfa-Trim enthält.

Dies gewährt Zeit, damit die Tiere ihre Immunität wiedererlangen, die Käfige gewechselt werden und alle vier Tage antibiotikabehandeltes Wasser und Futter verabreicht werden, um die Hygiene aufrechtzuerhalten. Vier Wochen nach Bestrahlung und Knochenmarktransplantation auf normales Wasser ohne Antibiotika umstellen und die Mäuse weitere zwei Wochen lang pflegen, damit sie ihre normale Darmflora wiederherstellen können. Sechs Wochen nach der Knochenmarkinjektion das anfängliche Körpergewicht messen, um Kolitis zu induzieren.

Verabreichen Sie den Mäusen in der Colitis-Experimentgruppe 5 % Dextran Sulfat im Trinkwasser. Fünf Tage später sammeln Sie das periphere Blut von vier Mäusen in vakuumversiegelten Röhrchen mit Heparin-Beschichtung und stellen es auf Eis. Anschließend geben Sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 300 Mikroliter Blut und 300 Mikroliter Zellfärbepuffer und portionieren das Blut auf fünf Durchflusszytometrie-Röhrchen, die von eins bis fünf nummeriert sind, jeweils mit 100 Mikrolitern auf Eis.

Nach der Tötung der Mäuse erneut das Körpergewicht messen und die Veränderung berechnen. Kolon-Gewebe sezieren und zur H- und D-Färbung in Formalin legen. Anschließend wie zuvor Knochenmarkszellen gewinnen.

Teilen Sie das resuspendierte Knochenmark in fünf Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils mit 100 Millilitern beschriftet sind, nummeriert von eins bis fünf. Bereiten Sie zur Vorbereitung der Analyse per Durchflusszytometrie die Antikörperlösungsmischung für jedes entsprechende Röhrchen im Dunkeln gemäß dem beigefügten Dokument vor. Die als Nummer eins gekennzeichneten Blut- und Knochenmarkproben dienen als Kontrollen und werden nicht angefärbt. Die als Nummer zwei gekennzeichneten Blut- und Knochenmarkproben werden mit FITC-Isotypkontrolle, PE-Isotypkontrolle und CD16/32-Blockierungslösung gefärbt.

Diese Isotypkontrollen werden verwendet, um die Spezifität der Bindung der primären Antikörper an die Proben zu bestätigen. Die mit Nummer drei gekennzeichneten Proben werden mit FZ CD 45.1 und CD 16/32 gefärbt. Die mit Nummer vier gekennzeichneten Proben mit Blockierungslösung werden mit CD 45.2 und CD 16/32 gefärbt.

Blockierungslösung. Die Einfarbfärbung kann das Vorhandensein von Spender- oder Empfängerzellen im Blut oder Knochenmark nachweisen. Eindeutig werden die als Nummer fünf gekennzeichneten Proben für CD 45.1, CD 45.2 und CD 16/32 gefärbt.

Die hier blockierte zweifarbige Markierung zeigt das relative Verhältnis von Spender- und Empfängerzellen im Blut oder Knochenmark. Geben Sie fünf Mikroliter der Antikörpermischung zwei und fünf in die jeweiligen Probenröhrchen. Anschließend geben Sie drei Mikroliter der Antikörpermischung drei und vier in die jeweiligen Probenröhrchen.

Inkubieren Sie alle Röhrchen 30 Minuten auf Eis. Nach der Inkubation geben Sie zwei Milliliter eines XRBC-Lysepuffers zu jedem Röhrchen hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Proben weitere 15 Minuten auf Eis im Dunkeln.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 500 µL Zellfärbepuffer im Dunkeln. Anschließend kurz verwirbeln.

Führen Sie anschließend eine Durchflusszytometrie an den immungefärbten Blut- und Knochenmarkproben durch. Wählen Sie FZ, um den Wildtyp CD 45.1 darzustellen, und PE, um den Knockout CD 45.2 darzustellen. Analysieren Sie die Durchflusszytometrie-Ergebnisse mit der Software von Flo Joe.

Berechnen Sie das Verhältnis von fit E zum PE-Verhältnis oder des PE-zu-fit-E-Verhältnisses, um zu bestimmen, ob das Donorgenotyp der dominante Genotyp im Blut und Knochenmark ist. Diese Abbildung zeigt Beispiel-H-und-E-Bilder von Kolons mit normaler Histologie und DSS-Colitis. Die Histologiebilder werden anhand des Schadens des Mukosagewebes und der Infiltration von Neutrophilen in das Mukosa- und Submukosagewebe bewertet.

Daher deutet eine höhere Histologiepunktzahl auf eine schwerwiegendere Kolitis hin, um zu testen, ob Lyin eine Rolle bei der Verhinderung von Kolitis spielt. Das Knochenmark wurde zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen ausgetauscht, wie in diesem Video beschrieben. Anschließend wurde die Histologie bewertet und wie hier gezeigt punktiert.

Die Histologie-Scores waren signifikant erhöht, wenn Knochenmark von Knockout-Mäusen in bestrahlte Wildtyp-Mäuse übertragen wurde. Umgekehrt waren die Scores signifikant vermindert, wenn Wildtyp-Knochenmark in Knockout-Mäuse übertragen wurde. Diese Daten zeigen, dass endogenes C aus Knochenmark-abstammenden Zellen entzündungshemmende Wirkungen hat und die Kolitis lindert, um zu bestätigen, dass die Transplantation bei diesen Mäusen erfolgreich war.

Die Durchflusszytometrie wurde ebenfalls an Knochenmark und Blut der Mäuse nach der Transplantation durchgeführt. Wildtyp-Knochenmark färbt stark für Fitz CD 45.1, jedoch nicht für PE, CD 45.2, wie hier gezeigt. Knockout-Knochenmark dagegen färbt stark für PE, jedoch nicht für Fitz, wie hier dargestellt. Nach der Transplantation färbten jedoch sowohl Knochenmark als auch Blut von Wildtyp-Mäusen, die Knockout-Knochenmark erhalten hatten, stark für PE, aber nicht für Fitz, was darauf hinweist, dass die vorherrschende Population der gefärbten Zellen vom Spender stammte.

Ebenso färbten sich Knochenmark und Blut von Knockout-Mäusen, die Wildtyp-Knochenmark erhalten hatten, stark für Fitzy, jedoch nicht für Pe, was erneut bestätigt, dass die hauptsächlich gefärbten Populationen donoraler Herkunft waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ein Knochenmarktransplantationsexperiment durchzuführen und Colitis mithilfe von Knochenmark-abstammenden Zellen zu modifizieren.